Die optische Pinzette ermöglicht das physikalische Einfangen und Manipulieren von Objekten im Mikrometer- und Nanometerbereich nicht-invasiv mit nur fokussiertem Laserstrahl. Dieses Werkzeug wird nun erfolgreich auf verschiedene biologische Strukturen angewendet, unter anderem auf die Spaltung von Zellen. Unser Labor zielt darauf ab, die direkte Zell-Zell-Interaktion auf Einzelzellebene zu untersuchen und diese laterale Anordnung und Strukturierung mit den vielversprechenden Techniken wie der optischen Pinzette weiter zu behandeln.
Erstens besteht die derzeitige experimentelle Herausforderung darin, dass es kein Protokoll für die Konstruktion von Hybrid-Sphäroiden mit einer optischen Pinzette für den gesamten Prozess gibt. Zweitens die Stabilisierung einer neuen Reform bei hybriden Sphäroiden und deren Rückgewinnung für die anschließende experimentelle Verarbeitung. In diesem Protokoll zeigen wir Schritt für Schritt den Aufbau eines hybriden Lymphom-Sphärodes mit Hilfe einer optischen Pinzette.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, die direkten Wechselwirkungen zwischen Lymphomzellen und der dreidimensionalen Mikroumgebung in Echtzeit zu untersuchen, was biologisch relevanter ist als herkömmliche Zellkulturen. Wichtig ist, dass die hier vorgestellte Technik leicht an Leukämiezelllinien und andere hämatopathologische Malignome angepasst werden kann. Wir planen, mit unseren Methoden die winzigen Veränderungen der Einzelzelladhäsion zu untersuchen, die durch Krebsmedikamente induziert werden.
Zu diesem Zweck beabsichtigen wir, die Tumorlinie eines Patienten zu verwenden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikroform. Spülen Sie die 3D-Petrischale mit Mikroformen in entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie 30 Minuten lang unter ein UV-Lamm, um die Sterilisation durchzuführen.
Bereiten Sie zunächst 2%ige Agaroselösung vor, indem Sie das Agarosepulver in einer Mikrowelle in 0,9%iger Natriumchloridlösung auflösen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Mischen oder Pipettieren von Agarose. Agarose auf ca. 70 Grad Celsius abkühlen lassen.
Bereiten Sie anschließend Hydrogele vor, indem Sie zuvor sterilisierte Mikroformen mit 500 Mikrolitern Agarose füllen. Entfernen Sie durch Pipettieren alle Blasen, die in den kleinen Merkmalen einer Mikroform eingeschlossen sein könnten. Nach 15 Minuten, wenn die Agarose fest geworden ist, nehmen Sie die Gele vorsichtig aus Mikroformen und geben Sie sie auf eine sterile Sechs-Well-Platte.
Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob das Gel korrekt hergestellt wurde. Fügen Sie Phosphatpuffer-Kochsalzlösung hinzu, die die Mikroformen vollständig bedeckt, bevor Sie die Platte 30 Minuten lang unter eine UV-Lampe legen, um die Sterilisation durchzuführen. Bevor Sie die auf Agarose basierenden Geräte zur Herstellung von Sphäroiden verwenden, äquilibrieren Sie das Gel, indem Sie sie vollständig mit RPMI-Medium bedecken und mindestens 15 Minuten lang inkubieren.
Kultur der HS-5-mesenchymalen Stromazelllinie in RPMI-Komplettkulturmedium unter Standardbedingungen, wobei ein Wechsel des Mediums alle 48 Stunden gewährleistet ist. Wenn die Zellen 90 % der Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium. Die Zellen werden mit Kochsalzlösung aus Phosphatpuffer gewaschen und mit Trypsin vom Boden des Kulturkolbens gelöst.
Stoppen Sie das Trypsin, indem Sie zwei Milliliter Nährmedium hinzufügen und diese dann in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Kulturmedium.
Zählen Sie die Zellen im automatischen Zähler mit Tryp und blauer Lösung. Verdünnen Sie sie auf 200.000 Zellen pro Milliliter. Entfernen Sie das Nährmedium von Geräten auf Agarosebasis.
Säen Sie vorsichtig 190 Mikroliter Zellsuspension in die Zellaussaatkammer des Agarose-Mikroschimmels. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen am Boden des Gels absetzen. Geben Sie langsam vier Milliliter zusätzliches Medium auf die Außenseite der Gele und bedecken Sie sie vollständig.
Denken Sie daran, das Medium nicht direkt auf das Gel, sondern in die Kulturschale zu geben, um eine Beschädigung der frisch gebildeten Sphäroide zu vermeiden. 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis sich einheitliche Sphäroide bilden. Die hämatologische Zelllinie wächst frei schwebend in den Nährmedien in Kolben, die für die Suspensionskultur ausgelegt sind.
Um optimale Zelleigenschaften zu erhalten, wird empfohlen, mit der Vorbereitung der Probe frühestens 30 Minuten vor dem Verfahren der Säureabrechnung zu beginnen, um die Sphäroide mit der optischen Pinzette zu verteilen. Bewahren Sie die Zellen im RPMI 1640-Medium unter Standardkulturbedingungen auf. Pflegen Sie Kulturen zwischen 300 und 500.000 Zellen pro Milliliter, indem Sie sie alle zwei bis drei Tage passieren.
Für die Manipulation in einer optischen Pinzette wählen Sie Zellen in der logarithmischen Phase. Sammeln Sie die Zellen und geben Sie die gesamte Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft.
Entfernen Sie den Überstand und zählen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben. Verdünnen Sie die Suspension, um eine endgültige Zelldichte von 10.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Halten Sie die Zellen bis zur optischen Manipulation bei 37 Grad Celsius.
Das Protokoll, das wir hier vorstellen, wurde speziell für die speziell angefertigten optischen Pinzetten entwickelt. Kommerzielle Systeme werden jedoch immer zugänglicher. Unabhängig davon, welche Art von Ausrüstung in Ihrem Labor zur Verfügung steht, bleiben die grundlegenden Schritte der Systemvorbereitung und die allgemeinen Prinzipien der Arbeit mit Zellen gleich.
Schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops ein. Tragen Sie eine lasersichere Schutzbrille. Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie die Leistung auf 100 Megawatt ein.
Bevor Sie fortfahren, warten Sie 10 Minuten, damit sich der Laserstrahl stabilisieren kann. Starten Sie in der Zwischenzeit die Computersoftware. Sobald das System fertig ist, geben Sie 30 Mikroliter Wasser in die Mitte des unteren Objektivs.
Stellen Sie eine 35-Millimeter-Mikroskopieschale mit Glasboden auf den Mikroskoptisch. Stabilisieren Sie die Form mit den Haltern. Heben Sie das Objektiv mit der mikrometrischen Mikroskopschraube an, bis die Wasserperle den Glasboden der Mikroskopschüssel berührt.
Stellen Sie den Tisch mit der Mikrometerschraube vorsichtig ein, bis ein scharf fokussierter Laserstrahl auf dem Bildschirm zu sehen ist. Im Software-Fenster sehen Sie ein Bild der Mikroskopprobe. Verwenden Sie die auf dem Bildschirm sichtbaren Markierungen, um die optische Falle an die gewünschte Stelle zu verschieben.
Fügen Sie 100 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Lymphomzellsuspension hinzu. Lassen Sie sie auf den Boden der Schüssel sinken. Dies dauert etwa fünf Minuten.
Finden Sie mit den Bewegungen des Mikroskoptisches eine schwebende Lymphomzelle. Lassen Sie die optische Falle auf die Probe treffen, indem Sie auf die fluchende Falle klicken. Versuchen Sie, die Zelle an die gewünschte Stelle zu verschieben.
Eine Zelle, die für die Manipulation nützlich ist, sollte in der Lage sein, sich leicht in jede beliebige Richtung zu bewegen. Nehmen Sie mit einer Pipettenspitze ein einzelnes Stroma-Sphäroid aus der Agaroseform und legen Sie es auf eine unbeschichtete Glasbodenschale. Fügen Sie zwei Milliliter Nährmedium hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Während dieser Zeit haftet das Sphäroid sanft am Glas, wodurch eine Bewegung während der Manipulation verhindert wird. Stellen Sie die Schale mit dem Sphäroid auf den Mikroskoptisch. Geben Sie 1000 Lymphomzellen in 100 Mikroliter Kulturmedium.
Lassen Sie sie etwa fünf Minuten lang auf den Boden der Schüssel sinken. Wählen Sie eine einzelne Lymphomzelle aus und fangen Sie sie mit dem Laserstrahl ein. Bewegen Sie die optische Falle, um die Zelle in Kontakt mit der stromalen Sphäroidoberfläche zu bringen.
Beginnen Sie damit, die Lymphomzelle 10 Sekunden lang an das Stromasphäroid zu binden. Überprüfen Sie als nächstes, ob die Zelle dauerhaft befestigt ist, indem Sie dreimal wiederholt versuchen, die Lymphomzelle mit der optischen Pinzette zu lösen. Wenn der Zellkontakt unterbrochen ist, befestigen Sie die Lymphomzelle erneut mit der optischen Falle an einer sphäroiden Oberfläche, diesmal für einen längeren Zeitraum, etwa 20 Sekunden.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit nachfolgenden Lymphomzellen, bis die gesamte Oberfläche des Stroma-Sphäroids von Lymphomzellen bedeckt ist. Durch Wechseln der Bildgebungsebene mit einer mikrometrischen Mikroskopschraube kann die Position der optischen Falle geändert werden, was eine tiefere Bewegung der gefangenen Objekte in die Probe ermöglicht. Für eine bessere Darstellung des spontan gebildeten Sphäroids bedecken Sie den Kern der Stromazellen mit zwei bis drei Schichten Lymphomzellen.
Entfernen Sie vorsichtig das Nährmedium und waschen Sie das Sphäroid direkt mit 100 Mikrolitern gelöstem Phosphatpuffer. Inkubieren Sie die Hybrid-Sphäroide mit 100 Mikrolitern PBS, die ein Mikromol Calcium-Ionen und zwei Mikromol Ethidium Homodimer-1 enthalten, für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die Sphäroide und nehmen Sie die Bilder auf.
Hier ist es uns gelungen, ein humanes Hybrid-Sphäroid bestehend aus mesenchymalen Stromazellen und Lymphomzellen mit Hilfe einer optischen Pinzette zu rekonstruieren. Zunächst wurden die Sphäroide der mesenchymalen Stromazellen in einer Agarose-Mikrotitervorrichtung präpariert, was nach 72 Stunden Inkubation zu relativ gleichmäßigen Sphäroiden führt. Die Lebensfähigkeit von Sphäroiden war höher als 98%Als nächstes wurden mesenchymale Sphäroide als Kern für neu konstruierte Hybrid-Sphäroide mit Hilfe einer optischen Pinzette verwendet.
Die Lymphomzellen wurden einzeln durch optische Fallen gefangen und an der Oberfläche des Stroma-Sphärodes befestigt. Der Eingriff wurde so lange wiederholt, bis die gesamte Oberfläche des stromalen Sphäroids mit Lymphomzellen bedeckt war. Wir stellten fest, dass sich die RI-1-Zellen in 11,67 Sekunden mit einer Abweichung von 3,73 Sekunden an den Stroma-Sphäroid anhefteten.
Während des Prozesses wurden 65 Zellen angehängt, was etwa eine Stunde und 12 Minuten dauerte. Die Lebendto-Färbung von neu entwickelten Sphäroiden zeigte eine hohe Lebensfähigkeit von Zellen, die für die Manipulation verwendet wurden, bei 93%Dieser Artikel schlägt ein nicht-invasives Protokoll für die Bildung von Lymphom-Stromazell-Sphäroiden mit einer optischen Pinzette vor. Diese Methode konstruiert nicht nur hybride Sphäroide de novo, sondern ermöglicht auch eine präzise Kontrolle über die Anzahl der angehängten Zellen und den Zeitpunkt der Adhäsionsbildung, was wertvolle Erkenntnisse für das Tissue Engineering liefert.
Darüber hinaus erleichtert dieser Ansatz der optischen Pinzette die Untersuchung eines frühen Stadiums der Sphäroidbildung mit hohem Risiko, die mit Standard-Bulk-Techniken nicht erreicht werden kann. Am wichtigsten ist, dass unser Protokoll leicht auf andere Zelltypen angewendet werden kann, was es ermöglicht, dass dieser auf optischen Pinzetten basierende Ansatz zunehmend im Bereich der 3D-Zellkultur eingesetzt wird.
