Wir danken Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radioology, für die Bereitstellung der in dieser Studie analysierten menschlichen Gehirnproben. Dieses Projekt wurde gefördert durch das Forschungs- und Innovationsrahmenprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 654148 (Laserlab-Europe), aus dem Horizon 2020-Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung und Innovation im Rahmen der spezifischen Finanzhilfevereinbarungen Nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) und Nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), vom General Hospital Corporation Center der National Institutes of Health unter der Fördernummer U01 MH117023, und vom italienischen Bildungsministerium im Rahmen des italienischen Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-Forschungsinfrastruktur). Schließlich wurde diese Forschung mit Unterstützung der "Fondazione CR Firenze" durchgeführt. Der Inhalt dieser Arbeit liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Formalinfixierte menschliche Gewebeproben wurden von der Abteilung für Neuropathologie des Autopsiedienstes des Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, USA) zur Verfügung gestellt. Die schriftliche Zustimmung der gesunden Teilnehmer wurde vor dem Tod gemäß den vom IRB genehmigten Gewebeentnahmeprotokollen des Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, Protokoll 2003P001937) eingeholt. Die Genehmigungsdokumente werden bei den MGH Autopsy Services in Boston, MA, USA, aufbewahrt und sind auf Anfrage erhältlich.
1. Agarose-Einbettung und Probenschneiden
<ol><li>Bereiten Sie eine 4%ige w/v-Agaroselösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in einem Becherglas vor und betten Sie den Gewebeblock darin ein. Warten Sie, bis es Raumtemperatur (RT) erreicht hat, und lagern Sie es dann 24 Stunden lang bei 4 °C.</li>
	<li>Um hochpräzise Schnitte zu erhalten, kleben Sie die Probe auf die Probenscheibe des Vibratoms und füllen Sie die Schale mit kaltem 1x PBS (pH 7,4). Passen Sie die Vibratomparameter wie Frequenz, Amplitude und Geschwindigkeit entsprechend der Art des zu schneidenden Gewebes an (verwendete Werte: Frequenz = 5 (50 Hz); Amplitude = 0,4; Geschwindigkeit = 3 (0,15 mm/s). HINWEIS: Je nach Probenvolumen sollten unterschiedliche Vibratome verwendet werden. Für Proben mit einem maximalen Volumen von 70 x 40 x 15 mm kann ein Vibratom (z.B. Leica VT1000 S) verwendet werden; Für größere Proben ist es möglich, ein Kompresstom (z. B. VF-900-0Z-Mikrotom18) oder eine speziell angefertigte Vorrichtung21 zu verwenden. Hier präsentieren wir Scheiben, die entweder mit einer Dicke von 400 μm oder 500 μm geschnitten wurden.</li>
	<li>Nach dem Schneiden alle Scheiben in eine Konservierungslösung aus 1x PBS (pH 7,4) mit 0,01 Gew.-% Natriumazid (NaN3) geben und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Warten Sie vor dem Einbetten, bis die Agaroselösung 37 °C erreicht hat. Eine höhere Temperatur kann die Probe beschädigen. Es wird empfohlen, die Proben nicht länger als 48 Stunden in PFA zu belassen, da eine längere Fixierung das Markierungsverfahren beeinträchtigen kann, indem sie Antigene schädigt und die Autofluoreszenz des Gewebes erhöht. Für die Langzeitlagerung von menschlichem Gewebe wird PBS mit NaN3 verwendet, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern. Aufgrund der Toxizität von NaN3 ist die Konservierungslösung unter einer chemischen Haube herzustellen.</li>
</ol>2. Fixierung des Gewebes
HINWEIS: Alle im folgenden Protokoll verwendeten Lösungen werden in großen Mengen hergestellt, die ausreichen, um alle Schichten desselben Gewebeblocks zu verarbeiten und die technische Variabilität zu minimieren und die Zeit für einzelne Schritte zu verkürzen.
<ol><li>Bereiten Sie die Abschaltlösung mit 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M Salzsäure (HCl), 25 % v/v 0,1 M Kaliumhydrogenphthalat (KHP) und frischem 4 % v/v Glutaraldehyd vor. Geben Sie alle Proben in Schalen mit Schraubdeckel (70 x 23 mm) und inkubieren Sie sie mit der Switch-off-Lösung mit leichtem Schütteln bei 4 °C für 1 Tag, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Einschaltlösung mit 1x PBS (pH 7,4) und frischem 1% v/v Glutaraldehyd zu. Geben Sie alle Proben in neue Schalen und inkubieren Sie sie mit der Switch-on-Lösung mit leichtem Schütteln bei 4 °C für 1 Tag, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht schützen. HINWEIS: Aufgrund der hohen Toxizität und Lichtempfindlichkeit von Glutaraldehyd müssen sowohl Abschalt- als auch Einschaltlösungen immer frisch zubereitet und unter der chemischen Haube auf Eis aufbewahrt werden. Füllen Sie die Schale immer mit 20 ml jeder Lösung und verschließen Sie sie mit Parafilm.</li>
</ol>3. Inaktivierung und Clearing
HINWEIS: Reaktives Glutaraldehyd in den Proben muss durch Inkubation mit einer Inaktivierungslösung inaktiviert werden, die aus 1x PBS pH 7,4, 4 % w/v Acetamid, 4 % w/v Glycin, pH 9,0 besteht. Die Lösung kann bei 4 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Um Lipide zu entfernen und das Gewebe transparent zu machen, verwenden wir die Clearing-Lösung, bestehend aus 200 mM Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM Natriumsulfit (Na2SO3) und 20 mM Borsäure (H3BO3), pH 9,0. Die Lösung muss bei RT gelagert werden, da SDS bei 4 °C ausfällt. Alle folgenden Schritte werden in Röhrchen durchgeführt, die mit der Lösung gefüllt sind.
<ol><li>Die Proben aus dem Geschirr in die Röhrchen geben und 3 x 2 h mit 1x PBS pH 7,4 bei RT in leichtem Schütteln waschen. HINWEIS: Für Schritt 3.1 ist es notwendig, aufgrund der Glutaraldehyd-Toxizität unter der chemischen Haube zu arbeiten. Paracetamid, SDS und Borsäure sind ebenfalls toxische Reagenzien und müssen unter einer chemischen Haube gehandhabt werden. Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung.</li>
	<li>Die Proben werden in einer Inaktivierungslösung bei 37 °C in einem Wasserbad über Nacht (o/n) inkubiert.</li>
	<li>3 x 2 h in 1x PBS pH 7,4 bei RT unter leichtem Schütteln waschen.</li>
	<li>Die Proben werden in einer Reinigungslösung bei 55 °C im Wasserbad für 3-7 Tage inkubiert. Wechseln Sie die Lösung alle 2 Tage (Tabelle 1).</li>
</ol>4. Immunmarkierung
HINWEIS: Vor dem Markierungsschritt ist es notwendig, das restliche Sicherheitsdatenblatt zu entfernen, die Autofluoreszenz zu reduzieren und die Epitope mit einer Antigen-Rückgewinnungslösung zu demaskieren, die aus 10 mM Trisbase, 1 mM EDTA und 0,05 % v/v Tween 20, pH 9 besteht. Der pH-Wert der Lösung von 9 ist für einen effizienten Rückgewinnungsprozess optimiert. Trisbase wirkt als Puffermittel, um eine stabile pH-Umgebung aufrechtzuerhalten; EDTA, ein Chelatbildner, verbessert die Zugänglichkeit des Antigens. Das nichtionische Waschmittel Tween 20 trägt dazu bei, die Durchlässigkeit des Gewebes zu verbessern. Diese Lösung kann bei 4 °C gelagert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Wasserstoffperoxid in Kombination mit dem Antigen-Retrieval-Schritt einen synergistischen Effekt bei der Reduzierung des Autofluoreszenzsignals hat, indem die endogenen Fluorophore, die für das unspezifische Hintergrundsignal verantwortlich sind (wie Lipofuscin), abgebaut und/oder modifiziert werden.
<ol><li>1x PBS mit 0,1% v/v Triton X-100 (PBST) vorbereiten, auf 37 °C vorwärmen und die Proben 3 x 3 h tagsüber bei leichtem Schütteln bei 37 °C im Inkubator waschen. Lassen Sie die letzte Wäsche o/n. HINWEIS: Lagern Sie die PBST-Stammlösung bei 4 °C. Es ist von entscheidender Bedeutung, SDS aus dem Gewebe zu entfernen, da es bei niedrigen Temperaturen unlösliche Ausscheidungen bilden kann, die nachfolgende Aufnahmeprozesse beeinträchtigen können.</li>
	<li>Am nächsten Tag werden 10 ml 30 % v/v Wasserstoffperoxid (H2O2) zu jeder Probe gegeben und 45 Minuten lang bei RT leicht geschüttelt.</li>
	<li>3 x 10 min mit 1x PBS (pH 7,4) unter leichtem Schütteln bei RT waschen.</li>
	<li>Die Antigen-Rückgewinnungslösung wird auf 95 °C im Wasserbad vorgewärmt; Die Proben werden in die erhitzte Lösung überführt und 10 min bei 95 °C belassen.</li>
	<li>Lassen Sie die Proben 40 Minuten lang unter leichtem Schütteln auf RT abkühlen.</li>
	<li>3 x 5 min mit deionisiertem Wasser unter leichtem Schütteln waschen.</li>
	<li>Die Proben werden in PBS bei 4 °C für 15 min ausgeglichen.</li>
	<li>Frische Antikörperlösung aus PBST mit 0,01 Gew.-%NaN3 herstellen (siehe HINWEIS zu Schritt 1.3) und Primärantikörper hinzufügen. Die Proben werden mit der Lösung in Schalen mit Schraubdeckel bei 37 °C für n Tage (1-7) in einem Inkubator mit leichtem Schütteln und Lichtschutz inkubiert (Tabelle 2). HINWEIS: Die Inkubationszeit ist größen- und dickenabhängig (Tabelle 1 und Tabelle 2).</li>
	<li>Nach n Tagen werden die Proben in Röhrchen umgefüllt und 3 x 2 h mit vorgewärmtem PBST bei 37 °C unter leichtem Schütteln im Inkubator gewaschen.</li>
	<li>Sekundärantikörper in PBST mit 0,01 Gew.-%NaN3 zugeben und die Proben in neuen Schalen mit Schraubdeckel bei 37 °C für n Tage (1-6) in einem Inkubator mit leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubieren (Tabelle 1 und Tabelle 2).</li>
	<li>Nach n Tagen werden die Proben in Röhrchen umgefüllt und tagsüber 3 x 3 h mit vorgewärmtem PBST bei 37 °C in einem schonenden Schüttelinkubator gewaschen. Lassen Sie die letzte Wäsche o/n. HINWEIS: Da Triton X-100 und Tween 20 viskos sind, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze füllen kann. Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. Verwenden Sie 10 ml Antikörperlösungen für jede Probe und versiegeln Sie die Schale mit Parafilm, um eine Verdunstung der Lösung zu verhindern. Da die Antikörperlösungen NaN3 enthalten, können sie bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Wochen zur Markierung neuer Proben wiederverwendet werden.</li>
</ol>5. Anpassung des Brechungsindex
HINWEIS: Um ein hohes Maß an Transparenz zu erreichen, ist es notwendig, den Brechungsindex des Gewebes zu homogenisieren. Hier verwenden wir 2,2'-Thiodiethanol (TDE) verdünnt in 1x PBS. TDE-Lösungen müssen bei RT gelagert werden.
<ol><li>Übertragen Sie die Proben in neue Schalen, fügen Sie 30 % v/v TDE hinzu und lassen Sie sie 4 h lang bei leichtem Schütteln bei RT stehen.</li>
	<li>Entfernen Sie die 30%ige v/v-TDE-Lösung, geben Sie 68 %ige v/v-TDE-Werte zu den Proben und lassen Sie sie bei RT leicht schütteln. HINWEIS: Da TDE viskos ist, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze füllen kann. Das Einatmen von TDE-Dampf oder -Nebel kann die Atemwege reizen. Daher ist es ratsam, in einem gut belüfteten Bereich zu arbeiten oder Abzüge zu verwenden, um die Exposition zu minimieren. TDE-Lösungen müssen bei RT gelagert werden. Verwenden Sie 10 ml TDE-Lösungen für jede Probe.</li>
</ol>6. Probenmontage
HINWEIS: Um die Probenmontage und die LSFM-Bildaufnahme zu erleichtern, verwenden wir einen speziell angefertigten, versiegelten Probenhalter (als "Sandwich" bezeichnet), der aus drei Teilen besteht: einem Objektträger, einem Abstandshalter und einem Deckglas.
<ol><li>Legen Sie den Stahlabstandshalter (56 x 56 x 0,5 mm3) über den Objektträger (60 x 60 x 1 mm3) und legen Sie die Probe auf den Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie das Quarzdeckglas (60 x 60 x 0,5 mm3) vorsichtig auf, klippen Sie alles zusammen und bereiten Sie einen Zweikomponenten-Silikonkleber im Verhältnis 1:1 vor. Verwenden Sie ein Quarzdeckglas, um den Brechungsindex anzupassen und die optische Aberration während des Aufnahmeprozesses zu reduzieren.</li>
	<li>Füllen Sie mit einer 1-ml-Spritze den Raum zwischen dem Abstandshalter und dem Deckglas mit einem Zweikomponenten-Silikonkleber und lassen Sie ihn 10 Minuten trocknen.</li>
	<li>Entferne die Clips und fülle mit einer kleinen Nadel langsam das gesamte Sandwich mit 68% v/v TDE.</li>
	<li>Stellen Sie frischen Kleber her und verschließen Sie das Sandwich. HINWEIS: Wenn das TDE in Schritt 6.1 versehentlich den Abstandshalter erreicht, härtet der Kleber nicht aus. Stellen Sie sicher, dass sich in Schritt 6.2 keine Luftblasen bilden.</li>
</ol>7. Abisolieren
HINWEIS: Die strukturelle Konservierung und die verbesserte Zugänglichkeit des Epitops von SHORT ermöglichen die Markierung von Schichten in mehreren Runden durch Entfernen der Antikörper und erneutes Färben der Proben mit anderen Markern.
<ol><li>Öffnen Sie das Sandwich mit einer Klinge, legen Sie die Proben in neue Schalen mit Schraubdeckeln, die mit 30 % v/v TDE gefüllt sind, und lassen Sie sie 3 Stunden lang stehen.</li>
	<li>Die Proben werden in Röhrchen umgefüllt, 3 x 2 h in 1x PBS (pH 7,4) bei RT mit leichtem Schütteln gewaschen und die letzte Wäsche o/n gelassen.</li>
	<li>Die Proben werden in einer Reinigungslösung in einem Wasserbad bei 80 °C für 4 h gegeben.</li>
	<li>3 x 2 h in 1x PBST (pH 7,4) bei 37 °C unter leichtem Schütteln waschen und die letzte Wäsche o/n stehen lassen. Jetzt kann die Probe ab Schritt 4.8 erneut beschriftet werden. HINWEIS: Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. Verwenden Sie 10 ml TDE-Lösung für jede Probe.</li>
</ol>

Hochauflösende 3D-Rekonstruktion des menschlichen Gehirns mit SHORT und LSFM

<ol>
	<li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues:+review.">In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Ueda, H. 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M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Belle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tridimensional+visualization+and+analysis+of+early+human+development.">Tridimensional visualization and analysis of early human development.</a> Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).</li><li>Sorelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+enhancement+and+3D+orientation+analysis+in+label-free+two-photon+fluorescence+microscopy.">Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), dev199369 (2021).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+The+human+brain+multiscale+imaging+challenge.">Editorial: The human brain multiscale imaging challenge.</a> Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Hochauflösende Bildgebung und 3D-Rekonstruktion großer menschlicher Hirnareale erfordern mechanische Gewebeschnitte, gefolgt von optischer Klärung und Immunmarkierung einzelner Schichten. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die SHORT-Gewebetransformationsmethode für die schnelle und gleichzeitige Verarbeitung mehrerer menschlicher Hirndickschnitte für die 3D-Hirnrekonstruktion mit subzellulärer Auflösung mit LSFM verwendet werden kann.
Im Gegensatz zu anderen Ansätzen sind ...

Die Analyse der molekularen 3D-Organisation und Zytoarchitektur großer Volumina des menschlichen Gehirns erfordert eine optische Transparenz der Proben, die durch Protokolle mit langer Verarbeitungszeit erreicht wird. Optische Clearing-Techniken wurden entwickelt, um die Heterogenität des Brechungsindex (RI) innerhalb des Gewebes zu minimieren, wodurch die Lichtstreuung reduziert und die Lichteindringtiefe für hochauflösende Bildgebung erhöhtwird 1,2,3,4,5. Derzeitige Fortschritte bei der Klärung und der Markierung von tiefem Gewebe ermöglichen die volumetrische Bildgebung intakter Nagetierorgane und -embryonen unter Nutzung modernster Mikroskopietechniken 6,7,8,9,10,11,12.
Die volumetrische 3D-Rekonstruktion großer Bereiche des postmortalen menschlichen Gehirns stellt im Vergleich zu Modellorganismen jedoch noch eine herausfordernde Aufgabe dar. Die komplexe biologische Zusammensetzung und die variablen postmortalen Fixierungs- und Lagerbedingungen können die Effizienz der Gewebereinigung, die Eindringtiefe der Antikörper und die Epitoperkennung beeinträchtigen 13,14,15,16,17,18,19. Darüber hinaus ist immer noch ein mechanischer Gewebeschnitt und die anschließende Klärung und Markierung jeder einzelnen Scheibe erforderlich, um eine effiziente Klärung und gleichmäßige Markierung großer menschlicher Gehirnareale zu erreichen, was im Vergleich zu Modellorganismen zu langen Bearbeitungszeiten und dem Bedarf an ausgeklügelten kundenspezifischen Geräten führt 15,20,21,22.
Die S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE (SHORT) Gewebetransformationstechnik wurde speziell für die Analyse großer Volumina des menschlichen Gehirns entwickelt18,23. Diese Methode nutzt die Gewebestrukturkonservierung des SWITCH-Protokolls11 und hohe Konzentrationen von Peroxidwasserstoff, um die Autofluoreszenz des Gewebes in Kombination mit der Epitopwiederherstellung zu verringern. SHORT ermöglicht eine gleichmäßige Färbung menschlicher Hirnschnitte mit Markern für verschiedene neuronale Subtypen, Gliazellen, Gefäße und myelinisierte Fasern18,24. Die Ergebnisse sind mit der Analyse von Proteinen mit niedriger und hoher Dichte kompatibel. Die daraus resultierende hohe Transparenz und gleichmäßige Markierung ermöglichen die volumetrische Rekonstruktion dicker Schichten mit Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für die schnelle Erfassung können Lichtblattapparaturen verwendet werden 18,24,25,26,27.
In dieser Arbeit beschreiben wir, wie die SHORT-Gewebetransformationstechnik für die gleichzeitige Klärung und mehrstufige Markierung von Dutzenden von formalinfixierten menschlichen Hirnschnitten verwendet werden kann. Vier verschiedene fluoreszierende Marker können zusammen verwendet werden, was zur Identifizierung verschiedener zellulärer Subpopulationen führt. Nach der Klärung kann eine hochauflösende volumetrische Bildgebung mit Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Hier haben wir ein speziell angefertigtes invertiertes LSFM 18,24,25,26,27 verwendet, das ein schnelles optisches Schneiden der Probe und eine schnelle parallele Erfassung mehrerer Kanäle ermöglicht. Mit diesem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll ist es möglich, eine umfassende zelluläre und strukturelle Charakterisierung mit einer subzellulären Auflösung großer Bereiche des menschlichen Gehirns zu erhalten, wie bereits in der Kartierung eines gesamten Broca-Arealsgezeigt wurde 23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-thiodiethanol</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamide &#62;= 99.0% (GC)</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressome VF-900-0Z Microtome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>LaserOptex</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC_29096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator ISS-4075</td>
			<td>Lab companion&#160;</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Attak</td>
			<td>Henkel Italia srl</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Laborchimica</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer saline tablet</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent Twinsil</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13005002</td>
			<td>out of production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phtalate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P1088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfite</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Microlaser srl</td>
			<td></td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputum Containers (dishes with screw lids)</td>
			<td>Paul Boettger GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>07.061.2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>PanReac AppliChem (ITW reagents)</td>
			<td>A4577,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62 547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-545-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-605-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin antibody (PV)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32895</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calretinin Polyclonal antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>12278_1_AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175700</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150107</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568) preadsorbed</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175475</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150169</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175711</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab194324</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin Antibody YC7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47706</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasoactive intestinal peptide (VIP)</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>16233-1-AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and labeling for light-sheet fluorescence microscopy in large-scale human brain imaging

Trotz der zahlreichen Clearing-Techniken, die im letzten Jahrzehnt entstanden sind, bleibt die Verarbeitung postmortaler menschlicher Gehirne aufgrund ihrer Dimensionen und Komplexität, die die Bildgebung mit Mikrometerauflösung besonders schwierig machen, eine herausfordernde Aufgabe. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, um die Rekonstruktion volumetrischer Abschnitte des menschlichen Gehirns durchzuführen, indem gleichzeitig Dutzende von Schnitten mit dem SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) Gewebetransformationsprotokoll verarbeitet werden, das die Klärung, Markierung und sequenzielle Bildgebungder Proben mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht. SHORT ermöglicht eine schnelle Gewebereinigung und homogene Mehrfachmarkierung dicker Schichten mit mehreren neuronalen Markern und ermöglicht so die Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz. Nach der Säuberung werden die Schichten über LSFM mit Mikrometerauflösung und in mehreren Kanälen gleichzeitig für eine schnelle 3D-Rekonstruktion abgebildet. Durch die Kombination von SHORT mit LSFM-Analyse innerhalb eines routinemäßigen Hochdurchsatzprotokolls ist es möglich, die 3D-Zytoarchitektur-Rekonstruktion großer volumetrischer Areale mit hoher Auflösung in kurzer Zeit zu erhalten und so eine umfassende strukturelle Charakterisierung des menschlichen Gehirns zu ermöglichen.

Analyzing the 3D molecular organization and cytoarchitecture of large volumes of the human brain requires optical transparency of specimens, achieved through protocols with extensive processing time. Optical clearing techniques were developed to minimize heterogeneity in refractive index (RI) within the tissues, thereby reducing light scattering and increasing the light penetration depth for high-resolution imaging1,2,3,4,5. Current advances in clearing and deep tissue-labeling methods allow volumetric imaging of intact rodent organs and embryos by exploiting cutting-edge microscopy techniques6,7,8,9,10,11,12.
However, volumetric 3D reconstruction of large areas of the postmortem human brain still represents a challenging task compared with model organisms. The complex biological composition and the variable postmortem fixation and storage conditions can compromise the tissue clearing efficiency, the antibody penetration depth, and the epitope recognition13,14,15,16,17,18,19. Moreover, mechanical tissue sectioning and subsequent clearing and labeling of each slice is still required to achieve an efficient clearing and uniform labeling of large human brain areas, resulting in long processing times and the need for sophisticated custom equipment,&#160;compared with model organisms15,20,21,22.
The SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) tissue transformation technique has been developed specifically to analyze large volumes of the human brain18,23. This method employs the tissue structural preservation of the SWITCH protocol11 and high concentrations of peroxide hydrogen to decrease tissue autofluorescence, in combination with epitope restoration. SHORT allows uniform staining of human brain slices with markers for different neuronal subtypes, glial cells, vasculature, and myelinated fibers18,24. Its results are compatible with the analysis of both low- and high-density proteins. The resulting high transparency levels and uniform labeling enable volumetric reconstruction of thick slices with fluorescence microscopy, in particular, for fast acquisition light-sheet apparatus can be used18,24,25,26,27.
In this work, we describe how the SHORT tissue transformation technique can be used for simultaneous clearing and multi-round labeling of tens of formalin-fixed human brain sections. Four different fluorescent markers can be used together, leading to the identification of different cellular sub-populations. After clearing, high-resolution volumetric imaging can be performed with fluorescence microscopy. Here, we used a custom-made inverted LSFM18,24,25,26,27, which enables fast optical sectioning of the sample and rapid acquisition of multiple channels in parallel. With this routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain a comprehensive cellular and structural characterization with a sub-cellular resolution of large areas of the human brain as already demonstrated in the mapping of an entire Broca&#39;s area23.

Autor im Rampenlicht: Fortschrittliche 3D-Zytoarchitekturanalyse - Schnelle volumetrische Rekonstruktion des menschlichen Gehirns 

Optische Klärung und Markierung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie in der großflächigen Bildgebung des menschlichen Gehirns

The human brain is a complex organ spanning different skills. To understand its functionality, it's essential to construct a detailed cell sensors across the whole brain. Our routinely high-throughput protocol permits the analysis of 3D cytoarchitecture of volumetric areas of the human brain with micrometer resolution, enabling its structural characterization.Volumetric reconstruction of large areas of the human brain presents several experimental challenges linked to the massive dimensions of brain samples, the complex biological composition, the variable postmortem fixation and storage conditions, and the autofluorescent signals from lipofuscin-type pigments. All these can compromise the optical clearing efficiency and demonstrating quality. Compared to other clearing techniques, the short tissue transformation method combined with light sheet microscopy imaging can be used for rapid and simultaneous processing of multiple human brain sections.These result in 3D brain reconstruction with a subcellular resolution.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Behandlung mehrerer Schichten mit einer Dicke von 100 μm bis 500 μm mit der SHORT-Methode. Dieser Ansatz reduziert die Gesamtbearbeitungszeit für das gesamte Verfahren erheblich. In dieser Arbeit bieten wir eine umfassende Beschreibung der gesamten Pipeline (Abbildung 1) für die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer postmortaler Dickschnitte des menschlichen Gehirns und demonstrieren das Protokoll an 24 Schichten gleichzeitig (<...

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Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its ...

Das menschliche Gehirn ist ein komplexes Organ, das verschiedene Fähigkeiten umfasst. Um seine Funktionsweise zu verstehen, ist es wichtig, eine detaillierte Zellsensorik über das gesamte Gehirn hinweg zu konstruieren. Unser routinemäßiges Hochdurchsatzprotokoll ermöglicht die Analyse der 3D-Zytoarchitektur von volumetrischen Bereichen des menschlichen Gehirns mit Mikrometerauflösung und ermöglicht so die strukturelle Charakterisierung.Die volumetrische Rekonstruktion großer Bereiche des menschlichen Gehirns stellt mehrere experimentelle Herausforderungen dar, die mit den massiven Abmessungen der Gehirnproben, der komplexen biologischen Zusammensetzung, den variablen postmortalen Fixierungs- und Lagerbedingungen und den autofluoreszierenden Signalen von lipofuszinartigen Pigmenten zusammenhängen. All dies kann die optische Reinigungseffizienz und die Demonstrationsqualität beeinträchtigen. Im Vergleich zu anderen Clearing-Techniken kann die Kurzgewebstransformationsmethode in Kombination mit der Lichtblattmikroskopie für die schnelle und gleichzeitige Verarbeitung mehrerer menschlicher Hirnschnitte verwendet werden.Diese führen zu einer 3D-Gehirnrekonstruktion mit subzellulärer Auflösung.

optical-clearing-labeling-for-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

1.3K Aufrufe.  University of Florence. Das menschliche Gehirn ist ein komplexes Organ, das verschiedene Fähigkeiten umfasst. Um seine Funktionsweise zu verstehen, ist es wichtig, eine detaillierte Zellsensorik über das gesamte Gehirn hinweg zu konstruieren. Unser routinemäßiges Hochdurchsatzprotokoll ermöglicht die Analyse der 3D-Zytoarchitektur von volumetrischen Bereichen des menschlichen Gehirns mit Mikrometerauflösung und ermöglicht so die strukturelle Charakterisierung.Die volumetrische Rekonstruktion großer Be...