광학 핀셋을 사용하면 집속 레이저 빔만 사용하여 미크론 및 나노미터 크기의 물체를 비침습적으로 물리적으로 포획하고 조작할 수 있습니다. 이 도구는 이제 세포를 절단하는 것을 포함한 다양한 생물학적 구조에 성공적으로 적용되고 있습니다. 우리 연구실은 단일 세포 수준에서 직접적인 세포-세포 상호 작용을 조사하고 광학 핀셋과 같은 유망한 기술을 사용하여 이러한 측면 배열 및 구조를 추가로 처리하는 것을 목표로 합니다.
첫째, 현재 실험적 과제는 전체 공정에 광학 핀셋을 사용하여 하이브리드 스페로이드를 구성하기 위한 프로토콜이 없다는 것입니다. 두 번째는 하이브리드 스페로이드의 새로운 개혁에 대한 안정화와 후속 실험 처리를 위해 이를 회수하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 광학 핀셋을 사용하여 하이브리드 림프종 스페로이드의 구성을 단계별로 보여줍니다.
이 기술의 주요 장점은 림프종 세포와 3차원 미세환경 간의 직접적인 상호 작용을 실시간으로 연구할 수 있다는 것이며, 이는 기존 세포 배양보다 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 중요한 것은 여기에 제시된 기술이 백혈병 세포주 및 기타 혈액병리학적 악성 종양에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 우리는 우리의 방법을 사용하여 항암제에 의해 유도된 단세포 접착의 미세한 변화를 연구할 계획입니다.
우리는 이를 위해 환자의 종양 계통을 사용하려고 합니다. 마이크로 몰드를 준비하는 것으로 시작하십시오. 마이크로 몰드 3D 페트리 접시를 탈이온수로 헹구고 UV 양고기 아래에 30분 동안 두어 살균을 수행합니다.
먼저 마이크로파를 사용하여 0.9% 염화나트륨 용액에 아가로스 분말을 녹여 2% 아가로스 용액을 준비합니다. 아가로스를 혼합하거나 피펫팅하는 동안 기포가 생기지 않도록 하십시오. 약 70°C까지 서늘합니다.
다음으로, 이전에 멸균된 마이크로 몰드에 500마이크로리터의 아가로스를 채워 하이드로겔을 준비합니다. 피펫팅을 통해 마이크로 몰드의 작은 특징에 갇힐 수 있는 기포를 제거합니다. 15분 후 아가로스가 응고되면 마이크로 몰드에서 젤을 조심스럽게 제거하여 멸균 6웰 플레이트에 넣습니다.
다음 단계로 진행하기 전에 현미경으로 확인하고 젤이 올바르게 준비되었는지 확인하십시오. 마이크로 몰드를 완전히 덮고 있는 인산염 완충액 식염수를 첨가한 후 플레이트를 UV 램프 아래에 놓고 30분 동안 살균을 수행합니다. 아가로스 기반 장치를 사용하여 스페로이드를 생성하기 전에 RPMI 배지로 완전히 덮어 겔을 평형화하고 최소 15분 동안 배양합니다.
RPMI 완전 배양 배지에서 HS-5 중간엽 기질 세포주를 표준 조건에서 배양하여 48시간마다 배지를 교체할 수 있습니다. 세포가 합류점의 90%에 도달하면 배양 배지를 제거합니다. 인산염 완충액 식염수로 세포를 세척하고 트립신을 사용하여 배양 플라스크 바닥에서 분리합니다.
2ml의 배양 배지를 첨가하여 트립신을 중단한 다음 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 300배 중력에서 7분 동안 원심분리기 세포를 사용합니다. 상층액을 제거하고 1ml의 신선한 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
tryp 및 blue solution을 사용하여 자동 카운터에서 셀을 계산합니다. 밀리리터당 200, 000 세포로 희석하십시오. 아가로스 기반 장치에서 배양 배지를 제거합니다.
190마이크로리터의 세포 현탁액을 아가로스 마이크로 몰드의 세포 파종 챔버에 조심스럽게 파종합니다. 세포가 겔 바닥에 가라앉을 때까지 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 젤 외부에 4ml의 배지를 천천히 추가하여 완전히 덮습니다.
배지를 젤에 직접 첨가하지 말고 배양 접시에 첨가하여 갓 형성된 스페로이드가 손상되지 않도록 하십시오. 균일한 스페로이드가 형성될 때까지 섭씨 37도에서 72시간 동안 배양합니다. 혈액학적 세포주는 현탁 배양을 위해 설계된 플라스크의 배양 배지에서 자유롭게 성장합니다.
최적의 세포 특성을 유지하려면 산 청구 절차가 광학 핀셋을 사용하여 스페로이드를 분배하기 30분 전에 샘플 준비를 시작하는 것이 좋습니다. 표준 배양 조건에서 RPMI 1640 배지에 세포를 보관합니다. 300에서 500 사이 사이 배양을, 2 3 일 마다 통과해서 밀리리터 당 000 세포를 유지하십시오.
광학 핀셋에서 조작하려면 로그 위상의 셀을 선택합니다. 세포를 수집하고 모든 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 중력의 300배에서 7분 동안 세포를 원심분리합니다.
상층액을 제거하고 앞에서 설명한 대로 세포를 계수합니다. 10의 마지막 세포 조밀도, milliliter 당 000의 세포를 도달하기 위하여 현탁액을 묽게 하십시오. 광학 조작이 있을 때까지 세포를 섭씨 37도로 유지하십시오.
여기에서 제시하는 프로토콜은 맞춤형 광학 핀셋을 위해 특별히 개발되었습니다. 그러나 상용 시스템에 대한 접근성이 점점 높아지고 있습니다. 실험실에서 사용할 수 있는 장비 유형에 관계없이 시스템 준비의 기본 단계와 세포 작업의 일반 원칙은 동일하게 유지됩니다.
현미경 광원을 켭니다. 레이저에 안전한 보호 안경을 착용하십시오. 레이저를 켜고 전력을 100메가와트로 설정합니다.
계속하기 전에 레이저 빔이 안정화될 때까지 10분 정도 기다립니다. 그 동안 컴퓨터 소프트웨어를 시작하십시오. 시스템이 준비되면 하단 대물렌즈 중앙에 30마이크로리터의 물을 추가합니다.
바닥이 유리인 35mm 현미경 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 홀더로 접시를 고정하십시오. 물 구슬이 마이크로스코프 접시의 유리 바닥에 닿을 때까지 마이크로 미터 현미경 나사를 사용하여 대물렌즈를 들어 올립니다.
마이크로미터 나사를 사용하여 s를 부드럽게 조정합니다.tage 화면에 예리하게 초점이 맞춰진 레이저 빔이 나타날 때까지. 소프트웨어 창에서 현미경 샘플의 이미지를 볼 수 있습니다. 화면에 표시되는 마커를 사용하여 광학 트랩을 원하는 위치로 이동합니다.
이전에 준비된 림프종 세포 현탁액 100마이크로리터를 추가합니다. 접시 바닥으로 가라앉히십시오. 이 작업은 약 5분 정도 소요됩니다.
현미경 스테이지의 움직임을 사용하여 떠다니는 림프종 세포를 찾습니다. 트랩 cursing을 클릭하여 광학 트랩이 샘플에 닿도록 합니다. 셀을 원하는 위치로 이동해 보십시오.
조작에 유용한 셀은 주어진 방향으로 쉽게 이동할 수 있어야 합니다. 피펫 팁으로 아가로스 주형에서 단일 기질 스페로이드를 제거하고 코팅되지 않은 유리 바닥 접시에 놓습니다. 배양 배지 2ml를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.
이 시간 동안 스페로이드는 유리에 부드럽게 달라붙어 조작 중 움직임을 방지합니다. 현미경 스테이지에 스페로이드가 들어 있는 접시를 놓습니다. 1000 마이크로리터의 배양 배지에 1000개의 림프종 세포를 첨가합니다.
접시 바닥으로 가라앉히고 약 5분 정도 걸립니다. 단일 림프종 세포를 선택하고 레이저 빔을 사용하여 포획합니다. 광학 트랩을 움직여 세포가 기질 스페로이드 표면과 접촉하도록 전달합니다.
먼저 림프종 세포를 기질 스페로이드에 10초 동안 부착합니다. 다음으로, 광학 핀셋을 사용하여 림프종 세포를 분리하는 세 번의 반복 시도를 통해 세포가 영구적으로 부착되어 있는지 확인합니다. 세포 접촉이 끊어진 경우 광학 트랩을 사용하여 림프종 세포를 스페로이드 표면에 한 번 더 부착하되 이번에는 약 20초 동안 더 긴 시간 동안 부착합니다.
기질 스페로이드의 전체 표면이 림프종 세포로 덮일 때까지 후속 림프종 세포에 대해 이 과정을 반복합니다. 마이크로 미터 현미경 나사를 사용하여 이미징 평면을 변경하면 광학 트랩의 위치를 변경할 수 있으며, 이를 통해 갇힌 물체를 샘플 내부로 보다 깊이 이동할 수 있습니다. 자발적으로 형성된 스페로이드를 더 잘 표현하려면 기질 세포의 중심부를 2-3개의 림프종 세포층으로 덮으십시오.
배양 배지를 부드럽게 제거하고 스페로이드를 100마이크로리터의 인산염 완충액 용질로 직접 세척합니다. 하이브리드 스페로이드를 100마이크로몰의 칼슘 이온 1마이크로몰과 2마이크로몰의 에티듐 호모디머-1을 함유한 PBS 100마이크로미터로 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 형광 현미경을 사용하여 스페로이드를 관찰하고 이미지를 캡처합니다.
여기에서 우리는 광학 핀셋을 사용하여 중간엽 기질 세포와 림프종 세포로 구성된 인간 하이브리드 스페로이드를 성공적으로 재구성했습니다. 먼저, 중간엽 기질 세포 스페로이드를 아가로스 마이크로 웰 장치에서 준비하여 72시간의 배양 후 비교적 균일한 스페로이드를 생성했습니다. 스페로이드의 생존율은 98% 이상으로 높았다.다음으로, 중간엽 스페로이드는 광학 핀셋을 사용하여 새로 구성된 하이브리드 스페로이드의 핵심으로 사용되었습니다.
림프종 세포는 광학 트랩에 의해 개별적으로 포획되어 기질 스페로이드의 표면에 부착되었습니다. 기질 스페로이드의 전체 표면이 림프종 세포로 덮일 때까지 절차를 반복했습니다. 우리는 RI-1 세포가 3.73초의 편차로 11.67초 만에 기질 스페로이드에 부착하는 것을 확인했습니다.
이 과정에서 약 1시간 12분이 소요된 65개의 셀이 부착되었습니다. 새로 조작된 스페로이드의 살아있는 염색은 조작에 사용되는 세포의 높은 생존율을 보여주었습니다(93%).이 논문은 광학 핀셋을 사용하여 림프종 기질 세포 스페로이드 형성을 위한 비침습적 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 하이브리드 스페로이드를 구성할 뿐만 아니라 부착된 세포의 수와 접착 형성 시기를 정밀하게 제어할 수 있어 조직 공학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
또한, 이 광학 핀셋 접근 방식은 표준 벌크 기술을 사용하여 달성할 수 없는 고위험 스페로이드 형성의 초기 단계에 대한 연구를 용이하게 합니다. 가장 중요한 것은 당사의 프로토콜을 다른 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며, 이를 통해 이 광학 핀셋 기반 접근 방식이 3D 세포 배양 분야에서 점점 더 많이 채택될 수 있다는 것입니다.
