Ringraziamo Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Dipartimento di Radiologia, per aver fornito i campioni di cervello umano analizzati in questo studio. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma quadro di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 654148 (Laserlab-Europe), dal programma quadro Horizon 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione nell'ambito dell'accordo di sovvenzione specifico n. 785907 (Human Brain Project SGA2) e n. 945539 (Human Brain Project SGA3), dal General Hospital Corporation Center del National Institutes of Health con il numero di premio U01 MH117023, e dal Ministero dell'Istruzione nell'ambito di Euro-Bioimaging Italian Node (infrastruttura di ricerca ESFRI). Infine, questa ricerca è stata realizzata con il contributo di "Fondazione CR Firenze". Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Campioni di tessuto umano fissati in formalina sono stati forniti dal Dipartimento di Neuropatologia del Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Il consenso scritto è stato ottenuto dai partecipanti sani prima della morte, seguendo i protocolli di raccolta dei tessuti approvati dall'IRB dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza dei Partner (PIBC, protocollo 2003P001937). I documenti di autorizzazione sono conservati presso il MGH Autopsy Services di Boston, MA, Stati Uniti, e sono disponibili su richiesta.
1. Inclusione dell'agarosio e taglio del campione
<ol><li>Preparare una soluzione di agarosio al 4% p/v in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) in un becher e incorporare il blocco di tessuto all'interno. Attendere che raggiunga la temperatura ambiente (RT) e poi conservare a 4 °C per 24 ore.</li>
	<li>Per ottenere sezioni di alta precisione, incollare il campione al disco del vibratomo e riempire il vassoio con PBS freddo 1x (pH 7,4). Regolare i parametri del vibratomo come frequenza, ampiezza e velocità in base al tipo di tessuto da affettare (valori utilizzati: frequenza = 5 (50 Hz); ampiezza = 0,4; velocità = 3 (0,15 mm/s). NOTA: È necessario utilizzare vibratomi diversi a seconda del volume del campione. Per campioni con un volume massimo di 70 x 40 x 15 mm, è possibile utilizzare un vibratomo (ad es. Leica VT1000 S); per campioni più grandi, è possibile utilizzare un compresstomo (ad es. VF-900-0Z Microtomo18) o un apparecchio personalizzato21. Qui presentiamo fette tagliate con uno spessore di 400 μm o 500 μm.</li>
	<li>Dopo il taglio, mettere tutte le fette in una soluzione conservante composta da 1x PBS (pH 7,4) con 0,01% p/v di Sodio Azide (NaN3) e conservare a 4 °C. NOTA: Prima dell'inclusione, attendere che la soluzione di agarosio raggiunga i 37 °C. Una temperatura più elevata potrebbe danneggiare il campione. Si raccomanda di non lasciare i campioni in PFA per più di 48 ore poiché una fissazione prolungata potrebbe interferire con la procedura di marcatura danneggiando gli antigeni e aumentando l'autofluorescenza dei tessuti. Per la conservazione a lungo termine dei tessuti umani, il PBS con NaN3 viene utilizzato per prevenire la contaminazione microbica. A causa della tossicità di NaN3, preparare la soluzione conservante sotto una cappa chimica.</li>
</ol>2. Fissazione tissutale
NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate nel seguente protocollo sono preparate in grandi volumi, sufficienti per processare tutte le fette dello stesso blocco di tessuto e minimizzare la variabilità tecnica e ridurre i tempi per i singoli passaggi.
<ol><li>Preparare la soluzione di spegnimento con il 50% v/v 1x PBS pH 3, il 25% v/v 0,1 M di acido cloridrico (HCl), il 25% v/v 0,1 M di idrogeno ftalato di potassio (KHP) e il 4% v/v di glutaraldeide fresca al 4%. Porre tutti i campioni in piastre con coperchio a vite (70 x 23 mm) e incubarli con la soluzione Switch-off agitando delicatamente a 4 °C per 1 giorno, proteggendoli dalla luce con un foglio di alluminio.</li>
	<li>Preparare la soluzione di accensione con 1x PBS (pH 7,4) e glutaraldeide fresca all'1% v/v. Mettere tutti i campioni in nuove piastre e incubarli con la soluzione Switch-on con agitazione delicata a 4 °C per 1 giorno, proteggendoli dalla luce con un foglio di alluminio. NOTA: A causa dell'elevata tossicità e sensibilità alla luce della glutaraldeide, sia le soluzioni di spegnimento che quelle di accensione devono essere sempre preparate fresche e conservate sotto la cappa chimica su ghiaccio. Riempire sempre il piatto con 20 ml di ciascuna soluzione e sigillarlo con parafilm.</li>
</ol>3. Inattivazione e cancellazione
NOTA: La glutaraldeide reattiva nei campioni deve essere inattivata mediante incubazione con una soluzione di inattivazione costituita da 1x PBS pH 7,4, 4% p/v acetammide, 4% p/v glicina, pH 9,0. La soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per rimuovere i lipidi e rendere trasparente il tessuto, utilizziamo la soluzione di clearing composta da 200 mM di sodio dodecil solfato (SDS), 20 mM di solfito di sodio (Na2SO3) e 20 mM di acido borico (H3BO3), pH 9,0. La soluzione deve essere conservata a RT poiché la SDS precipita a 4 °C. Tutti i passaggi successivi verranno eseguiti in provette riempite con la soluzione.
<ol><li>Spostare i campioni dalle piastre alle provette e lavare per 3 x 2 ore con 1x PBS pH 7,4 a RT agitando delicatamente. NOTA: Per il passaggio 3.1, è necessario lavorare sotto la cappa chimica a causa della tossicità della glutaraldeide. Anche l'acetammide, la SDS e l'acido borico sono reagenti tossici e devono essere maneggiati sotto una cappa chimica. Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione.</li>
	<li>Incubare i campioni in soluzione di inattivazione a 37 °C a bagnomaria per una notte (o/n).</li>
	<li>Lavare per 3 x 2 ore in 1x PBS pH 7,4 a RT agitando delicatamente.</li>
	<li>Incubare i campioni in soluzione di chiarimento a 55 °C a bagnomaria per 3-7 giorni. Cambiare la soluzione ogni 2 giorni (Tabella 1).</li>
</ol>4. Immunoetichettatura
NOTA: Prima della fase di etichettatura, è necessario rimuovere la SDS residua, ridurre l'autofluorescenza e smascherare gli epitopi con una soluzione di recupero dell'antigene composta da 10 mM Tris base, 1 mM EDTA e 0,05% v/v Tween 20, pH 9. Il pH della soluzione di 9 è ottimizzato per un processo di recupero efficiente; La base Tris agisce come agente tampone per mantenere un ambiente a pH stabile; L'EDTA, che è un agente chelante, migliora l'accessibilità dell'antigene. Il detergente non ionico Tween 20 aiuta a migliorare la permeabilità del tessuto. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C. È importante notare che il perossido di idrogeno combinato con la fase di recupero dell'antigene ha un effetto sinergico nel ridurre il segnale di autofluorescenza, scomponendo e/o modificando i fluorofori endogeni responsabili del segnale di fondo non specifico (come la lipofuscina).
<ol><li>Preparare 1x PBS con Triton X-100 (PBST) allo 0,1% v/v, preriscaldarlo a 37 °C e lavare i campioni 3 x 3 ore durante il giorno agitando delicatamente a 37 °C nell'incubatore. Lasciare l'ultimo lavaggio o/n. NOTA: Conservare la soluzione madre PBST a 4 °C. È fondamentale rimuovere la SDS dal tessuto in quanto può formare precipitati insolubili a basse temperature che possono interferire con i successivi processi di acquisizione.</li>
	<li>Il giorno dopo, aggiungere 10 mL di perossido di idrogeno al 30% v/v (H2O2 ) a ciascun campione e lasciarlo agitare delicatamente a RT per 45 minuti.</li>
	<li>Lavare 3 x 10 min con 1x PBS (pH 7,4) agitando delicatamente a RT.</li>
	<li>Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene a 95 °C a bagnomaria; trasferire i campioni nella soluzione riscaldata e lasciarli a 95 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Lasciare raffreddare i campioni a RT per 40 minuti agitando delicatamente.</li>
	<li>Lavare 3 x 5 minuti con acqua deionizzata agitando delicatamente.</li>
	<li>Equilibrare i campioni in PBS a 4 °C per 15 min.</li>
	<li>Preparare una soluzione anticorpale fresca a base di PBST con NaN3 allo 0,01% p/v (vedere la NOTA per il passaggio 1.3) e aggiungere gli anticorpi primari. Incubare i campioni con la soluzione in piastre con coperchio a vite a 37 °C per n giorni (1-7) in un incubatore agitando delicatamente e proteggendo dalla luce (Tabella 2). NOTA: Il tempo di incubazione dipende dalle dimensioni e dallo spessore (Tabella 1 e Tabella 2).</li>
	<li>Dopo n giorni, spostare i campioni in provette e lavare 3 x 2 ore con PBST preriscaldato a 37 °C agitando delicatamente nell'incubatore.</li>
	<li>Aggiungere gli anticorpi secondari in PBST con NaN3 allo 0,01% p/v e incubare i campioni in nuove piastre con coperchi a vite a 37 °C per n giorni (1-6) in un incubatore agitando delicatamente e al riparo dalla luce (Tabella 1 e Tabella 2).</li>
	<li>Dopo n giorni, trasferire i campioni in provette e lavare 3 x 3 ore durante il giorno con PBST preriscaldato a 37 °C in un'incubatrice ad agitazione delicata. Lasciare l'ultimo lavaggio o/n. NOTA: Poiché Triton X-100 e Tween 20 sono viscosi, pipettare lentamente per consentire il riempimento del puntale. Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione. Utilizzare 10 mL di soluzioni anticorpali per ogni campione e sigillare la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione della soluzione. Poiché le soluzioni anticorpali contengono NaN3, possono essere conservate a 4 °C e riutilizzate per etichettare nuovi campioni entro 2 settimane.</li>
</ol>5. Corrispondenza dell'indice di rifrazione
NOTA: Per ottenere un elevato livello di trasparenza, è necessario omogeneizzare l'indice di rifrazione tissutale. Qui usiamo il 2,2'-tiodietanolo (TDE) diluito in 1x PBS. Le soluzioni TDE devono essere conservate in RT.
<ol><li>Trasferire i campioni in nuove stoviglie, aggiungere il 30% v/v TDE e lasciarli per 4 ore agitando delicatamente a RT.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di TDE al 30% v/v, aggiungere TDE al 68% v/v ai campioni e lasciarli agitare delicatamente a RT. NOTA: Poiché il TDE è viscoso, pipettare lentamente per consentire il riempimento del puntale. L'inalazione di vapore o nebbia TDE può irritare il sistema respiratorio. Pertanto, si consiglia di lavorare in un'area ben ventilata o di utilizzare cappe aspiranti per ridurre al minimo l'esposizione. Le soluzioni TDE devono essere conservate a RT. Utilizzare 10 mL di soluzioni TDE per ciascun campione.</li>
</ol>6. Montaggio del campione
NOTA: Per facilitare il montaggio del campione e l'acquisizione dell'immagine LSFM, utilizziamo un portacampioni sigillato su misura (denominato "sandwich"), composto da tre parti: un vetrino da microscopio, un distanziatore e un vetrino coprioggetti.
<ol><li>Posizionare il distanziatore in acciaio (56 x 56 x 0,5 mm3) sul vetrino del microscopio (60 x 60 x 1 mm3) e posizionare il campione sul vetrino per microscopia.</li>
	<li>Metti con cura il vetrino coprioggetti al quarzo (60 x 60 x 0,5 mm3), aggancia il tutto insieme e prepara una colla siliconica bicomponente in rapporto 1:1. Utilizzare un vetrino coprioggetti al quarzo per far corrispondere l'indice di rifrazione e ridurre l'aberrazione ottica durante il processo di acquisizione.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 1 ml, riempire lo spazio tra il distanziatore e il vetrino coprioggetto con una colla siliconica bicomponente e lasciare asciugare per 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere le clip e utilizzare un piccolo ago per riempire lentamente l'intero sandwich con TDE al 68% v/v.</li>
	<li>Prepara la colla fresca e sigilla il panino. NOTA: Se il TDE raggiunge accidentalmente il distanziatore al punto 6.1, la colla non si indurisce. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria durante il passaggio 6.2.</li>
</ol>7. Strippaggio
NOTA: La conservazione strutturale e la maggiore accessibilità dell'epitopo di SHORT consentono l'etichettatura multi-round delle fette rimuovendo gli anticorpi e ricolorando i campioni con altri marcatori.
<ol><li>Aprire il panino con una lama, mettere i campioni in nuovi piatti con coperchi a vite riempiti con TDE al 30% v/v e lasciarli per 3 h.</li>
	<li>Trasferire i campioni in provette, lavare per 3 x 2 ore in 1x PBS (pH 7,4) a RT con agitazione delicata e lasciare l'ultimo lavaggio o/n.</li>
	<li>Porre i campioni in soluzione di chiarimento a bagnomaria a 80 °C per 4 ore.</li>
	<li>Lavare per 3 x 2 h in 1x PBST (pH 7,4) a 37 °C agitando delicatamente e lasciare l'ultimo lavaggio. A questo punto il campione è pronto per essere etichettato nuovamente a partire dal passaggio 4.8. NOTA: Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione. Utilizzare 10 mL di soluzione TDE per ogni campione.</li>
</ol>

Ricostruzione 3D ad alta risoluzione del cervello umano con SHORT e LSFM

<ol>
	<li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues:+review.">In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+practical+considerations+for+tissue+clearing+and+imaging.">Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+Scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cell-resolution+volumetric+mapping+allows+layer-specific+investigation+of+human+brain+cytoarchitecture.">Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture.</a> Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).</li><li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+histology+methods+for+three-dimensional+imaging+of+fresh+and+archival+human+brain+tissues.">Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues.</a> Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+enhancement+for+label-free+imaging+of+myelinated+fibers+in+mammalian+brains.">Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).</li><li>Pesce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+molecular+phenotyping+of+cleared+human+brain+tissues+with+light-sheet+fluorescence+microscopy.">3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy.</a> Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).</li><li>Schueth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+3D+light-sheet+imaging+of+very+large-scale+optically+cleared+human+brain+and+prostate+tissue+samples.">Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples.</a> Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).</li><li>Morawski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+microscopy+with+CLARITY+on+human+brain+tissue:+Towards+a+tool+for+informing+and+validating+MRI-based+histology.">Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology.</a> NeuroImage. 182, 417-428 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+platform+for+multi-scale+molecular+imaging+and+phenotyping+of+the+human+brain.">Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+resolution+atlas+of+Broca's+area.">A cellular resolution atlas of Broca's area.</a> Science Advances. (9), eadg3844 (2023).</li><li>Scardigli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+for+three-dimensional+reconstruction+of+human+brain+cellular+anatomy+using+advanced+imaging+techniques.">Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).</li><li>Pesce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+cerebral+cortex+using+confocal+microscopy.">Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Belle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tridimensional+visualization+and+analysis+of+early+human+development.">Tridimensional visualization and analysis of early human development.</a> Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).</li><li>Sorelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+enhancement+and+3D+orientation+analysis+in+label-free+two-photon+fluorescence+microscopy.">Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), dev199369 (2021).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+The+human+brain+multiscale+imaging+challenge.">Editorial: The human brain multiscale imaging challenge.</a> Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

L'imaging ad alta risoluzione e la ricostruzione 3D di grandi aree cerebrali umane richiedono il sezionamento meccanico dei tessuti, seguito dalla pulizia ottica e dall'immunomarcatura di singole fette. Il protocollo qui presentato descrive come il metodo di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzato per l'elaborazione rapida e simultanea di più sezioni spesse del cervello umano per la ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare con LSFM.
A differenza di altri appro...

L'analisi dell'organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l'eterogeneità dell'indice di rifrazione (RI) all'interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli attuali progressi nei metodi di clearing e marcatura dei tessuti profondi consentono l'imaging volumetrico di organi ed embrioni di roditori intatti sfruttando tecniche di microscopia all'avanguardia 6,7,8,9,10,11,12.
Tuttavia, la ricostruzione volumetrica 3D di vaste aree del cervello umano post-mortem rappresenta ancora un compito impegnativo rispetto agli organismi modello. La complessa composizione biologica e le variabili condizioni di fissazione e conservazione post-mortem possono compromettere l'efficienza di eliminazione dei tessuti, la profondità di penetrazione degli anticorpi e il riconoscimento dell'epitopo 13,14,15,16,17,18,19. Inoltre, il sezionamento meccanico dei tessuti e la successiva pulizia ed etichettatura di ogni fetta sono ancora necessari per ottenere una pulizia efficiente e un'etichettatura uniforme di grandi aree cerebrali umane, con conseguenti lunghi tempi di lavorazione e la necessità di sofisticate apparecchiature personalizzate, rispetto agli organismi modello 15,20,21,22.
La tecnica di trasformazione tissutale SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) è stata sviluppata specificamente per analizzare grandi volumi del cervello umano18,23. Questo metodo impiega la conservazione strutturale dei tessuti del protocollo SWITCH11 e alte concentrazioni di perossido di idrogeno per ridurre l'autofluorescenza tissutale, in combinazione con il ripristino dell'epitopo. SHORT consente una colorazione uniforme di fette di cervello umano con marcatori per diversi sottotipi neuronali, cellule gliali, vascolarizzazione e fibre mieliniche18,24. I suoi risultati sono compatibili con l'analisi di proteine sia a bassa che ad alta densità. Gli elevati livelli di trasparenza che ne derivano e l'etichettatura uniforme consentono la ricostruzione volumetrica di fette spesse con microscopia a fluorescenza, in particolare, per l'acquisizione rapida è possibile utilizzare apparecchi a foglio di luce 18,24,25,26,27.
In questo lavoro, descriviamo come la tecnica di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzata per la pulizia simultanea e l'etichettatura multi-round di decine di sezioni di cervello umano fissate in formalina. Quattro diversi marcatori fluorescenti possono essere utilizzati insieme, portando all'identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari. Dopo la pulizia, è possibile eseguire l'imaging volumetrico ad alta risoluzione con microscopia a fluorescenza. In questo caso, abbiamo utilizzato un LSFM invertito su misura 18,24,25,26,27, che consente un rapido sezionamento ottico del campione e una rapida acquisizione di più canali in parallelo. Con questo protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere una caratterizzazione cellulare e strutturale completa con una risoluzione sub-cellulare di vaste aree del cervello umano, come già dimostrato nella mappatura di un'intera area di Broca23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-thiodiethanol</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamide &#62;= 99.0% (GC)</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressome VF-900-0Z Microtome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>LaserOptex</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC_29096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator ISS-4075</td>
			<td>Lab companion&#160;</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Attak</td>
			<td>Henkel Italia srl</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Laborchimica</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer saline tablet</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent Twinsil</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13005002</td>
			<td>out of production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phtalate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P1088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfite</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Microlaser srl</td>
			<td></td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputum Containers (dishes with screw lids)</td>
			<td>Paul Boettger GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>07.061.2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>PanReac AppliChem (ITW reagents)</td>
			<td>A4577,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62 547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-545-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-605-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin antibody (PV)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32895</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calretinin Polyclonal antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>12278_1_AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175700</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150107</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568) preadsorbed</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175475</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150169</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175711</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab194324</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin Antibody YC7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47706</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasoactive intestinal peptide (VIP)</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>16233-1-AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and labeling for light-sheet fluorescence microscopy in large-scale human brain imaging

Nonostante le numerose tecniche di clearing emerse nell'ultimo decennio, l'elaborazione post-mortem del cervello umano rimane un compito impegnativo a causa delle sue dimensioni e complessità, che rendono particolarmente difficile l'imaging con risoluzione micrometrica. Questo articolo presenta un protocollo per eseguire la ricostruzione di porzioni volumetriche del cervello umano elaborando simultaneamente decine di sezioni con il protocollo di trasformazione tissutale SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), che consente la clearing, la marcatura e l'imaging sequenziale dei campioni con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM). SHORT fornisce una rapida pulizia dei tessuti e una marcatura multipla omogenea di fette spesse con diversi marcatori neuronali, consentendo l'identificazione di diverse sottopopolazioni neuronali sia nella materia bianca che in quella grigia. Dopo la pulizia, le fette vengono visualizzate tramite LSFM con risoluzione micrometrica e in più canali contemporaneamente per una rapida ricostruzione 3D. Combinando l'analisi SHORT con LSFM all'interno di un protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere la ricostruzione della citoarchitettura 3D di grandi aree volumetriche ad alta risoluzione in breve tempo, consentendo così una caratterizzazione strutturale completa del cervello umano.

Analyzing the 3D molecular organization and cytoarchitecture of large volumes of the human brain requires optical transparency of specimens, achieved through protocols with extensive processing time. Optical clearing techniques were developed to minimize heterogeneity in refractive index (RI) within the tissues, thereby reducing light scattering and increasing the light penetration depth for high-resolution imaging1,2,3,4,5. Current advances in clearing and deep tissue-labeling methods allow volumetric imaging of intact rodent organs and embryos by exploiting cutting-edge microscopy techniques6,7,8,9,10,11,12.
However, volumetric 3D reconstruction of large areas of the postmortem human brain still represents a challenging task compared with model organisms. The complex biological composition and the variable postmortem fixation and storage conditions can compromise the tissue clearing efficiency, the antibody penetration depth, and the epitope recognition13,14,15,16,17,18,19. Moreover, mechanical tissue sectioning and subsequent clearing and labeling of each slice is still required to achieve an efficient clearing and uniform labeling of large human brain areas, resulting in long processing times and the need for sophisticated custom equipment,&#160;compared with model organisms15,20,21,22.
The SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) tissue transformation technique has been developed specifically to analyze large volumes of the human brain18,23. This method employs the tissue structural preservation of the SWITCH protocol11 and high concentrations of peroxide hydrogen to decrease tissue autofluorescence, in combination with epitope restoration. SHORT allows uniform staining of human brain slices with markers for different neuronal subtypes, glial cells, vasculature, and myelinated fibers18,24. Its results are compatible with the analysis of both low- and high-density proteins. The resulting high transparency levels and uniform labeling enable volumetric reconstruction of thick slices with fluorescence microscopy, in particular, for fast acquisition light-sheet apparatus can be used18,24,25,26,27.
In this work, we describe how the SHORT tissue transformation technique can be used for simultaneous clearing and multi-round labeling of tens of formalin-fixed human brain sections. Four different fluorescent markers can be used together, leading to the identification of different cellular sub-populations. After clearing, high-resolution volumetric imaging can be performed with fluorescence microscopy. Here, we used a custom-made inverted LSFM18,24,25,26,27, which enables fast optical sectioning of the sample and rapid acquisition of multiple channels in parallel. With this routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain a comprehensive cellular and structural characterization with a sub-cellular resolution of large areas of the human brain as already demonstrated in the mapping of an entire Broca&#39;s area23.

Autore in primo piano: Avanzamento dell'analisi della citoarchitettura 3D - Ricostruzione volumetrica rapida del cervello umano 

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

The human brain is a complex organ spanning different skills. To understand its functionality, it's essential to construct a detailed cell sensors across the whole brain. Our routinely high-throughput protocol permits the analysis of 3D cytoarchitecture of volumetric areas of the human brain with micrometer resolution, enabling its structural characterization.Volumetric reconstruction of large areas of the human brain presents several experimental challenges linked to the massive dimensions of brain samples, the complex biological composition, the variable postmortem fixation and storage conditions, and the autofluorescent signals from lipofuscin-type pigments. All these can compromise the optical clearing efficiency and demonstrating quality. Compared to other clearing techniques, the short tissue transformation method combined with light sheet microscopy imaging can be used for rapid and simultaneous processing of multiple human brain sections.These result in 3D brain reconstruction with a subcellular resolution.

Il protocollo qui descritto consente il trattamento simultaneo di più fette, di spessore variabile da 100 μm a 500 μm, utilizzando il metodo SHORT. Questo approccio riduce significativamente il tempo di elaborazione complessivo per l'intera procedura. In questo lavoro, forniamo una descrizione completa dell'intera pipeline (Figura 1) per l'elaborazione simultanea di più sezioni spesse del cervello umano post-mortem e dimostriamo il protocollo su 24 fette contemporaneamente (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing 3D Cytoarchitecture Analysis — Rapid Volumetric Reconstruction of the Human Brain at JoVE.com

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its ...

Il cervello umano è un organo complesso che abbraccia diverse abilità. Per comprenderne la funzionalità, è essenziale costruire un sensore cellulare dettagliato in tutto il cervello. Il nostro protocollo di routine ad alto rendimento consente l'analisi della citoarchitettura 3D di aree volumetriche del cervello umano con risoluzione micrometrica, consentendone la caratterizzazione strutturale.La ricostruzione volumetrica di vaste aree del cervello umano presenta diverse sfide sperimentali legate alle dimensioni massicce dei campioni cerebrali, alla complessa composizione biologica, alle condizioni variabili di fissazione e conservazione post-mortem e ai segnali di autofluorescenza provenienti da pigmenti di tipo lipofuscina. Tutto ciò può compromettere l'efficienza di pulizia ottica e la dimostrazione della qualità. Rispetto ad altre tecniche di clearing, il metodo di trasformazione dei tessuti corti combinato con l'imaging al microscopio a foglio di luce può essere utilizzato per l'elaborazione rapida e simultanea di più sezioni del cervello umano.Questi si traducono in una ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare.

optical-clearing-labeling-for-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

1.3K Views.  University of Florence. Il cervello umano è un organo complesso che abbraccia diverse abilità. Per comprenderne la funzionalità, è essenziale costruire un sensore cellulare dettagliato in tutto il cervello. Il nostro protocollo di routine ad alto rendimento consente l'analisi della citoarchitettura 3D di aree volumetriche del cervello umano con risoluzione micrometrica, consentendone la caratterizzazione strutturale.La ricostruzione volumetrica di vaste aree del cervello umano presenta diverse sfide speri...