光ピンセットは、集束レーザービームのみを使用して、ミクロンおよびナノメートルスケールの物体を非侵襲的に物理的に捕捉および操作することを可能にします。このツールは現在、切断細胞を含むさまざまな生物学的構造にうまく適用されています。当研究室では、単一細胞レベルでの直接的な細胞間相互作用を研究し、光ピンセットなどの有望な技術を用いて、この横方向の配置と構造化をさらに治療することを目指しています。
まず、現在の実験的な課題は、光ピンセットを使用したハイブリッドスフェロイドの全プロセスを構築するためのプロトコルがないことです。2つ目は、ハイブリッドスフェロイドの新たな改質の安定化と、その後の実験的処理のための回収です。このプロトコルでは、光ピンセットを使用したハイブリッドリンパ腫スフェロイドの構築を段階的に示します。
この技術の主な利点は、リンパ腫細胞と三次元微小環境との間の直接的な相互作用をリアルタイムで研究する機会であり、これは従来の細胞培養よりも生物学的に関連性があります。重要なことは、ここで紹介する技術は、白血病細胞株やその他の血液病理学的悪性腫瘍に容易に適応できることです。今後は、がん治療薬が引き起こすシングルセル接着の微小な変化を、この手法を用いて研究していく予定です。
この目的のために、患者の腫瘍系統を使用する予定です。まず、マイクロモールドの準備から始めます。マイクロモールド3Dシャーレを脱イオン水ですすぎ、UVラムの下に30分間置いて滅菌します。
まず、アガロース粉末を0.9%塩化ナトリウム溶液にマイクロ波で溶解し、2%アガロース溶液を調製します。アガロースの混合またはピペッティング中に気泡を作らないようにしてください。アガロースを摂氏約70度に冷却します。
次に、以前に滅菌したマイクロモールドに500マイクロリットルのアガロースを充填して、ヒドロゲルを調製します。マイクロモールドの小さな特徴に閉じ込められている可能性のある気泡をピペッティングで取り除きます。15分後、アガロースが固まったら、マイクロモールドからゲルを慎重に取り出し、滅菌済みの6ウェルプレートに移します。
次のステップに進む前に、顕微鏡で確認し、ゲルが正しく調製されていることを確認してください。マイクロモールドを完全に覆うリン酸緩衝生理食塩水を加えてから、プレートをUVランプの下に30分間置き、滅菌を行います。アガロースベースのデバイスを使用してスフェロイドを作製する前に、RPMI培地で完全に覆ってゲルを平衡化し、最低15分間インキュベートします。
HS-5間葉系間質細胞株をRPMI完全培地で標準条件で培養し、48時間ごとに培地を交換するようにします。細胞がコンフルエントの90%に達したら、培地を取り出します。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、トリプシンを使用して培養フラスコの底から細胞を剥離します。
2ミリリットルの培地を追加してトリプシンを停止し、次に15ミリリットルの円錐管に移します。細胞を重力の300倍で7分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞を1ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。
trypと青色溶液を使用して自動カウンターで細胞をカウントします。それらをミリリットルあたり200, 000細胞に希釈します。アガロースベースのデバイスから培地を取り出します。
190マイクロリットルの細胞懸濁液をアガロースマイクロモールドの細胞播種チャンバーに慎重に播種します。細胞がゲルの底に沈殿するまで、細胞を摂氏37度で30分間インキュベートします。ゲルの外側に4ミリリットルの培地をゆっくりと加え、ゲル全体を覆います。
培地をゲルに直接加えるのではなく、培養皿に加えることで、形成したばかりのスフェロイドを傷つけないようにしてください。ユニフォームスフェロイドが形成されるまで、摂氏37度で72時間インキュベートします。血液学的細胞株は、浮遊培養用に設計されたフラスコ内の培養培地中で自由に浮遊して増殖します。
最適な細胞特性を維持するために、光ピンセットを使用して酸請求がスフェロイドを分布させる手順の30分前までにサンプルの準備を開始することをお勧めします。細胞をRPMI 1640培地に標準的な培養条件下で保持します。2〜3日ごとに通過することにより、ミリリットルあたり300〜500、000細胞の培養を維持します。
光ピンセットでの操作には、対数相の細胞を選択します。細胞を収集し、すべての懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を重力の300倍で7分間遠心分離します。
上清を取り除き、前述のように細胞をカウントします。懸濁液を希釈して、最終細胞密度が10, 000細胞/ミリリットルになるようにします。光学的操作まで細胞を摂氏37度に保ちます。
ここで紹介するプロトコルは、特注の光ピンセット用に特別に開発されました。しかし、商用システムはますますアクセスしやすくなっています。ラボで利用可能な機器の種類に関係なく、システム調製の基本的な手順と細胞を扱うための一般原則は同じです。
顕微鏡の光源をオンにします。レーザーセーフの保護メガネを着用してください。レーザーをオンにして、電力を100メガワットに設定します。
先に進む前に、レーザービームが安定するまで10分待ちます。その間に、コンピューターソフトウェアを起動します。システムの準備ができたら、下部の対物レンズの中央に30マイクロリットルの水を追加します。
底がガラスの35mm顕微鏡ディッシュを顕微鏡ステージに置きます。ホルダーで皿を安定させます。マイクロメトリック顕微鏡のネジを使用して、水のビーズがマイクロコピーディッシュのガラス底に触れるまで対物レンズを持ち上げます。
マイクロメーターのネジを使用して、画面に鋭く集束したレーザービームが表示されるまでステージをゆっくりと調整します。ソフトウェアウィンドウに、顕微鏡サンプルの画像が表示されます。画面に表示されるマーカーを使用して、オプティカルトラップを目的の場所に移動します。
100マイクロリットルの事前に調製したリンパ腫細胞懸濁液を追加します。それらを皿の底に沈めます。これには約 5 分かかります。
顕微鏡のステージの動きを使用して、浮遊リンパ腫細胞を見つけます。光トラップがサンプルに当たるようにするには、トラップの罵倒をクリックします。セルを目的の場所に移動してみてください。
操作に役立つセルは、任意の方向に容易に移動できる必要があります。ピペットチップでアガロース型から1つの間質スフェロイドを取り出し、コーティングされていないガラス底皿に置きます。2ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。
この間、回転楕円体はガラスに優しくくっつき、操作中の動きを防ぎます。スフェロイドの入った皿を顕微鏡のステージに置きます。100マイクロリットルの培地に1000個のリンパ腫細胞を加えます。
皿の底に沈め、約5分かかります。リンパ腫細胞を1つ選択し、レーザー光線でトラップします。光学トラップを動かして、細胞を間質スフェロイド表面に接触させます。
まず、リンパ腫細胞を間質スフェロイドに10秒間接着します。次に、光ピンセットを使用してリンパ腫細胞を剥離することを3回繰り返し試みて、細胞が永続的に付着しているかどうかを確認します。細胞の接触が切断された場合は、光学トラップを使用してリンパ腫細胞をスフェロイド表面に再度取り付けます(今回は、約20秒間)延長します。
間質スフェロイドの表面全体がリンパ腫細胞で覆われるまで、後続のリンパ腫細胞でこのプロセスを繰り返します。マイクロメトリック顕微鏡のネジで撮像面を変えることで、光トラップの位置を変えることができ、トラップされた物体をより深く試料内に移動することができます。自発的に形成されたスフェロイドをより適切に表現するには、間質細胞のコアを2〜3層のリンパ腫細胞で覆います。
培地を静かに取り出し、スフェロイドを100マイクロリットルのリン酸緩衝液溶質で直接洗浄します。ハイブリッドスフェロイドを、1マイクロモルのカルシウムイオンと2マイクロモルのEthidium Homodimer-1を含む100マイクロリットルのPBSと37°Cで20分間インキュベートします。蛍光顕微鏡を用いて、スフェロイドを観察し、画像を撮影します。
本研究では、間葉系間質細胞とリンパ腫細胞からなるヒトハイブリッドスフェロイドを、光ピンセットを用いて再構築することに成功しました。まず、間葉系間質細胞スフェロイドをアガロースマイクロウェルデバイスで調製したところ、72時間のインキュベーション後に比較的均一なスフェロイドが得られました。スフェロイドの生存率は98%以上であった次に、光ピンセットを使用して、間葉系スフェロイドを新たに構築されたハイブリッドスフェロイドのコアとして使用しました。
リンパ腫細胞を個々に光学トラップで捕捉し、間質スフェロイドの表面に付着させた。この手順は、間質スフェロイドの表面全体がリンパ腫細胞で覆われるまで繰り返されました。RI-1細胞が間質スフェロイドに11.67秒で付着し、3.73秒の偏差があることを立証しました。
このプロセスでは、65個の細胞が付着し、約1時間12分かかりました。新たに改変されたスフェロイドの生死染色は、操作に使用された細胞の高い生存率を示し、93%この論文は、光ピンセットを使用したリンパ腫間質細胞スフェロイドの形成のための非侵襲的プロトコルを提案しています。この手法は、ハイブリッドスフェロイドをde novoで構築するだけでなく、付着細胞の数や接着形成のタイミングを精密に制御することが可能となり、組織工学に貴重な知見を提供します。
さらに、この光ピンセットアプローチは、標準的なバルク技術では達成できない高リスクのスフェロイド形成の初期段階の研究を容易にします。最も重要なことは、私たちのプロトコルは他の細胞タイプにも簡単に適用できるため、この光ピンセットベースのアプローチが3D細胞培養の分野でますます採用されるようになることです。
