تسمح الملقط البصري بمحاصرة الأجسام ذات الحجم الميكروني والنانومتر ومعالجتها بشكل غير جراحي باستخدام شعاع الليزر المركز فقط. يتم الآن تطبيق هذه الأداة بنجاح على العديد من الهياكل البيولوجية ، بما في ذلك الخلايا المشقوقة. يهدف مختبرنا إلى التحقيق في التفاعل المباشر بين الخلية والخلية على مستوى الخلية المفردة ومعالجة هذا الترتيب الجانبي والهيكلة باستخدام التقنيات الواعدة مثل الملقط البصري.
أولا ، التحدي التجريبي الحالي هو عدم وجود بروتوكول لبناء الكرويات الهجينة باستخدام ملاقط بصرية للعملية برمتها. والثاني هو تثبيت الإصلاح الجديد في الكرويات الهجينة واستعادتها للمعالجة التجريبية اللاحقة. في هذا البروتوكول ، نوضح خطوة بخطوة بناء كروي لسرطان الغدد الليمفاوية الهجين باستخدام ملاقط بصرية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي فرصة دراسة التفاعلات المباشرة بين خلايا سرطان الغدد الليمفاوية والبيئة المكروية ثلاثية الأبعاد في الوقت الفعلي ، والتي تعتبر أكثر صلة بيولوجيا من زراعة الخلايا التقليدية. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف التقنية المقدمة هنا بسهولة مع خطوط خلايا سرطان الدم والأورام الخبيثة الدموية الأخرى. نخطط لاستخدام أساليبنا لدراسة التغيرات الدقيقة في التصاق الخلية المفردة التي تسببها أدوية السرطان.
نعتزم استخدام سلالة ورم المريض لهذا الغرض. ابدأ بإعداد القالب الصغير. اشطف طبق بتري ثلاثي الأبعاد الصغير في ماء منزوع الأيونات ، وضعه تحت لحم الضأن بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لإجراء التعقيم.
أولا ، قم بإعداد محلول الاغاروز بنسبة 2٪ عن طريق إذابة مسحوق الاغاروز في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ باستخدام الميكروويف. تجنب تكوين فقاعات أثناء خلط أو سحب اللاغاروس. يبرد الاغاروز إلى حوالي 70 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بإعداد الهلاميات المائية عن طريق ملء القوالب الدقيقة المعقمة مسبقا ب 500 ميكرولتر من الاغاروز. قم بإزالة أي فقاعات قد تكون محاصرة في السمات الصغيرة للقالب الصغير عن طريق سحب العينات. بعد 15 دقيقة ، عندما يتجمد الاغاروز ، قم بإزالة المواد الهلامية بعناية من القوالب الدقيقة إلى طبق معقم من ستة آبار.
قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، تحقق تحت المجهر ، وتأكد من تحضير الجل بشكل صحيح. أضف محلول ملحي عازل للفوسفات يغطي القوالب الدقيقة بالكامل قبل وضع اللوحة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لإجراء التعقيم. قبل استخدام الأجهزة القائمة على الاغاروز لإنتاج الكرات الكروية ، قم بموازنة الجل عن طريق تغطيتها بالكامل بوسط RPMI واحتضانها لمدة 15 دقيقة على الأقل.
استزراع خط الخلايا اللحمية اللحمية الوسيطة HS-5 في وسط زراعة RPMI الكامل في الظروف القياسية ، مما يضمن تغيير الوسط كل 48 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، قم بإزالة وسائط الزيادة. اغسل الخلايا بمحلول ملحي عازل للفوسفات وافصلها عن قاع قارورة المزرعة باستخدام التربسين.
أوقف التربسين عن طريق إضافة ملليلترين من وسط الاستزراع ، ثم انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. خلايا الطرد المركزي عند 300 ضعف الجاذبية لمدة سبع دقائق. قم بإزالة المواد الطافية وإعادة تعليق الخلايا في مليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة.
عد الخلايا في العداد التلقائي باستخدام محلول tryp والأزرق. تخفيفها إلى 200 ، 000 خلية لكل ملليلتر. قم بإزالة وسط الاستزراع من الأجهزة القائمة على الاغاروز.
قم بزرع 190 ميكرولترا من تعليق الخلية بعناية في غرفة بذر الخلية في قالب الاغاروز الصغير. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تستقر الخلايا في قاع الجل. أضف ببطء أربعة ملليلتر من الوسط الإضافي إلى الجزء الخارجي من المواد الهلامية ، وتغطيتها بالكامل.
تذكر ألا تضيف الوسيط مباشرة إلى الجل ، ولكن في طبق الثقافة ، وتجنب إتلاف الكرات الكروية المتكونة حديثا. احتضن لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية حتى تتشكل الزي الرسمي الكروي. ينمو خط الخلايا الدموية بحرية في وسط الاستزراع في قوارير مصممة لثقافة التعليق.
للحفاظ على خصائص الخلية المثلى ، يوصى بالبدء في تحضير العينة في موعد لا يتجاوز 30 دقيقة قبل إجراء الفوترة الحمضية التي توزع الكرويات باستخدام الملقط البصري. احتفظ بالخلايا في وسط RPMI 1640 في ظل ظروف الثقافة القياسية. الحفاظ على الثقافات بين 300 و 500 ، 000 خلايا في المليلتر بالمرور كل يومين إلى ثلاثة أيام.
للتلاعب في الملقط البصري ، اختر الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية. اجمع الخلايا وانقل كل التعليق إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للخلايا بقوة 300 ضعف الجاذبية لمدة سبع دقائق.
قم بإزالة الخلايا الطافية وعد الخلايا كما هو موضح سابقا. تمييع المعلق للوصول إلى كثافة خلية نهائية تبلغ 10،000 خلية لكل مليلتر. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى التلاعب البصري.
تم تطوير البروتوكول الذي نقدمه هنا خصيصا للملاقط البصرية المصممة خصيصا. ومع ذلك ، أصبحت الأنظمة التجارية متاحة بشكل متزايد. بغض النظر عن نوع المعدات المتوفرة في مختبرك ، تظل الخطوات الأساسية لإعداد النظام والمبادئ العامة للعمل مع الخلايا كما هي.
قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر. ارتد نظارات واقية آمنة لليزر. قم بتشغيل الليزر واضبط الطاقة على 100 ميجاوات.
قبل المتابعة ، انتظر 10 دقائق ، مما يسمح لشعاع الليزر بالاستقرار. في غضون ذلك ، ابدأ تشغيل برنامج الكمبيوتر. بمجرد أن يصبح النظام جاهزا ، أضف 30 ميكرولترا من الماء إلى وسط الهدف السفلي.
ضع طبق مجهر 35 ملم بقاع زجاجي على مرحلة المجهر. ثبت الطبق مع الحاملات. ارفع الهدف باستخدام برغي المجهر المجهري حتى تلامس حبة الماء القاع الزجاجي لطبق النسخ المجهري.
باستخدام برغي الميكرومتر ، اضبط المسرح برفق حتى يكون هناك شعاع ليزر شديد التركيز على الشاشة. في نافذة البرنامج ، سترى صورة لعينة المجهر. استخدم العلامات المرئية على الشاشة لتحريك التراكب اللوني البصري في الموقع المطلوب.
أضف 100 ميكرولتر من معلق خلايا سرطان الغدد الليمفاوية المعد مسبقا. دعهم يغرقون في قاع الطبق. سيستغرق هذا حوالي خمس دقائق.
باستخدام حركات مرحلة المجهر ، ابحث عن خلية سرطان الغدد الليمفاوية العائمة. اسمح للمراكب اللونية البصرية بضرب العينة بالنقر فوق شتم المراكب. حاول نقل الخلية إلى الموقع المطلوب.
يجب أن تكون الخلية مفيدة للتلاعب قادرة على التحرك بسهولة في أي اتجاه معين. قم بإزالة كروي لحمي واحد من قالب الاغاروز بطرف ماصة وضعه على طبق زجاجي غير مطلي. أضف ملليلترين من وسط الاستزراع واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
خلال هذا الوقت ، سوف يلتصق الكروي بلطف بالزجاج ، مما يمنع الحركة أثناء التلاعب. ضع الطبق الذي يحتوي على الكروية على مرحلة المجهر. أضف 1000 خلية من خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
دعهم يغرقون في قاع الطبق ، ويستغرق حوالي خمس دقائق. حدد خلية لمفومة واحدة وحبسها باستخدام شعاع الليزر. حرك المصيدة البصرية لتوصيل الخلية إلى ملامسة السطح الكروي اللحمي.
ابدأ بربط خلية سرطان الغدد الليمفاوية باللحمة الكروية لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، تحقق مما إذا كانت الخلية مرتبطة بشكل دائم بثلاث محاولات متكررة لفصل خلية سرطان الغدد الليمفاوية باستخدام الملقط البصري. إذا تم كسر الاتصال الخلوي ، فقم بإرفاق خلية سرطان الغدد الليمفاوية بسطح كروي مرة أخرى باستخدام المصيدة البصرية ، هذه المرة ، لفترة أطول من الوقت ، حوالي 20 ثانية.
كرر هذه العملية مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية اللاحقة حتى يتم تغطية سطح اللحمة الكروي بالكامل بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية. من خلال تغيير مستوى التصوير باستخدام برغي المجهر المجهري ، يمكن للمرء تغيير موضع المصيدة البصرية ، مما يتيح حركة الأجسام المحاصرة بشكل أكثر عمقا في العينة. للحصول على تمثيل أفضل للكروية المتكونة تلقائيا ، قم بتغطية نواة الخلايا اللحمية بطبقتين إلى ثلاث طبقات من خلايا سرطان الغدد الليمفاوية.
قم بإزالة وسط الثقافة برفق واغسل الكروي مباشرة ب 100 ميكرولتر من مذاب عازلة الفوسفات. احتضان الكرويات الهجينة ب 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على ميكرومول واحد من أيون الكالسيوم واثنين من ميكرومول من Ethidium Homodimer-1 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، راقب الكرات والتقط الصور.
هنا ، نجحنا في إعادة بناء كرة كروية هجينة بشرية تتكون من خلايا لحمية وسيطة وخلايا سرطان الغدد الليمفاوية باستخدام ملاقط بصرية. أولا ، تم تحضير الخلايا اللحمية الوسيطة الكروية في جهاز بئر صغير من الاغاروز ، مما ينتج عنه كبويات موحدة نسبيا بعد 72 ساعة من الحضانة. كانت صلاحية الكرات أعلى من 98٪ بعد ذلك ، تم استخدام اللحمة الوسيطة الكروية كنواة للهجينة الكروية التي تم إنشاؤها حديثا باستخدام ملاقط بصرية.
تم احتجاز خلايا سرطان الغدد الليمفاوية بشكل فردي بواسطة مصائد بصرية وربطها بسطح اللحمة الكروية. تكرر الإجراء حتى تمت تغطية سطح اللحمة الكروية بالكامل بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية. أثبتنا أن خلايا RI-1 مرتبطة بالكروية اللحمية في 11.67 ثانية مع انحراف 3.73 ثانية.
خلال العملية ، تم إرفاق 65 زنزانة ، استغرقت حوالي ساعة و 12 دقيقة. أظهر تلطيخ الحي الميت للمركبات الكروية المصممة حديثا قابلية عالية للحياة للخلايا المستخدمة في التلاعب ، بنسبة 93٪ تقترح هذه الورقة بروتوكولا غير جراحي لتكوين كرويات الخلايا اللحمية لسرطان الغدد الليمفاوية باستخدام ملاقط بصرية. لا تقوم هذه الطريقة ببناء كرويات هجينة من جديد فحسب ، بل تسمح أيضا بالتحكم الدقيق في عدد الخلايا المرفقة وتوقيت تكوين الالتصاق ، مما يوفر نظرة ثاقبة لهندسة الأنسجة.
علاوة على ذلك ، يسهل نهج الملقط البصري هذا دراسة المرحلة المبكرة من تكوين كروي عالي الخطورة ، والذي لا يمكن تحقيقه باستخدام تقنيات سائبة قياسية. الأهم من ذلك ، يمكن تطبيق بروتوكولنا بسهولة على أنواع الخلايا الأخرى ، مما سيمكن هذا النهج القائم على الملقط البصري من استخدامه بشكل متزايد في مجال زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.
