マサチューセッツ総合病院、A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging、放射線科のBruce Fischl氏に、この研究で分析されたヒト脳標本を提供していただいたことに感謝します。本プロジェクトは、欧州連合(EU)のホライズン2020研究・イノベーションフレームワークプログラム(Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme)から助成金契約第654148号(Laserlab-Europe)、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation(研究・イノベーションのためのホライズン2020フレームワークプログラム)から特定助成契約第785907号(Human Brain Project SGA2)および第945539号(Human Brain Project SGA3)から、米国国立衛生研究所総合病院コーポレーションセンター(National Institutes of Health)から助成金U01 MH117023で資金提供を受けました。 Euro-Bioimaging Italian Node(ESFRI研究インフラストラクチャ)の枠組みにおけるイタリア教育省から。最後に、この研究は「Fondazione CR Firenze」の協力を得て行われました。この作業の内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

ホルマリン固定ヒト組織サンプルは、マサチューセッツ総合病院(MGH)剖検サービス(米国ボストン)の神経病理学部門から提供されました。Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC、プロトコル2003P001937)からIRBが承認した組織収集プロトコルに従って、死亡前に健康な参加者から書面による同意が得られました。承認文書は、米国マサチューセッツ州ボストンのMGH剖検サービスに保管されており、リクエストに応じて入手できます。
1. アガロース包埋とサンプル切断
<ol><li>ビーカー内の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)中の4%w/vアガロース溶液を調製し、組織ブロックを内部に埋め込みます。室温(RT)に達するまで待ってから、4°Cで24時間保存します。</li>
	<li>高精度の切片を得るには、サンプルをビブラトームの検体ディスクに接着し、トレイに冷たい1x PBS(pH 7.4)を充填します。スライスする組織の種類に応じて、周波数、振幅、速度などのビブラトームパラメータを調整します(使用される値:周波数 = 5 (50 Hz)、振幅 = 0.4、速度 = 3 (0.15 mm/s)。 注:サンプル量に応じて異なるビブラトームを使用する必要があります。最大容量が70 x 40 x 15 mmのサンプルには、ビブラトーム(Leica VT1000 Sなど)を使用できます。より大きなサンプルには、圧縮トーム(VF-900-0Zミクロトーム18など)またはカスタムメイドの装置21を使用することが可能です。ここでは、400μmまたは500μmの厚さでカットされたスライスを紹介します。</li>
	<li>切断後、すべてのスライスを0.01% w/vアジ化ナトリウム(NaN3)を含む1x PBS(pH 7.4)からなる保存液に入れ、4°Cで保存します。 注:包埋する前に、アガロース溶液が37°Cに達するまで待ってください。 温度が高くなると、試験片が損傷する可能性があります。長時間の固定は、抗原を損傷し、組織の自家蛍光を増加させることにより、標識手順に支障をきたす可能性があるため、サンプルをPFAに48時間以上放置しないことをお勧めします。ヒト組織の長期保存には、微生物汚染を防ぐためにNaN3 を含むPBSが使用されます。NaN3は毒性があるため、薬品フードの下で予備液を調製してください。</li>
</ol>2. 組織固定
注:以下のプロトコルで使用されるすべての溶液は、同じ組織ブロックのすべてのスライスを処理し、技術的なばらつきを最小限に抑え、個々のステップの時間を短縮するのに十分な量で調製されています。
<ol><li>50% v/v 1x PBS pH 3、25% v/v 0.1 M 塩酸(HCl)、25% v/v 0.1 M フタル酸水素カリウム(KHP)、および新鮮な 4% v/v グルタルアルデヒドでスイッチオフ溶液を調製します。すべてのサンプルをスクリュー蓋付きのディッシュ(70 x 23 mm)に入れ、スイッチオフ溶液と一緒に4°Cで1日間穏やかに振とうしながらインキュベートし、アルミホイルで光から保護します。</li>
	<li>1x PBS(pH 7.4)と新鮮な1% v/vグルタルアルデヒドでスイッチオン溶液を調製します。すべてのサンプルを新しいディッシュに入れ、スイッチオン溶液と一緒に4°Cで1日間穏やかに振とうしながらインキュベートし、アルミホイルで光から保護します。 注意: グルタルアルデヒドは毒性が高く、光に敏感であるため、スイッチオフ溶液とスイッチオン溶液の両方を常に新鮮に調製し、氷上の化学フードの下に保管する必要があります。常に皿に各溶液20 mLを入れ、パラフィルムで密封します。</li>
</ol>3. 無効化と消込
注:サンプル中の反応性グルタルアルデヒドは、1x PBS pH 7.4、4% w/v アセトアミド、4% w/v グリシン、pH 9.0からなる不活化溶液とインキュベーションして不活化する必要があります。溶液は4°Cで最大3ヶ月間保存できます。脂質を除去して組織を透明にするために、200 mMのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20 mMの亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)、および20 mMのホウ酸(H3BO3)、pH 9.0からなる透明化溶液を使用します。SDSは4°Cで沈殿するため、溶液は室温で保存する必要があります。 以下のすべてのステップは、溶液で満たされたチューブで行われます。
<ol><li>サンプルを皿からチューブに移し、1x PBS pH 7.4、室温で穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄します。 注意: ステップ3.1では、グルタルアルデヒドの毒性があるため、化学フードの下で作業する必要があります。アセトアミド、SDS、ホウ酸も有毒な試薬であり、薬品フードの下で取り扱う必要があります。チューブに必ず50 mLの各溶液を入れてください。</li>
	<li>サンプルを不活化溶液中で37°Cのウォーターバス中で一晩インキュベートします(o/n)。</li>
	<li>穏やかに振とうしながら、室温で1x PBS pH 7.4で3 x 2時間洗浄します。</li>
	<li>サンプルを55°Cの透明溶液中でウォーターバス中で3〜7日間インキュベートします。溶液は 2 日ごとに交換してください(表 1)。</li>
</ol>4. 免疫標識
注:標識ステップの前に、残留SDSを除去し、自家蛍光を低減し、10 mMトリス塩基、1 mM EDTA、および0.05% v/v Tween 20、pH 9からなる抗原賦活化溶液でエピトープをマスク解除する必要があります。溶液のpH 9 は、効率的な回収プロセスのために最適化されています。トリス塩基は緩衝剤として機能し、安定したpH環境を維持します。キレート剤であるEDTAは、抗原のアクセシビリティを高めます。非イオン性界面活性剤Tween 20は、組織の透過性を改善するのに役立ちます。この溶液は4°Cで保存できます。 過酸化水素と抗原賦活化ステップを組み合わせると、非特異的なバックグラウンドシグナルの原因となる内因性蛍光色素(リポフスチンなど)を分解および/または修飾することにより、自家蛍光シグナルを低減する相乗効果があることに注意することが重要です。
<ol><li>0.1% v/v Triton X-100(PBST)でPBSを1個調製し、37°Cに予熱し、インキュベーター内で37°Cで穏やかに振とうしながら、日中に3 x 3時間サンプルを洗浄します。最後の洗浄はそのままにしておきます。 注:PBSTストック溶液は4°Cで保存してください。 SDSは低温で不溶性の沈殿物を形成し、その後の取得プロセスに干渉する可能性があるため、組織からSDSを除去することが重要です。</li>
	<li>翌日、各サンプルに10 mLの30% v/v過酸化水素(H2O2)を加え、室温で45分間穏やかに振とうします。</li>
	<li>室温で穏やかに振とうしながら、1x PBS(pH 7.4)で 3 x 10 分間洗浄します。</li>
	<li>抗原賦活化溶液をウォーターバス中で95°Cに予熱します。サンプルを加熱した溶液に移し、95°Cで10分間放置します。</li>
	<li>試験片を穏やかに振とうしながら40分間室温まで冷却します。</li>
	<li>軽く振とうしながら、脱イオン水で3 x 5分間洗浄します。</li>
	<li>サンプルをPBS中で4°Cで15分間平衡化します。</li>
	<li>0.01% w/v NaN3 のPBST製の新しい抗体溶液を調製し(ステップ1.3については注を参照)、一次抗体を添加します。サンプルをスクリュー蓋付きのディッシュに入れ、37°Cのインキュベーターで穏やかに振とうし、光から保護してn日間(1〜7)インキュベーターでインキュベートします(表2)。 注:インキュベーション時間はサイズと厚さによって異なります(表1および表2)。</li>
	<li>n日後、サンプルをチューブに移し、インキュベーター内で穏やかに振とうしながら、37°Cで予熱したPBSTで3 x 2時間洗浄します。</li>
	<li>0.01% w/v NaN3 のPBSTに二次抗体を添加し、サンプルをスクリュー蓋付きの新しいディッシュに入れ、37°Cでn日間(1-6)、穏やかに振とうし、光から保護したインキュベーターでインキュベートします(表1および表2)。</li>
	<li>n日後、サンプルをチューブに移し、穏やかに振とうするインキュベーターで37°Cに予熱したPBSTで日中に3 x 3時間洗浄します。最後の洗浄はそのままにしておきます。 注意: Triton X-100およびTween 20は粘性があるため、ゆっくりとピペットで操作してチップを充填してください。チューブに必ず50 mLの各溶液を入れてください。各サンプルに10 mLの抗体溶液を使用し、溶液の蒸発を防ぐためにパラフィルムでディッシュを密封します。抗体溶液にはNaN 3が含まれているため、 4°Cで保存し、2週間以内に新しい検体に再使用して標識することができます。</li>
</ol>5. 屈折率マッチング
注:高いレベルの透明性を実現するには、組織の屈折率を均質化する必要があります。ここでは、1x PBSで希釈した2,2'-チオジエタノール(TDE)を使用します。TDE ソリューションは RT に保存する必要があります。
<ol><li>サンプルを新しいディッシュに移し、30% v/v TDEを添加し、室温で穏やかに振とうしながら4時間放置します。</li>
	<li>30% v/v TDE 溶液を除去し、68% v/v TDE をサンプルに添加し、室温で穏やかに振とうします。 注意: TDEは粘性があるため、ゆっくりとピペットで操作してチップを充填します。TDE蒸気またはミストを吸入すると、呼吸器系を刺激する可能性があります。したがって、曝露を最小限に抑えるために、換気の良い場所で作業するか、ドラフトを使用することをお勧めします。TDE 溶液は RT で保存する必要があります。 各サンプルに 10 mL の TDE 溶液を使用します。</li>
</ol>6. サンプルの取り付け
注:サンプルの取り付けとLSFM画像の取得を容易にするために、顕微鏡スライド、スペーサー、カバーガラスの3つの部分で構成されるカスタムメイドの密閉型サンプルホルダー(「サンドイッチ」と呼ばれる)を使用しています。
<ol><li>スチールスペーサー(56 x 56 x 0.5 mm3)を顕微鏡スライド(60 x 60 x 1 mm3)の上に置き、サンプルを顕微鏡スライドに置きます。</li>
	<li>石英カバーガラス(60 x 60 x 0.5 mm3)を慎重に置き、すべてをクリップで留め、1:1の比率で2成分のシリコン接着剤を準備します。屈折率を一致させるために石英カバーガラスを使用し、取得プロセス中の光学収差を低減します。</li>
	<li>1 mLのシリンジを使用して、スペーサーとカバーガラスの間のスペースを2液シリコン接着剤で満たし、10分間乾燥させます。</li>
	<li>クリップを取り外し、小さな針を使用して、サンドイッチ全体を68%v/v TDEでゆっくりと満たします。</li>
	<li>新鮮な接着剤を作り、サンドイッチを密封します。 注意: 手順6.1でTDEが誤ってスペーサーに到達した場合、接着剤は硬化しません。手順6.2で気泡が発生しないことを確認してください。</li>
</ol>7. ストリッピング
注:SHORTの構造保存とエピトープへのアクセス性の向上により、抗体を除去し、サンプルを他のマーカーで再染色することにより、スライスのマルチラウンドラベリングが可能になります。
<ol><li>ブレードでサンドイッチを開き、30% v/v TDEで満たされたスクリュー蓋付きの新しい皿に試験片を入れ、3時間放置します。</li>
	<li>サンプルをチューブに移し、室温で1x PBS(pH 7.4)で穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄し、最後の洗浄はそのままにしておきます。</li>
	<li>サンプルを清澄溶液に浸し、80°Cのウォーターバスに4時間入れます。</li>
	<li>1x PBST(pH 7.4)で37°C、穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄し、最後の洗浄はそのままにしておきます。これで、サンプルをステップ4.8から再度ラベル付けする準備が整いました。 注意: チューブには必ず50 mLの各溶液を充填してください。各サンプルに 10 mL の TDE 溶液を使用します。</li>
</ol>

SHORTとLSFMによるヒト脳の高解像度3次元再構成

<ol>
	<li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues:+review.">In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Ueda, H. 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(16), 1060405 (2022).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).</li></ol>

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

ヒトの脳の大きな領域の高解像度イメージングと3D再構成には、機械的組織切片作成とそれに続く光学的透明化と単一スライスの免疫標識が必要です。ここに示されるプロトコルは短いティッシュの変形方法がLSFMの細胞内決断の3D頭脳の再建のための多数の人間の頭脳の厚いセクションの急速で、同時処理に使用することができる方法を記述する。
他のアプローチとは異...

ヒトの脳の大量の3D分子組織と細胞構造を解析するには、検体の光学的透明性が必要であり、処理時間の長いプロトコルによって達成されます。組織内の屈折率(RI)の不均一性を最小限に抑えるために光学透明化技術が開発され、それによって光の散乱を低減し、高解像度イメージングのための光の浸透深さを増加させました1,2,3,4,5。透明化および深部組織標識法の現在の進歩により、最先端の顕微鏡技術を活用することにより、無傷のげっ歯類の臓器および胚の体積イメージングが可能になります6,7,8,9,10,11,12。
しかし、死後の人間の脳の広い領域の体積3D再構成は、モデル生物と比較して依然として困難な課題です。複雑な生物学的組成とさまざまな死後の固定および保存条件は、組織の透明化効率、抗体の浸透深さ、およびエピトープ認識を損なう可能性があります13、14、15、16、17、18、19。さらに、モデル生物と比較して、大きなヒトの脳領域の効率的な透明化と均一な標識を達成するためには、機械的組織切片とそれに続く各スライスの透明化と標識が依然として必要であり、その結果、処理時間が長くなり、高度なカスタム機器が必要になります15,20,21,22。
SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化 - TDE (SHORT) 組織形質転換技術は、ヒトの脳の大量の分析に特化して開発された18,23。この方法では、SWITCHプロトコル11の組織構造保存と高濃度の過酸化水素を使用して、エピトープ修復と組み合わせて組織の自家蛍光を減少させます。SHORTは、異なるニューロンサブタイプ、グリア細胞、血管系、および有髄線維のマーカーを用いて、ヒトの脳スライスを均一に染色することを可能にします18,24。その結果は、低密度および高密度タンパク質の両方の分析に適合します。得られた高い透明性レベルと均一な標識により、蛍光顕微鏡法による厚切りの体積再構成が可能になり、特に、高速取得ライトシート装置18、24、25、26、27を使用することができる。
この研究では、SHORT組織形質転換技術を使用して、ホルマリン固定された数十のヒト脳切片の同時透明化とマルチラウンドラベリングを行う方法について説明します。4つの異なる蛍光マーカーを併用することで、異なる細胞亜集団を同定することができます。クリアリング後、蛍光顕微鏡で高分解能の体積イメージングを行うことができます。ここでは、カスタムメイドの逆LSFM 18,24,25,26,27を使用し、サンプルの高速光学セクショニングと複数のチャンネルの並列取得を可能にしました。この日常的にハイスループットプロトコルにより、ブローカの領域全体のマッピングですでに実証されているように、人間の脳の広い領域の細胞内分解能で包括的な細胞および構造特性評価を得ることができます23。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-thiodiethanol</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamide &#62;= 99.0% (GC)</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressome VF-900-0Z Microtome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>LaserOptex</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC_29096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator ISS-4075</td>
			<td>Lab companion&#160;</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Attak</td>
			<td>Henkel Italia srl</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Laborchimica</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer saline tablet</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent Twinsil</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13005002</td>
			<td>out of production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phtalate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P1088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfite</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Microlaser srl</td>
			<td></td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputum Containers (dishes with screw lids)</td>
			<td>Paul Boettger GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>07.061.2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>PanReac AppliChem (ITW reagents)</td>
			<td>A4577,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62 547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-545-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-605-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin antibody (PV)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32895</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calretinin Polyclonal antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>12278_1_AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175700</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150107</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568) preadsorbed</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175475</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150169</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175711</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab194324</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin Antibody YC7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47706</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasoactive intestinal peptide (VIP)</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>16233-1-AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and labeling for light-sheet fluorescence microscopy in large-scale human brain imaging

過去10年間に数多くの透明化技術が登場したにもかかわらず、死後の人間の脳の処理は、その寸法と複雑さのために依然として困難な作業であり、マイクロメートルの解像度でのイメージングを特に困難にしています。この論文では、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)によるサンプルの透明化、ラベリング、およびシーケンシャルイメージングを可能にするSHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-チオジエタノール[TDE])組織形質転換プロトコルで数十のセクションを同時に処理することにより、ヒト脳の体積部分の再構築を行うプロトコルを紹介します。SHORTは、複数のニューロンマーカーを含む厚いスライスの迅速な組織透明化と均質なマルチラベリングを提供し、白質と灰白質の両方で異なるニューロン亜集団の同定を可能にします。クリア後、スライスはLSFMを介してマイクロメートルの解像度で複数のチャンネルで同時にイメージングされ、迅速な3D再構成が可能です。ルーチンのハイスループットプロトコル内でSHORTとLSFM解析を組み合わせることにより、広い体積領域の3D細胞構造再構成を短時間で高解像度で取得することができ、ヒト脳の包括的な構造特性評価が可能になります。

Analyzing the 3D molecular organization and cytoarchitecture of large volumes of the human brain requires optical transparency of specimens, achieved through protocols with extensive processing time. Optical clearing techniques were developed to minimize heterogeneity in refractive index (RI) within the tissues, thereby reducing light scattering and increasing the light penetration depth for high-resolution imaging1,2,3,4,5. Current advances in clearing and deep tissue-labeling methods allow volumetric imaging of intact rodent organs and embryos by exploiting cutting-edge microscopy techniques6,7,8,9,10,11,12.
However, volumetric 3D reconstruction of large areas of the postmortem human brain still represents a challenging task compared with model organisms. The complex biological composition and the variable postmortem fixation and storage conditions can compromise the tissue clearing efficiency, the antibody penetration depth, and the epitope recognition13,14,15,16,17,18,19. Moreover, mechanical tissue sectioning and subsequent clearing and labeling of each slice is still required to achieve an efficient clearing and uniform labeling of large human brain areas, resulting in long processing times and the need for sophisticated custom equipment,&#160;compared with model organisms15,20,21,22.
The SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) tissue transformation technique has been developed specifically to analyze large volumes of the human brain18,23. This method employs the tissue structural preservation of the SWITCH protocol11 and high concentrations of peroxide hydrogen to decrease tissue autofluorescence, in combination with epitope restoration. SHORT allows uniform staining of human brain slices with markers for different neuronal subtypes, glial cells, vasculature, and myelinated fibers18,24. Its results are compatible with the analysis of both low- and high-density proteins. The resulting high transparency levels and uniform labeling enable volumetric reconstruction of thick slices with fluorescence microscopy, in particular, for fast acquisition light-sheet apparatus can be used18,24,25,26,27.
In this work, we describe how the SHORT tissue transformation technique can be used for simultaneous clearing and multi-round labeling of tens of formalin-fixed human brain sections. Four different fluorescent markers can be used together, leading to the identification of different cellular sub-populations. After clearing, high-resolution volumetric imaging can be performed with fluorescence microscopy. Here, we used a custom-made inverted LSFM18,24,25,26,27, which enables fast optical sectioning of the sample and rapid acquisition of multiple channels in parallel. With this routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain a comprehensive cellular and structural characterization with a sub-cellular resolution of large areas of the human brain as already demonstrated in the mapping of an entire Broca&#39;s area23.

著者スポットライト:3D細胞構造解析の進歩 - ヒト脳の迅速な体積再構成 

大規模ヒト脳イメージングにおけるライトシート蛍光顕微鏡のための光学的透明化と標識

The human brain is a complex organ spanning different skills. To understand its functionality, it's essential to construct a detailed cell sensors across the whole brain. Our routinely high-throughput protocol permits the analysis of 3D cytoarchitecture of volumetric areas of the human brain with micrometer resolution, enabling its structural characterization.Volumetric reconstruction of large areas of the human brain presents several experimental challenges linked to the massive dimensions of brain samples, the complex biological composition, the variable postmortem fixation and storage conditions, and the autofluorescent signals from lipofuscin-type pigments. All these can compromise the optical clearing efficiency and demonstrating quality. Compared to other clearing techniques, the short tissue transformation method combined with light sheet microscopy imaging can be used for rapid and simultaneous processing of multiple human brain sections.These result in 3D brain reconstruction with a subcellular resolution.

ここで説明するプロトコルは、SHORT法を使用して、厚さ100μmから500μmの範囲の複数のスライスの同時処理を可能にします。このアプローチにより、手順全体の処理時間が大幅に短縮されます。この研究では、複数の死後ヒト脳厚切片を同時に処理するためのパイプライン全体(図1)を包括的に説明し、一度に24スライスのプロトコルを実証します(図2A...

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現在のプロトコルは(Sの魔女- H2O2 -抗原 Retrieval - 2,2' -チオジエタノール[TDE])の薄板の蛍光顕微鏡検査のイメージ投射と短いティッシュの変形の技術を日常的に高いスループットのプロトコルのイメージ投射と結合することによって多数の死後の人間の頭脳セクションの急速で、同時光学清算、多円形の分類および3D容積測定の復元のための段階的なプロシージャを提供する。

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its ...

人間の脳は、さまざまなスキルにまたがる複雑な器官です。その機能を理解するには、脳全体にわたる詳細な細胞センサーを構築することが不可欠です。当社の日常的なハイスループットプロトコルにより、ヒト脳の体積領域の3D細胞構造をマイクロメートルの分解能で解析することができ、その構造特性評価が可能になります。ヒトの脳の広い領域の体積再構成は、脳サンプルの巨大な寸法、複雑な生物学的組成、さまざまな死後の固定および保存条件、およびリポフスシン型色素からの自家蛍光シグナルに関連するいくつかの実験上の課題を提示します。これらはすべて、光学クリアリングの効率と品質の実証を損なう可能性があります。他の透明化技術と比較して、ライトシート顕微鏡イメージングと組み合わせた短組織形質転換法は、複数のヒト脳切片の迅速かつ同時処理に使用できます。これにより、細胞内分解能での脳の3D再構築が可能になります。

optical-clearing-labeling-for-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

1.3K ビュー.  University of Florence. 人間の脳は、さまざまなスキルにまたがる複雑な器官です。その機能を理解するには、脳全体にわたる詳細な細胞センサーを構築することが不可欠です。当社の日常的なハイスループットプロトコルにより、ヒト脳の体積領域の3D細胞構造をマイクロメートルの分解能で解析することができ、その構造特性評価が可能になります。ヒトの脳の広い領域の体積再構成?...