Optik cımbız, mikron ve nanometre ölçeğindeki nesnelerin yalnızca odaklanmış lazer ışını kullanılarak invaziv olmayan bir şekilde fiziksel olarak yakalanmasına ve manipüle edilmesine izin verir. Bu araç şimdi hücreleri parçalamak da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yapılara başarıyla uygulanmaktadır. Laboratuvarımız, tek hücre düzeyinde doğrudan hücre-hücre etkileşimini araştırmayı ve optik cımbız gibi umut verici teknikleri kullanarak bu yanal düzenlemeyi ve yapılandırmayı daha fazla tedavi etmeyi amaçlamaktadır.
Birincisi, mevcut deneysel zorluk, tüm süreç için optik cımbız kullanarak hibrit sferoidlerin inşası için protokolün olmamasıdır. İkincisi, melez sferoidlerde yeni reformun stabilizasyonu ve daha sonraki deneysel işlemler için geri alınmasıdır. Bu protokolde, optik cımbız kullanımı ile hibrid bir lenfoma sferoidinin yapımını adım adım gösteriyoruz.
Bu tekniğin temel avantajı, lenfoma hücreleri ile üç boyutlu mikro çevre arasındaki doğrudan etkileşimleri gerçek zamanlı olarak inceleme fırsatıdır, bu da geleneksel hücre kültüründen biyolojik olarak daha önemlidir. Daha da önemlisi, burada sunulan teknik, lösemi hücre dizilerine ve diğer hematopatolojik malignitelere kolayca uyarlanabilir. Kanser ilaçlarının neden olduğu tek hücre yapışmasındaki küçük değişiklikleri incelemek için yöntemlerimizi kullanmayı planlıyoruz.
Bu amaçla bir hastanın tümör kökenini kullanmayı düşünüyoruz. Mikro kalıbı hazırlayarak başlayın. Mikro kalıp 3D petri kabını deiyonize suda durulayın ve sterilizasyonu gerçekleştirmek için 30 dakika boyunca bir UV kuzusunun altına koyun.
İlk olarak, agaroz tozunu bir mikrodalga kullanarak %0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde çözerek %2'lik agaroz çözeltisi hazırlayın. Agarozu karıştırırken veya pipetlerken kabarcık oluşturmaktan kaçının. Agarozu yaklaşık 70 santigrat dereceye kadar soğutun.
Daha sonra, önceden sterilize edilmiş mikro kalıpları 500 mikrolitre agaroz ile doldurarak hidrojeller hazırlayın. Pipetleme ile bir mikro kalıbın küçük parçalarına sıkışmış olabilecek baloncukları çıkarın. 15 dakika sonra, agaroz katılaştığında, jelleri mikro kalıplardan steril altı oyuklu bir plakaya dikkatlice çıkarın.
Bir sonraki adıma geçmeden önce mikroskop altında kontrol edin, jelin doğru şekilde hazırlandığını onaylayın. Sterilizasyonu gerçekleştirmek için plakayı 30 dakika boyunca bir UV lambasının altına yerleştirmeden önce mikro kalıpları tamamen kaplayan fosfat tampon salin ekleyin. Agaroz bazlı cihazları sferoid üretmek için kullanmadan önce, jeli RPMI ortamında tamamen kaplayarak dengeleyin ve en az 15 dakika inkübe edin.
HS-5 mezenkimal stromal hücre hattını standart koşullarda RPMI tam kültür ortamında kültürleyin ve her 48 saatte bir ortamın değiştirilmesini sağlayın. Hücreler birleşme oranının %90'ına ulaştığında, kültür ortamını çıkarın. Hücreleri fosfat tampon salin ile yıkayın ve tripsin kullanarak kültür şişesinin dibinden ayırın.
İki mililitre kültür ortamı ekleyerek tripsini durdurun, ardından bunları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri yedi dakika boyunca yerçekiminin 300 katı ile santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri bir mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin.
Tryp ve mavi çözelti kullanarak otomatik sayaçtaki hücreleri sayın. Onları mililitre başına 200.000 hücreye seyreltin. Agaroz bazlı cihazlardan kültür ortamını çıkarın.
190 mikrolitre hücre süspansiyonunu agaroz mikro kalıbın hücre tohumlama odasına dikkatlice tohumlayın. Hücreler jelin dibine yerleşene kadar hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Jellerin dışına yavaşça dört mililitre ek ortam ekleyin ve tamamen kaplayın.
Ortamı doğrudan jelin üzerine değil, yeni şekillendirilmiş sferoidlere zarar vermekten kaçınarak kültür kabına eklemeyi unutmayın. Üniformalar sferoidler oluşana kadar 37 santigrat derecede 72 saat inkübe edin. Hematolojik hücre hattı, süspansiyon kültürü için tasarlanmış şişelerde kültür ortamında serbest yüzer şekilde büyür.
Optimal hücre özelliklerini korumak için, asit faturalandırma prosedürü optik cımbız kullanarak sferoidleri dağıtmadan en geç 30 dakika önce numuneyi hazırlamaya başlamanız önerilir. Hücreleri standart kültür koşulları altında RPMI 1640 ortamında tutun. Her iki ila üç günde bir geçerek kültürleri mililitrede 300 ila 500.000 hücre arasında tutun.
Optik cımbızda manipülasyon için, logaritmik fazdaki hücreleri seçin. Hücreleri toplayın ve tüm süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri yedi dakika boyunca yerçekiminin 300 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi hücreleri sayın. Mililitre başına 10.000 hücrelik bir nihai hücre yoğunluğuna ulaşmak için süspansiyonu seyreltin. Optik manipülasyona kadar hücreleri 37 santigrat derecede tutun.
Burada sunduğumuz protokol, özel yapım optik cımbızlar için özel olarak geliştirilmiştir. Ancak, ticari sistemler giderek daha erişilebilir hale geliyor. Laboratuvarınızda ne tür ekipman bulunursa bulunsun, sistem hazırlamanın temel adımları ve hücrelerle çalışmanın genel prensipleri aynı kalır.
Mikroskop ışık kaynağını açın. Lazere dayanıklı koruyucu gözlük takın. Lazeri açın ve gücü 100 megawatt'a ayarlayın.
Devam etmeden önce, lazer ışınının stabilize olmasına izin vererek 10 dakika bekleyin. Bu arada, bilgisayar yazılımını başlatın. Sistem hazır olduğunda, alt objektifin ortasına 30 mikrolitre su ekleyin.
Mikroskop tablasına cam tabanlı 35 milimetrelik bir mikroskopi kabı yerleştirin. Çanağı tutucularla sabitleyin. Mikrometrik mikroskop vidasını kullanarak su boncuğu mikrokopi kabının cam tabanına değene kadar objektifi kaldırın.
Mikrometre vidasını kullanarak, ekranda keskin bir şekilde odaklanmış bir lazer ışını olana kadar sahneyi yavaşça ayarlayın. Yazılım penceresinde, mikroskop örneğinin bir görüntüsünü göreceksiniz. Optik tuzağı istenen konuma hareket ettirmek için ekranda görünen işaretçileri kullanın.
100 mikrolitre önceden hazırlanmış lenfoma hücre süspansiyonu ekleyin. Tabağın dibine batmalarına izin verin. Bu yaklaşık beş dakika sürecektir.
Mikroskop aşamasının hareketlerini kullanarak, yüzen bir lenfoma hücresi bulun. Tuzak lanetine tıklayarak optik tuzağın örneğe çarpmasına izin verin. Hücreyi istediğiniz konuma taşımayı deneyin.
Manipülasyon için yararlı olacak bir hücre, herhangi bir yönde kolayca hareket edebilmelidir. Bir pipet ucu ile agaroz kalıbından tek bir stromal sferoidi çıkarın ve kaplanmamış bir cam tabanlı tabağa yerleştirin. İki mililitre kültür ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.
Bu süre zarfında, sferoid cama hafifçe yapışacak ve bu da manipülasyon sırasında hareketi önleyecektir. Sferoid içeren tabağı mikroskop tablasına yerleştirin. 100 mikrolitre kültür ortamına 1000 lenfoma hücresi ekleyin.
Yaklaşık beş dakika sürerek tabağın dibine batmalarına izin verin. Tek bir lenfoma hücresi seçin ve lazer ışını kullanarak onu yakalayın. Hücreyi stromal küresel yüzeyle temas ettirmek için optik tuzağı hareket ettirin.
Lenfoma hücresini 10 saniye boyunca stromal sferoide bağlayarak başlayın. Ardından, optik cımbız kullanarak lenfoma hücresini çıkarmak için tekrarlanan üç girişimle hücrenin kalıcı olarak bağlı olup olmadığını kontrol edin. Hücresel temas koparsa, lenfoma hücresini optik tuzağı kullanarak bir kez daha küresel bir yüzeyle, bu sefer daha uzun bir süre, yaklaşık 20 saniye boyunca tutturun.
Stromal sferoidin tüm yüzeyi lenfoma hücreleri tarafından kaplanana kadar bu işlemi sonraki lenfoma hücreleri ile tekrarlayın. Mikrometrik mikroskop vidası kullanarak görüntüleme düzlemini değiştirerek, sıkışan nesnelerin numuneye daha derin bir şekilde hareket etmesini sağlayan optik tuzağın konumu değiştirilebilir. Kendiliğinden oluşan sferoidin daha iyi bir temsili için, stromal hücrelerin çekirdeğini iki ila üç kat lenfoma hücresi ile kaplayın.
Kültür ortamını nazikçe çıkarın ve sferoidi doğrudan 100 mikrolitre fosfat tampon çözünen madde ile yıkayın. Hibrit sferoidleri, bir mikromol kalsiyum iyonu ve iki mikromol Ethidium Homodimer-1 içeren 100 mikrolitre PBS ile 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Floresan mikroskobu kullanarak sferoidleri gözlemleyin ve görüntüleri yakalayın.
Burada, mezenkimal stromal hücreler ve lenfoma hücrelerinden oluşan bir insan hibrit sferoidini optik cımbız kullanarak başarılı bir şekilde yeniden yapılandırdık. İlk olarak, mezenkimal stromal hücre sferoidleri, 72 saatlik inkübasyondan sonra nispeten homojen sferoidlerle sonuçlanan bir agaroz mikro kuyu cihazında hazırlandı. Sferoidlerin canlılığı %98'den daha yüksektiDaha sonra, mezenkimal sferoidler, optik cımbız kullanılarak yeni inşa edilen hibrit sferoidlerin bir çekirdeği olarak kullanıldı.
Lenfoma hücreleri ayrı ayrı optik tuzaklarla yakalandı ve stromal sferoidin yüzeyine tutturuldu. Prosedür, stromal sferoidin tüm yüzeyi lenfoma hücreleri ile kaplanana kadar tekrarlandı. RI-1 hücrelerinin stromal sferoide 11.67 saniyede bağlandığını ve 3.73 saniyelik bir sapma olduğunu tespit ettik.
İşlem sırasında, yaklaşık bir saat 12 dakika süren 65 hücre bağlandı. Yeni tasarlanmış sferoidlerin canlı-ölü boyanması, manipülasyon için kullanılan hücrelerin %93 oranında yüksek bir canlılık gösterdiğini göstermiştirBu makale, optik cımbız kullanılarak lenfoma stromal hücreli sferoidlerin oluşumu için invaziv olmayan bir protokol önermektedir. Bu yöntem sadece hibrit sferoidler de novo oluşturmakla kalmaz, aynı zamanda bağlı hücrelerin sayısı ve adezyon oluşumunun zamanlaması üzerinde hassas kontrol sağlayarak doku mühendisliği için değerli bilgiler sağlar.
Ayrıca, bu optik cımbız yaklaşımı, standart dökme teknikler kullanılarak elde edilemeyen yüksek riskli sferoid oluşumunun erken evresinin incelenmesini kolaylaştırır. En önemlisi, protokolümüz diğer hücre tiplerine kolayca uygulanabilir, bu da bu optik cımbız tabanlı yaklaşımın 3D hücre kültürü alanında giderek daha fazla kullanılmasını sağlayacaktır.
