As pinças ópticas permitem o aprisionamento físico e a manipulação de objetos em escala de mícrons e nanômetros de forma não invasiva usando apenas feixes de laser focados. Esta ferramenta agora é aplicada com sucesso a várias estruturas biológicas, incluindo células clivadas. Nosso laboratório tem como objetivo investigar a interação direta célula-célula no nível de célula única e tratar ainda mais esse arranjo lateral e estruturação usando técnicas promissoras, como pinças ópticas.
Primeiro, o desafio experimental atual é a falta do protocolo para construção de esferoides híbridos usando pinças ópticas para todo o processo. A segunda é a estabilização da nova reforma em esferoides híbridos e sua recuperação para processamento experimental subsequente. Neste protocolo, demonstramos passo a passo a construção de um esferóide de linfoma híbrido com o uso de pinças ópticas.
A principal vantagem dessa técnica é a oportunidade de estudar as interações diretas entre as células do linfoma e o microambiente tridimensional em tempo real, o que é mais biologicamente relevante do que a cultura celular tradicional. É importante ressaltar que a técnica apresentada aqui pode ser facilmente adaptada a linhagens celulares de leucemia e outras malignidades hematopatológicas. Planejamos usar nossos métodos para estudar as mudanças mínimas na adesão de uma única célula induzidas por medicamentos contra o câncer.
Pretendemos usar a linhagem tumoral de um paciente para esse fim. Comece preparando o micromolde. Enxágue a placa de Petri 3D micro-molde em água deionizada e coloque-a sob um cordeiro UV por 30 minutos para realizar a esterilização.
Primeiro, prepare a solução de agarose a 2% dissolvendo o pó de agarose em solução de cloreto de sódio a 0,9% usando um micro-ondas. Evite criar bolhas ao misturar ou pipetar agarose. Resfrie a agarose a aproximadamente 70 graus Celsius.
Em seguida, prepare os hidrogéis enchendo micro-moldes previamente esterilizados com 500 microlitros de agarose. Remova quaisquer bolhas que possam estar presas nas pequenas características de um micromolde pipetando. Após 15 minutos, quando a agarose estiver solidificada, remova cuidadosamente os géis dos micromoldes para uma placa estéril de seis poços.
Antes de prosseguir para a próxima etapa, verifique ao microscópio e confirme se o gel foi preparado corretamente. Adicione solução salina tampão fosfato cobrindo completamente os micro-moldes antes de colocar a placa sob uma lâmpada UV por 30 minutos para realizar a esterilização. Antes de usar os dispositivos à base de agarose para produzir esferóides, equilibre o gel cobrindo-os completamente em meio RPMI e incube por no mínimo 15 minutos.
Cultura da linhagem de células estromais mesenquimais HS-5 em meio de cultura completo RPMI em condições padrão, garantindo uma troca de meio a cada 48 horas. Quando as células atingirem 90% de confluência, remova os meios de cultura. Lave as células com solução salina tampão fosfato e retire-as do fundo do frasco de cultura usando tripsina.
Pare a tripsina adicionando dois mililitros de meio de cultura e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 300 vezes a gravidade por sete minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender as células num mililitro de meio de cultura fresco.
Conte as células no contador automático usando tryp e solução azul. Dilua-os para 200.000 células por mililitro. Remova o meio de cultura dos dispositivos à base de agarose.
Semeie cuidadosamente 190 microlitros de suspensão celular na câmara de semeadura celular do micromolde de agarose. Incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius até que as células se assentem no fundo do gel. Adicione lentamente quatro mililitros de meio adicional na parte externa dos géis, cobrindo-os inteiramente.
Lembre-se de não adicionar o meio diretamente no gel, mas na placa de cultura, evitando danificar os esferóides recém-formados. Incubar por 72 horas a 37 graus Celsius até que os esferoides uniformes sejam formados. A linhagem celular hematológica cresce flutuando livremente nos meios de cultura em frascos projetados para cultura em suspensão.
Para manter as propriedades celulares ideais, recomenda-se iniciar a preparação da amostra não antes de 30 minutos antes do procedimento de faturamento ácido distribuir esferóides usando a pinça óptica. Manter as células em meio RPMI 1640 em condições de cultura padrão. Manter culturas entre 300 e 500.000 células por mililitro, passando a cada dois ou três dias.
Para manipulação em pinças ópticas, escolha células na fase logarítmica. Recolher as células e transferir toda a suspensão para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue as células a 300 vezes a gravidade por sete minutos.
Remova o sobrenadante e conte as células conforme descrito anteriormente. Diluir a suspensão até atingir uma densidade celular final de 10 000 células por mililitro. Mantenha as células a 37 graus Celsius até a manipulação óptica.
O protocolo que apresentamos aqui foi desenvolvido especificamente para as pinças ópticas personalizadas. No entanto, os sistemas comerciais estão se tornando cada vez mais acessíveis. Independentemente do tipo de equipamento disponível em seu laboratório, as etapas básicas de preparação do sistema e os princípios gerais de trabalho com células permanecem os mesmos.
Ligue a fonte de luz do microscópio. Use óculos de proteção à prova de laser. Ligue o laser e defina a potência em 100 megawatts.
Antes de prosseguir, aguarde 10 minutos, permitindo que o feixe de laser se estabilize. Enquanto isso, inicie o software do computador. Quando o sistema estiver pronto, adicione 30 microlitros de água ao centro da objetiva inferior.
Coloque uma placa de microscopia de 35 milímetros com fundo de vidro no microscópio stage. Estabilize o prato com os suportes. Levante a objetiva usando o parafuso micrométrico do microscópio até que a gota de água toque o fundo de vidro do prato de microcópia.
Usando o parafuso do micrômetro, ajuste suavemente a platina até que haja um feixe de laser bem focado na tela. Na janela do software, você verá uma imagem da amostra do microscópio. Use os marcadores visíveis na tela para mover a armadilha óptica no local desejado.
Adicione 100 microlitros de suspensão de células de linfoma previamente preparadas. Deixe-os afundar no fundo do prato. Isso levará aproximadamente cinco minutos.
Usando os movimentos do estágio do microscópio, encontre uma célula de linfoma flutuante. Permita que a armadilha óptica atinja a amostra clicando na maldição da armadilha. Tente mover a célula para o local desejado.
Uma célula para ser útil para manipulação deve ser capaz de se mover facilmente em qualquer direção. Remova um único esferóide estromal do molde de agarose com uma ponta de pipeta e coloque-o em um prato com fundo de vidro não revestido. Adicione dois mililitros de meio de cultura e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius.
Durante esse tempo, o esferóide grudará suavemente no vidro, o que impede o movimento durante a manipulação. Coloque o prato contendo o esferóide no microscópio stage. Adicione 1000 células de linfoma a 100 microlitros de meio de cultura.
Deixe-os afundar no fundo do prato, levando aproximadamente cinco minutos. Selecione uma única célula de linfoma e prenda-a usando o feixe de laser. Mova a armadilha óptica para colocar a célula em contato com a superfície esferóide estromal.
Comece anexando a célula do linfoma ao esferóide estromal por 10 segundos. Em seguida, verifique se a célula está permanentemente ligada com três tentativas repetidas de desprender a célula do linfoma usando a pinça óptica. Se o contato celular for interrompido, prenda a célula do linfoma com uma superfície esferóide mais uma vez usando a armadilha óptica, desta vez, por um longo período de tempo, aproximadamente 20 segundos.
Repita esse processo com células de linfoma subsequentes até que toda a superfície do esferóide estromal seja coberta por células de linfoma. Ao alterar o plano de imagem usando o parafuso micrométrico do microscópio, pode-se alterar a posição da armadilha óptica, o que permite o movimento de objetos presos mais profundamente na amostra. Para uma melhor representação do esferóide formado espontaneamente, cubra o núcleo das células estromais com duas a três camadas de células do linfoma.
Remova suavemente o meio de cultura e lave diretamente o esferóide com 100 microlitros de soluto tampão fosfato. Incube os esferóides híbridos com 100 microlitros de PBS contendo um micromol de íon cálcio e dois micromoles de Etídio Homodímero-1 por 20 minutos a 37 graus Celsius. Usando microscopia de fluorescência, observe os esferóides e capture as imagens.
Aqui, reconstruímos com sucesso um esferóide híbrido humano consistindo de células estromais mesenquimais e células de linfoma com o uso de pinças ópticas. Primeiro, os esferoides das células estromais mesenquimais foram preparados em um dispositivo de micropoço de agarose, o que resulta em esferoides relativamente uniformes após 72 horas de incubação. A viabilidade dos esferoides foi superior a 98%Em seguida, os esferoides mesenquimais foram usados como núcleo de esferoides híbridos recém-construídos com o uso de pinças ópticas.
As células do linfoma foram aprisionadas individualmente por armadilhas ópticas e presas à superfície do esferóide estromal. O procedimento foi repetido até que toda a superfície do esferóide estromal estivesse coberta por células de linfoma. Estabelecemos que as células RI-1 se ligaram ao esferóide estromal em 11,67 segundos com um desvio de 3,73 segundos.
Durante o processo, 65 células foram fixadas, levando aproximadamente uma hora e 12 minutos. A coloração de mortos-vivos de esferoides recém-projetados mostrou uma alta viabilidade das células usadas para manipulação, em 93%Este artigo propõe um protocolo não invasivo para a formação de esferoides de células estromais de linfoma usando pinças ópticas. Este método não apenas constrói esferoides híbridos de novo, mas também permite um controle preciso sobre o número de células ligadas e o tempo de formação da adesão, fornecendo informações valiosas para a engenharia de tecidos.
Além disso, essa abordagem de pinças ópticas facilita o estudo do estágio inicial de formação de esferóides de alto risco, que não pode ser alcançado usando técnicas padrão em massa. Mais importante ainda, nosso protocolo pode ser facilmente aplicado a outros tipos de células, o que permitirá que essa abordagem baseada em pinças ópticas se torne cada vez mais empregada no campo da cultura de células 3D.
