La pince à épiler optique permet le piégeage physique et la manipulation d’objets à l’échelle micronique et nanométrique de manière non invasive en utilisant uniquement un faisceau laser focalisé. Cet outil est maintenant appliqué avec succès à diverses structures biologiques, y compris le clivage des cellules. Notre laboratoire vise à étudier l’interaction directe cellule-cellule au niveau de la cellule unique et à traiter davantage cet arrangement latéral et cette structuration en utilisant des techniques prometteuses telles que les pinces optiques.
Tout d’abord, le défi expérimental actuel est l’absence de protocole pour la construction de sphéroïdes hybrides à l’aide de pinces optiques pour l’ensemble du processus. Deuxièmement, la stabilisation de la nouvelle réforme des sphéroïdes hybrides et leur récupération en vue d’un traitement expérimental ultérieur. Dans ce protocole, nous démontrons étape par étape la construction d’un sphéroïde de lymphome hybride à l’aide d’une pince optique.
Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’étudier en temps réel les interactions directes entre les cellules du lymphome et le microenvironnement tridimensionnel, ce qui est plus pertinent sur le plan biologique que la culture cellulaire traditionnelle. Il est important de noter que la technique présentée ici peut être facilement adaptée aux lignées cellulaires de leucémie et à d’autres tumeurs malignes hématopathologiques. Nous prévoyons d’utiliser nos méthodes pour étudier les changements infimes de l’adhésion d’une cellule unique induits par les médicaments anticancéreux.
Nous avons l’intention d’utiliser la lignée tumorale d’un patient à cette fin. Commencez par préparer le micro-moule. Rincez la boîte de Pétri 3D micro-moule dans de l’eau déminéralisée et placez-la sous un agneau UV pendant 30 minutes pour effectuer la stérilisation.
Tout d’abord, préparez une solution d’agarose à 2 % en dissolvant la poudre d’agarose dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % à l’aide d’un micro-ondes. Évitez de créer des bulles lors du mélange ou du pipetage de l’agarose. Froid à environ 70 degrés Celsius.
Ensuite, préparez des hydrogels en remplissant des micro-moules préalablement stérilisés avec 500 microlitres d’agarose. Éliminez toutes les bulles qui pourraient être piégées dans les petites caractéristiques d’un micro-moule par pipetage. Après 15 minutes, lorsque l’agarose s’est solidifiée, retirez soigneusement les gels des micro-moules dans une plaque stérile à six puits.
Avant de passer à l’étape suivante, vérifiez au microscope, confirmez que le gel a été correctement préparé. Ajouter un tampon salin phosphate recouvrant complètement les micro-moules avant de placer la plaque sous une lampe UV pendant 30 minutes pour effectuer la stérilisation. Avant d’utiliser les dispositifs à base d’agarose pour produire des sphéroïdes, équilibrez le gel en le recouvrant complètement de milieu RPMI et incubez pendant au moins 15 minutes.
Cultivez la lignée cellulaire stromale mésenchymateuse HS-5 dans un milieu de culture complet RPMI dans des conditions standard, en assurant un changement de milieu toutes les 48 heures. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, retirez le milieu de culture. Lavez les cellules avec une solution saline tampon phosphate et détachez-les du fond du ballon de culture à l’aide de trypsine.
Arrêtez la trypsine en ajoutant deux millilitres de milieu de culture, puis transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 300 fois la gravité pendant sept minutes. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de culture frais.
Comptez les cellules dans un compteur automatique à l’aide de tryp et d’une solution bleue. Diluez-les à 200 000 cellules par millilitre. Retirer le milieu de culture des dispositifs à base d’agarose.
Semez soigneusement 190 microlitres de suspension cellulaire dans la chambre d’ensemencement cellulaire du micro-moule d’agarose. Incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles se déposent au fond du gel. Ajoutez lentement quatre millilitres de milieu supplémentaire à l’extérieur des gels, en les recouvrant entièrement.
N’oubliez pas de ne pas ajouter le milieu directement sur le gel, mais dans le plat de culture, en évitant d’endommager les sphéroïdes fraîchement formés. Incuber pendant 72 heures à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que des sphéroïdes uniformes se forment. La lignée cellulaire hématologique se développe en flottant librement dans le milieu de culture dans des flacons conçus pour la culture en suspension.
Pour maintenir des propriétés cellulaires optimales, il est recommandé de commencer à préparer l’échantillon au plus tôt 30 minutes avant la procédure de distribution des sphéroïdes à l’aide de la pince optique. Conservez les cellules dans le milieu RPMI 1640 dans des conditions de culture standard. Maintenez les cultures entre 300 et 500 000 cellules par millilitre en passant tous les deux à trois jours.
Pour la manipulation à la pince optique, choisissez des cellules en phase logarithmique. Récupérez les cellules et transférez toute la suspension dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 300 fois la gravité pendant sept minutes.
Retirez le surnageant et comptez les cellules comme décrit précédemment. Diluez la suspension pour atteindre une densité cellulaire finale de 10 000 cellules par millilitre. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à la manipulation optique.
Le protocole que nous présentons ici a été développé spécifiquement pour les pinces optiques sur mesure. Cependant, les systèmes commerciaux deviennent de plus en plus accessibles. Quel que soit le type d’équipement disponible dans votre laboratoire, les étapes de base de la préparation du système et les principes généraux de travail avec les cellules restent les mêmes.
Allumez la source lumineuse du microscope. Portez des lunettes de protection anti-laser. Allumez le laser et réglez la puissance à 100 mégawatts.
Avant de continuer, attendez 10 minutes, en laissant le faisceau laser se stabiliser. Pendant ce temps, démarrez le logiciel de l’ordinateur. Une fois le système prêt, ajoutez 30 microlitres d’eau au centre de l’objectif inférieur.
Placez une parabole de microscopie de 35 millimètres avec un fond en verre sur la platine du microscope. Stabilisez le plat avec les supports. Soulevez l’objectif à l’aide de la vis du microscope micrométrique jusqu’à ce que le cordon d’eau touche le fond en verre de la parabole de microcopie.
À l’aide de la vis du micromètre, ajustez doucement la platine jusqu’à ce qu’il y ait un faisceau laser fortement focalisé sur l’écran. Dans la fenêtre du logiciel, vous verrez une image de l’échantillon de microscope. Utilisez les marqueurs visibles à l’écran pour déplacer le piège optique à l’endroit souhaité.
Ajouter 100 microlitres de suspension de cellules de lymphome préalablement préparée. Laissez-les couler au fond du plat. Cela prendra environ cinq minutes.
À l’aide des mouvements de la platine du microscope, trouvez une cellule de lymphome flottante. Laissez le piège optique toucher l’échantillon en cliquant sur la malédiction du piège. Essayez de déplacer la cellule à l’emplacement souhaité.
Une cellule pour être utile à la manipulation doit être capable de se déplacer facilement dans n’importe quelle direction donnée. Retirez un seul sphéroïde stromal du moule d’agarose à l’aide d’une pointe de pipette et placez-le sur un plat à fond de verre non revêtu. Ajouter deux millilitres de milieu de culture et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.
Pendant ce temps, le sphéroïde se collera doucement au verre, ce qui empêche tout mouvement lors de la manipulation. Placez la parabole contenant le sphéroïde sur la platine du microscope. Ajouter 1000 cellules de lymphome à 100 microlitres de milieu de culture.
Laissez-les couler au fond du plat, ce qui prend environ cinq minutes. Sélectionnez une seule cellule de lymphome et piègez-la à l’aide du faisceau laser. Déplacez le piège optique pour mettre la cellule en contact avec la surface du sphéroïde stromal.
Commencez par attacher la cellule du lymphome au sphéroïde stromal pendant 10 secondes. Ensuite, vérifiez si la cellule est fixée de façon permanente avec trois tentatives répétées de détachement de la cellule du lymphome à l’aide de la pince à épiler optique. Si le contact cellulaire est rompu, fixez à nouveau la cellule du lymphome avec une surface sphéroïde à l’aide du piège optique, cette fois-ci, pendant une période plus longue, d’environ 20 secondes.
Répétez ce processus avec les cellules de lymphome subséquentes jusqu’à ce que toute la surface du sphéroïde stromal soit recouverte de cellules de lymphome. En changeant le plan d’imagerie à l’aide d’une vis de microscope micrométrique, on peut changer la position du piège optique, ce qui permet de déplacer plus profondément les objets piégés dans l’échantillon. Pour une meilleure représentation du sphéroïde formé spontanément, couvrez le cœur des cellules stromales avec deux à trois couches de cellules de lymphome.
Retirez délicatement le milieu de culture et lavez directement le sphéroïde avec 100 microlitres de soluté tampon phosphate. Incuber les sphéroïdes hybrides avec 100 microlitres de PBS contenant une micromole d’ion calcium et deux micromoles d’Ethidium Homodimère-1 pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. À l’aide de la microscopie à fluorescence, observez les sphéroïdes et capturez les images.
Ici, nous avons réussi à reconstruire un sphéroïde hybride humain composé de cellules stromales mésenchymateuses et de cellules de lymphome à l’aide d’une pince optique. Tout d’abord, les sphéroïdes des cellules stromales mésenchymateuses ont été préparés dans un dispositif à micropuits d’agarose, ce qui permet d’obtenir des sphéroïdes relativement uniformes après 72 heures d’incubation. La viabilité des sphéroïdes était supérieure à 98 %Ensuite, les sphéroïdes mésenchymateux ont été utilisés comme noyau de sphéroïdes hybrides nouvellement construits à l’aide d’une pince à épiler.
Les cellules du lymphome ont été piégées individuellement par des pièges optiques et fixées à la surface du sphéroïde stromal. La procédure a été répétée jusqu’à ce que toute la surface du sphéroïde stromal soit recouverte de cellules de lymphome. Nous avons établi que les cellules RI-1 se sont attachées au sphéroïde stromal en 11,67 secondes avec un écart de 3,73 secondes.
Au cours du processus, 65 cellules ont été fixées, ce qui a pris environ une heure et 12 minutes. La coloration des sphéroïdes nouvellement modifiés a montré une grande viabilité des cellules utilisées pour la manipulation, à 93 %. Cet article propose un protocole non invasif pour la formation des sphéroïdes des cellules stromales du lymphome à l’aide d’une pince optique. Cette méthode permet non seulement de construire des sphéroïdes hybrides de novo, mais aussi de contrôler avec précision le nombre de cellules attachées et le moment de la formation de l’adhésion, fournissant ainsi des informations précieuses pour l’ingénierie tissulaire.
De plus, cette approche à la pince optique facilite l’étude des stades précoces de la formation de sphéroïdes à haut risque, ce qui ne peut être réalisé à l’aide de techniques standard en vrac. Plus important encore, notre protocole peut être facilement appliqué à d’autres types de cellules, ce qui permettra à cette approche basée sur des pinces optiques d’être de plus en plus utilisée dans le domaine de la culture cellulaire 3D.
