Las pinzas ópticas permiten el atrapamiento físico y la manipulación de objetos de escala micrométrica y nanométrica de forma no invasiva utilizando solo un rayo láser enfocado. Esta herramienta ahora se aplica con éxito a varias estructuras biológicas, incluidas las células de escisión. Nuestro laboratorio tiene como objetivo investigar la interacción directa célula-célula a nivel de una sola célula y tratar aún más esta disposición lateral y estructuración utilizando técnicas prometedoras como las pinzas ópticas.
En primer lugar, el reto experimental actual es la falta de un protocolo para la construcción de esferoides híbridos utilizando pinzas ópticas para todo el proceso. En segundo lugar, la estabilización de nuevas reformas en esferoides híbridos y su recuperación para su posterior procesamiento experimental. En este protocolo, demostramos paso a paso la construcción de un linfoma esferoide híbrido con el uso de pinzas ópticas.
La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de estudiar en tiempo real las interacciones directas entre las células de linfoma y el microambiente tridimensional, que es biológicamente más relevante que el cultivo celular tradicional. Es importante destacar que la técnica presentada aquí se puede adaptar fácilmente a líneas celulares de leucemia y otras neoplasias malignas hematopatológicas. Planeamos usar nuestros métodos para estudiar los cambios mínimos en la adhesión de una sola célula inducida por los medicamentos contra el cáncer.
Tenemos la intención de utilizar el linaje tumoral de un paciente para este propósito. Comience preparando el micromolde. Enjuague la placa de Petri 3D del micromolde en agua desionizada y colóquela debajo de un cordero UV durante 30 minutos para realizar la esterilización.
Primero, prepare la solución de agarosa al 2% disolviendo el polvo de agarosa en una solución de cloruro de sodio al 0,9% usando un microondas. Evite crear burbujas al mezclar o pipetear la agarosa. Enfriar la agarosa a aproximadamente 70 grados centígrados.
A continuación, prepare los hidrogeles llenando micromoldes previamente esterilizados con 500 microlitros de agarosa. Elimine las burbujas que puedan quedar atrapadas en las pequeñas características de un micromolde mediante pipeteo. Después de 15 minutos, cuando la agarosa se haya solidificado, retire con cuidado los geles de los micromoldes y colóquelos en una placa estéril de seis pocillos.
Antes de continuar con el siguiente paso, verifique bajo un microscopio y confirme que el gel se haya preparado correctamente. Agregue solución salina tampón de fosfato cubriendo completamente los micromoldes antes de colocar la placa debajo de una lámpara UV durante 30 minutos para realizar la esterilización. Antes de utilizar los dispositivos a base de agarosa para producir esferoides, equilibre el gel cubriéndolos completamente con medio RPMI e incube durante un mínimo de 15 minutos.
Cultivo de la línea celular estromal mesenquimal HS-5 en medio de cultivo completo RPMI en condiciones estándar, asegurando un cambio de medio cada 48 horas. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, retire el medio de cultivo. Lave las células con solución salina tampón fosfato y sepárelas del fondo del matraz de cultivo con tripsina.
Detenga la tripsina agregando dos mililitros de medio de cultivo, luego transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las celdas a 300 veces la gravedad durante siete minutos. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo fresco.
Cuente las celdas en el contador automático usando tryp y solución azul. Dilúyelos a 200.000 células por mililitro. Retire el medio de cultivo de los dispositivos a base de agarosa.
Siembre con cuidado 190 microlitros de suspensión celular en la cámara de siembra celular de micromolde de agarosa. Incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados hasta que las células se asienten en el fondo del gel. Agregue lentamente cuatro mililitros de medio adicional al exterior de los geles, cubriéndolos por completo.
Recuerde no agregar el medio directamente sobre el gel, sino en la placa de cultivo, evitando dañar los esferoides recién formados. Incubar durante 72 horas a 37 grados centígrados hasta que se formen esferoides uniformes. La línea celular hematológica crece flotando libremente en el medio de cultivo en matraces diseñados para el cultivo en suspensión.
Para mantener las propiedades celulares óptimas, se recomienda comenzar a preparar la muestra no antes de 30 minutos antes de que el procedimiento de facturación de ácido distribuya los esferoides utilizando las pinzas ópticas. Mantenga las celdas en medio RPMI 1640 en condiciones de cultivo estándar. Mantener cultivos entre 300 y 500.000 células por mililitro pasando cada dos o tres días.
Para la manipulación en pinzas ópticas, elija celdas en la fase logarítmica. Recoja las celdas y transfiera toda la suspensión a un tubo de 15 mililitros. Centrifuga las células a 300 veces la gravedad durante siete minutos.
Retire el sobrenadante y cuente las células como se describió anteriormente. Diluir la suspensión para alcanzar una densidad celular final de 10.000 células por mililitro. Mantenga las células a 37 grados centígrados hasta la manipulación óptica.
El protocolo que presentamos aquí fue desarrollado específicamente para las pinzas ópticas hechas a medida. Sin embargo, los sistemas comerciales son cada vez más accesibles. Independientemente del tipo de equipo disponible en su laboratorio, los pasos básicos de la preparación del sistema y los principios generales del trabajo con células siguen siendo los mismos.
Encienda la fuente de luz del microscopio. Use gafas protectoras seguras para láseres. Encienda el láser y ajuste la potencia a 100 megavatios.
Antes de continuar, espere 10 minutos, permitiendo que el rayo láser se estabilice. Mientras tanto, inicie el software de la computadora. Una vez que el sistema esté listo, agregue 30 microlitros de agua al centro del objetivo inferior.
Coloque una placa de microscopía de 35 milímetros con fondo de vidrio en la platina del microscopio. Estabilice el plato con los soportes. Levante el objetivo con el tornillo del microscopio micrométrico hasta que la gota de agua toque el fondo de vidrio de la placa de microcopia.
Con el tornillo micrométrico, ajuste suavemente la etapa hasta que haya un rayo láser nítidamente enfocado en la pantalla. En la ventana del software, verá una imagen de la muestra del microscopio. Utilice los marcadores visibles en la pantalla para mover la trampa óptica en la ubicación deseada.
Añadir 100 microlitros de suspensión de células de linfoma previamente preparada. Deja que se hundan hasta el fondo del plato. Esto tomará aproximadamente cinco minutos.
Usando los movimientos de la etapa del microscopio, encuentra una célula de linfoma flotante. Permita que la trampa óptica golpee la muestra haciendo clic en la maldición de la trampa. Intente mover la celda a la ubicación deseada.
Una célula para ser útil para la manipulación debe ser capaz de moverse fácilmente en cualquier dirección dada. Retire un solo esferoide estromal del molde de agarosa con una punta de pipeta y colóquelo en un plato con fondo de vidrio sin recubrimiento. Añadir dos mililitros de medio de cultivo e incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados.
Durante este tiempo, el esferoide se adherirá suavemente al vidrio, lo que evita el movimiento durante la manipulación. Coloque el plato que contiene el esferoide en la platina del microscopio. Añadir 1000 células de linfoma a 100 microlitros de medio de cultivo.
Deje que se hundan hasta el fondo del plato, tomando aproximadamente cinco minutos. Seleccione una sola célula de linfoma y atrape con el rayo láser. Mueva la trampa óptica para poner la célula en contacto con la superficie del esferoide estromal.
Comience uniendo la célula del linfoma al esferoide estromal durante 10 segundos. A continuación, compruebe si la célula está unida de forma permanente con tres intentos repetidos de separar la célula del linfoma con las pinzas ópticas. Si se rompe el contacto celular, vuelva a unir la célula del linfoma con una superficie esferoide utilizando la trampa óptica, esta vez, durante un período de tiempo más largo, aproximadamente 20 segundos.
Repita este proceso con las células de linfoma subsiguientes hasta que toda la superficie del esferoide estromal esté cubierta por células de linfoma. Al cambiar el plano de imagen con un tornillo de microscopio micrométrico, se puede cambiar la posición de la trampa óptica, lo que permite el movimiento de los objetos atrapados más profundamente en la muestra. Para una mejor representación del esferoide formado espontáneamente, cubra el núcleo de las células estromales con dos o tres capas de células de linfoma.
Retire suavemente el medio de cultivo y lave directamente el esferoide con 100 microlitros de soluto tampón de fosfato. Incubar los esferoides híbridos con 100 microlitros de PBS que contienen un micromol de ion calcio y dos micromoles de homodímero de etidio-1 durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Usando microscopía de fluorescencia, observe los esferoides y capture las imágenes.
Aquí, reconstruimos con éxito un esferoide híbrido humano formado por células estromales mesenquimales y células de linfoma con el uso de pinzas ópticas. En primer lugar, se prepararon los esferoides de las células estromales mesenquimales en un dispositivo de micropocillos de agarosa, lo que da como resultado esferoides relativamente uniformes después de 72 horas de incubación. La viabilidad de los esferoides fue superior al 98%A continuación, se utilizaron esferoides mesenquimales como núcleo de esferoides híbridos recién construidos con el uso de pinzas ópticas.
Las células del linfoma fueron atrapadas individualmente por trampas ópticas y adheridas a la superficie del esferoide estromal. El procedimiento se repitió hasta que toda la superficie del esferoide estromal quedó cubierta de células de linfoma. Establecimos que las células RI-1 se unieron al esferoide estromal en 11,67 segundos con una desviación de 3,73 segundos.
Durante el proceso, se colocaron 65 celdas, lo que duró aproximadamente una hora y 12 minutos. La tinción de vivos-muertos de esferoides de nueva ingeniería mostró una alta viabilidad de las células utilizadas para la manipulación, en un 93%Este trabajo propone un protocolo no invasivo para la formación de esferoides de células estromales de linfoma utilizando pinzas ópticas. Este método no solo construye esferoides híbridos de novo, sino que también permite un control preciso sobre el número de células unidas y el momento de la formación de la adhesión, lo que proporciona información valiosa para la ingeniería de tejidos.
Además, este enfoque de pinzas ópticas facilita el estudio de la formación de esferoides de alto riesgo en etapas tempranas, que no se puede lograr con técnicas estándar a granel. Y lo que es más importante, nuestro protocolo puede aplicarse fácilmente a otros tipos de células, lo que permitirá que este enfoque basado en pinzas ópticas se emplee cada vez más en el campo del cultivo celular en 3D.
