שימוש בפינצטה אופטית ליצירת ספרואידים היברידיים

פינצטה אופטית מאפשרת לכידה פיזית ומניפולציה של עצמים בקנה מידה מיקרוני וננומטרי באופן לא פולשני באמצעות קרן לייזר ממוקדת בלבד. כלי זה מיושם כעת בהצלחה על מבנים ביולוגיים שונים, כולל תאים מפוצלים. המעבדה שלנו שואפת לחקור את האינטראקציה הישירה בין תא לתא ברמת התא הבודד ולהמשיך לטפל בסידור רוחבי זה באמצעות טכניקות מבטיחות כגון פינצטה אופטית.

ראשית, האתגר הניסויי הנוכחי הוא היעדר פרוטוקול לבניית ספרואידים היברידיים באמצעות פינצטה אופטית לכל התהליך. השני הוא ייצוב רפורמה חדשה בספרואידים היברידיים ואחזורם לעיבוד ניסיוני לאחר מכן. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים צעד אחר צעד את הבנייה של ספרואיד לימפומה היברידי באמצעות פינצטה אופטית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההזדמנות לחקור את האינטראקציות הישירות בין תאי לימפומה למיקרו-סביבה התלת מימדית בזמן אמת, שהיא רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית מתרבית תאים מסורתית. חשוב לציין, הטכניקה המוצגת כאן ניתנת להתאמה בקלות לקווי תאי לוקמיה ולממאירויות המטופתולוגיות אחרות. אנו מתכננים להשתמש בשיטות שלנו כדי לחקור את השינויים הזעירים בהידבקות של תא בודד הנגרמת על ידי תרופות לסרטן.

בכוונתנו להשתמש בשושלת הגידול של המטופל למטרה זו. התחל בהכנת המיקרו-תבנית. שוטפים צלחת פטרי תלת מימדית מיקרו-תבנית במים נטולי יונים, ומניחים אותה מתחת לכבש UV למשך 30 דקות לביצוע עיקור.

ראשית, הכינו תמיסת אגרוז 2% על ידי המסת אבקת האגרוז בתמיסת נתרן כלורי 0.9% באמצעות מיקרוגל. הימנע מיצירת בועות בזמן ערבוב או פיפטינג אגרוז. אגרוז מצננים לכ-70 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הכינו הידרוג'לים על ידי מילוי תבניות מיקרו מעוקרות בעבר ב -500 מיקרוליטר אגרוז. הסר את כל הבועות שעלולות להילכד בתכונות הקטנות של מיקרו-תבנית על ידי פיפטינג. לאחר 15 דקות, כאשר האגרוז התמצק, הוציאו בזהירות את הג'לים מתבניות המיקרו לצלחת סטרילית של שש בארות.

לפני שתמשיך לשלב הבא, בדוק במיקרוסקופ, וודא שהג'ל הוכן כהלכה. הוסף מלח חיץ פוספט המכסה לחלוטין את המיקרו-תבניות לפני הנחת הצלחת מתחת למנורת UV למשך 30 דקות לביצוע עיקור. לפני השימוש במכשירים מבוססי אגרוז לייצור ספרואידים, יש לאזן את הג'ל על ידי כיסויים לחלוטין במדיום RPMI ולדגור למשך 15 דקות לפחות.

תרבית קו תאי הסטרומה המזנכימלי HS-5 במדיום תרבית שלם RPMI בתנאים סטנדרטיים, מה שמבטיח החלפת מדיום כל 48 שעות. כאשר התאים מגיעים ל -90% מהמפגש, הסר את אמצעי התרבית. שטפו תאים עם מי מלח מאגר פוספט ונתקו אותם מתחתית בקבוק התרבות באמצעות טריפסין.

עצור את הטריפסין על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום תרבית, ואז העביר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. תאי צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 300 למשך שבע דקות. הסר סופרנטנט והשהה מחדש תאים במיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי.

ספור תאים במונה אוטומטי באמצעות תמיסה TRYP וכחולה. מדללים אותם ל -200,000 תאים למיליליטר. הסר את מדיום התרבות ממכשירים מבוססי אגרוז.

זרעו בזהירות 190 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך תא הזריעה של מיקרו-עובש אגרוז. דגרו על תאים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתייצבים בתחתית הג'ל. הוסף לאט לאט ארבעה מיליליטר של מדיום נוסף לחלק החיצוני של הג'לים, וכסה אותם לחלוטין.

זכרו לא להוסיף את המדיום ישירות על הג'ל, אלא לכלי התרבות, ולהימנע מפגיעה בכדורים הטריים שנוצרו. דגירה למשך 72 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס עד שנוצרים ספרואידים אחידים. קו תאים המטולוגי גדל צף בחופשיות באמצעי התרבות בצלוחיות המיועדות לתרבית תרחיף.

כדי לשמור על תכונות תא אופטימליות, מומלץ להתחיל להכין את הדגימה לא לפני 30 דקות לפני שהליך חיוב החומצה מפיץ ספרואידים באמצעות הפינצטה האופטית. שמור על תאים במדיום RPMI 1640 בתנאי תרבית סטנדרטיים. שמור על תרביות בין 300 ל -500, 000 תאים למיליליטר על ידי מעבר כל יומיים-שלושה.

למניפולציה בפינצטה אופטית, בחר תאים בשלב הלוגריתמי. אוספים את התאים ומעבירים את כל המתלים לצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בעוצמה של פי 300 מכוח הכבידה למשך שבע דקות.

הסר את הסופרנטנט וספירת התאים כפי שתואר קודם לכן. מדלל את התרחיף כדי להגיע לצפיפות תאים סופית של 10,000 תאים למיליליטר. שמור על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למניפולציה אופטית.

הפרוטוקול שאנו מציגים כאן פותח במיוחד עבור הפינצטה האופטית המותאמת אישית. עם זאת, מערכות מסחריות הופכות לנגישות יותר ויותר. לא משנה איזה סוג ציוד זמין במעבדה שלך, השלבים הבסיסיים של הכנת המערכת והעקרונות הכלליים של עבודה עם תאים נשארים זהים.

הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ. הרכיבו משקפי מגן בטוחים בלייזר. הפעל את הלייזר והגדר את ההספק על 100 מגה-וואט.

לפני שתמשיך, המתן 10 דקות, ואפשר לקרן הלייזר להתייצב. בינתיים, הפעל את תוכנת המחשב. לאחר שהמערכת מוכנה, הוסף 30 מיקרוליטר מים למרכז המטרה התחתונה.

מניחים צלחת מיקרוסקופיה 35 מילימטר עם תחתית זכוכית על במת המיקרוסקופ. ייצב את המנה עם המחזיקים. הרם את המטרה באמצעות בורג המיקרוסקופ המיקרומטרי עד שחרוז המים נוגע בתחתית הזכוכית של צלחת המיקרוקופי

בעזרת בורג המיקרומטר, כוונן בעדינות את ה-stage עד שתהיה קרן לייזר ממוקדת בחדות על המסך. בחלון התוכנה תראה תמונה של דגימת המיקרוסקופ. השתמשו בסמנים הגלויים על המסך כדי להזיז את ההשמנה האופטית במיקום הרצוי.

הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי לימפומה שהוכן בעבר. תן להם לשקוע לתחתית המנה. זה ייקח בערך חמש דקות.

בעזרת תנועות שלב המיקרוסקופ, מצא תא לימפומה צף. אפשר למלכודת האופטית לפגוע בדגימה על ידי לחיצה על קללת המלכודת. נסה להעביר את התא למיקום הרצוי.

תא שיהיה שימושי למניפולציה צריך להיות מסוגל לנוע בקלות לכל כיוון נתון. מוציאים כדור סטרומלי בודד מתבנית האגרוז בעזרת קצה פיפטה ומניחים אותו על צלחת תחתית זכוכית לא מצופה. מוסיפים שני מיליליטר מדיום תרבית ודוגרים למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

במהלך תקופה זו, הכדור יידבק בעדינות לזכוכית, מה שמונע תנועה במהלך המניפולציה. מניחים את המנה המכילה את הכדור על במת המיקרוסקופ. הוסף 1000 תאי לימפומה ל -100 מיקרוליטר של מדיום תרבית.

תן להם לשקוע לתחתית המנה, לוקח כחמש דקות. בחר תא לימפומה בודד ולוכד אותו באמצעות קרן הלייזר. הזז את המלכודת האופטית כדי להעביר את התא למגע עם המשטח הספרואידי.

התחל בהצמדת תא הלימפומה לספרואיד הסטרומלי למשך 10 שניות. לאחר מכן, בדוק אם התא מחובר לצמיתות בשלושה ניסיונות חוזרים ונשנים לנתק את תא הלימפומה באמצעות הפינצטה האופטית. אם המגע הסלולרי נשבר, חבר את תא הלימפומה עם משטח ספרואיד פעם נוספת באמצעות המלכודת האופטית, הפעם, לפרק זמן ארוך יותר, כ -20 שניות.

חזור על תהליך זה עם תאי לימפומה שלאחר מכן עד שכל פני השטח של הספרואיד הסטרומלי מכוסים בתאי לימפומה. על ידי שינוי מישור ההדמיה באמצעות בורג מיקרוסקופ מיקרומטרי, ניתן לשנות את מיקום המלכודת האופטית, המאפשרת תנועה עמוקה יותר של עצמים לכודים לתוך הדגימה. לייצוג טוב יותר של הספרואיד שנוצר באופן ספונטני, יש לכסות את ליבת תאי הסטרומה בשתיים עד שלוש שכבות של תאי לימפומה.

הסר בעדינות את מדיום התרבות ושטוף ישירות את הכדור עם 100 מיקרוליטר מומס חיץ פוספט. דגרו על הספרואידים ההיברידיים עם 100 מיקרוליטר PBS המכילים מיקרומול אחד של יון סידן ושתי מיקרומול של אתידיום הומודימר-1 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בספרואידים וצלם את התמונות.

כאן, שחזרנו בהצלחה ספרואיד היברידי אנושי המורכב מתאי סטרומה מזנכימליים ותאי לימפומה באמצעות פינצטה אופטית. ראשית, הספרואידים של תאי סטרומה מזנכימליים הוכנו במכשיר מיקרו-באר אגרוז, מה שמביא לספרואידים אחידים יחסית לאחר 72 שעות דגירה. הכדאיות של ספרואידים הייתה גבוהה מ-98%לאחר מכן, ספרואידים מזנכימליים שימשו כגרעין של ספרואידים היברידיים שנבנו לאחרונה באמצעות פינצטה אופטית.

תאי לימפומה נלכדו בנפרד על ידי מלכודות אופטיות והוצמדו לפני השטח של הספרואיד הסטרומלי. ההליך חזר על עצמו עד שכל פני השטח של הספרואיד הסטרומלי כוסו בתאי לימפומה. קבענו שתאי RI-1 התחברו לספרואיד הסטרומלי תוך 11.67 שניות עם סטייה של 3.73 שניות.

במהלך התהליך חוברו 65 תאים, שארכו כשעה ו-12 דקות. צביעה חיה של ספרואידים מהונדסים לאחרונה הראתה כדאיות גבוהה של תאים המשמשים למניפולציה, ב-93%מאמר זה מציע פרוטוקול לא פולשני ליצירת ספרואידים של תאי סטרומה לימפומה באמצעות פינצטה אופטית. שיטה זו לא רק בונה ספרואידים היברידיים דה נובו, אלא גם מאפשרת שליטה מדויקת על מספר התאים המחוברים ותזמון היווצרות ההידבקות, ומספקת תובנה חשובה להנדסת רקמות.

יתר על כן, גישת פינצטה אופטית זו מקלה על חקר השלב המוקדם של היווצרות ספרואידים בסיכון גבוה, שלא ניתן להשיג באמצעות טכניקות בתפזורת סטנדרטיות. והכי חשוב, ניתן ליישם את הפרוטוקול שלנו בקלות על סוגי תאים אחרים, מה שיאפשר לגישה זו המבוססת על פינצטה אופטית להיות מיושמת יותר ויותר בתחום תרבית תאים תלת מימדית.