Method Article
כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.
הדור יעיל של המגוון הגנטי מייצג כלי מולקולרית יסולא בפז כי ניתן להשתמש בתווית סינתזה של DNA, כדי ליצור חתימות מולקולרי ייחודי, או להתפתח חלבונים במעבדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר דור (> 10 11) ספריות גדולות מוטציה עבור רצף יעד נתון. שיטה זו מבוססת על שכפול של קידוד ColE1 פלסמיד רצף הרצוי על ידי גרסה נמוכה נאמנות של פולימראז ה-DNA אני (LF-Pol אני). היעד פלסמיד הופכת זן המוטטורי של E. coli ו מצופה על התקשורת מוצק, מניב בין 0.2 ל 1 מוטציות / kb, בהתאם למיקום של גן המטרה. תדרים מוטציה גבוהה מושגות על ידי iterating תהליך זה של mutagenesis. בהשוואה לשיטות חלופיות mutagenesis, פרוטוקול שלנו בולטת בפשטותה, שכן לא שיבוט PCR או מעורבים. לכן, השיטה שלנו הוא אידיאלי עבור תיוג מוטאציות של פלסמידים או אחרת אני תבניות פול או לחקור חלקים גדולים של מרחב רצף לאבולוציה של פעילויות לא נוכח היעד המקורי. השליטה במרחב הדוק כי PCR או להציע אקראי oligonucleotide שיטות המבוססות יכול גם להיות מושגת באמצעות שיבוט הבאות של חלקים מסוימים של הספרייה. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מראה כיצד ליצור ספריה מוטציה אקראית וכיצד להקים התרופה מבוססת בחירות E. coli כדי לזהות מוטציות מציג פעילויות ביוכימיות חדש.
אני דור ספריית מוטציה אקראית
פול אני מתווכת חניכה של שכפול ColE1 פלסמיד (הנסקרת ב (1-3). השיטה שלנו של mutagenesis מבוסס על הנחת רצף היעד ColE1 פלסמיד סמוך למקור או שכפול הפצת זה בתאים לבטא נמוכה נאמנות פולימראז ה-DNA אני (LF-Pol אני). LF-Pol אני הוא פולימראז ה-DNA מוטנטי אני קידוד שלוש מוטציות כי הירידה נאמנות של שכפול, כלומר I709N (מוטיב), A759R (מוטיב B) D424A (inactivating הגהה) 4,5 . LF-Pol אני מתבטא זן החיידק, JS200, בעל אלל טמפרטורה רגיש של פול אני (polA12) (6), כך LF-Pol אני הופך את הפעילות השולט על 37 ° C. שכפול של רצף היעד polA12 תאים תחת תנאים מגבילים תוצאות בדור של ספריה מוטציה אקראית. mutagenesis יעיל יותר בתרבויות רווי 4. מסיבות שאינן ברורות עדיין, mutagenesis אינו רציף, כלומר תדירות המוטציה אינה מגדילה באופן ליניארי עם מספר דורות של תרבות אחת מגיע לרוויה, גם אם תאים מותר להרחיב עוד יותר בתקשורת טריים. לכן, נוסף להגדיל את העומס מוטציה של הספרייה דורש איטרטיבי סבבי mutagenesis ושחזור פלסמיד. כאן אנו מספקים פרוטוקולים mutagenesis אני LF-Pol. שים לב כי הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מפושטת ניכרת ביחס 4 התיאור המקורי שלנו על מנת להקל איטרציה של התהליך להשגת לטעון מוטציה הרצוי (איור 1).
חומרים
1. לפני mutagenesis: הכנת אלקטרו המוסמכת JS200 LF-Pol התאים לי
2. Mutagenesis: הפיכת היעד פלסמיד
3. Mutagenesis: התאוששות פלסמיד
4. איטרציה
5. Readout
השנייה. מסך Mutant וניתוח Trait באמצעות פלטות צמיחה הדרגתי.
כדי להמחיש עד כמה את המגוון הגנטי העצום הנוכחי בספריות שלנו יכול להיות מצמידים את מבחר פונקציונלי, כאן אנו מספקים פרוטוקול של התרופה מבוסס בחירות פונקציונלי in vivo ב E. coli. שיטה זו מבוססת על צמיחה לאורך שיפוע תרופה על אגר מוצק. זה מאפשר אפיון סימולטני של מספר רב של דגימות (עד 12) על פני טווח של ריכוזים, מתן טווח דינמי רחב יותר מאשר טיפול בתרופה בודדת. יתרון נוסף הוא כי את ההודעה הלא ליניארית של assay זה מאגרים הבדלים מתונה הכדאיות, בטווח של פי 2. לכן, זה assay cytotoxicity עמידות מספק אמצעי חזקים ומהירים כדי לבחור ספריות מוטציה ולקבוע את פרופיל פנוטיפי של מוטציות בודדות. איור. 2 מציג דוגמה של כל אחד מן השימושים הללו: פאנל מבחר מופעים של מוטציות בודדות מתוך ספריה האדם demethylase ABH2 חמצוני. מושבות גדל מעל הסף WT נבחרים הגנה מוגברת מפני cytotoxicity נגרמת על ידי sulfonate methylating מתיל מתאן סוכן (MMS) 7. לוח ב 'מציג דוגמה הדרגתיים המשמש לאפיון שיבוט אדם. רמת התנגדות cefotaxime הדור השלישי אנטיביוטיקה צפלוספורין מוצג על שיפוע אגר עבור WT β-lactamase ובמשך שני המורחבת ספקטרום מוטנטים, R164H ו E104K R164S G267R 4. שים לב כי בהתאם עוצמת ההשפעות שנצפו, יותר מאשר צלחת אחת עשוי להיות נחוץ עבור quantitation נאות: בעוד שיפוע 0.4mg/ml מאפשר השוואה ישירה שיבוטים שליטה, את רמת ההתנגדות של מוטציה החזק ביותר יכול רק תוקם באמצעות הריכוז גבוה יותרtration של cefotaxime (4mg/mL).
חומרים
1. בניית שיפוע
2. חותמת העברת חיידקים
3. הדמיה וניתוח צמיחה
ג. נציג תוצאות:
באיור 1. השוואה בין פרוטוקולים mutagenesis נוזלי ישיר ציפוי. ציפוי ישיר mutagenesis פרוטוקול המוצג כאן (למטה) הוא מהיר יותר ודורש פחות צעדים פרוטוקול mutagenesis נוזל המקורי שלנו (למעלה). כאשר ה-GFP משמש ככתב, וריאציות הקרינה מעידים על להציג את המגוון הגנטי בספריה. בדרך כלל, מחזור אחד של תוצאות mutagenesis במושבות 12-18% עם ירידה ניכרת של רמות הקרינה.
איור 2. מבחני עמידות צבע. לוח מבחר להתנגדות מוגברת מתיל-Methanesulfonate (MMS). פלסמיד של ספריות demethylase האנושי ABH2 חמצוני נבחרו התנגדות מוגברת MMS. שתי ספריות אלה המייצגים שתיים עד ארבע חזרות של פרוטוקול mutagenesis מוצגים בהשוואה לסוג בר הורית (WT) ואת וקטור ריק (Δ). הקו הלבן מציין את סף שמעליה מושבות מוטציה הפרט בודדו פנוטיפי לניתוח נוסף. לוח ב 'הגנה Cefotaxime, המעידים על פעילות β-lactamase ספקטרום המורחבת. R164H R164H ו E104K G267R, שתי מוטציות של בטא lactamase זוהו בעבר הבאה LF- פול mutagenesis אני מצמידים את הבחירה aztreonam 4, מוצגים על 0.4μg/mL לבין שיפוע 4μg/mL cefotaxime. שים לב wild-type β-lactamase אנזים מעניק שום הגנה יחסית תאים להביע וקטור ריק, Δ. לכן, מוטציות אלה מייצגים את ההתפתחות של פעילות ביוכימי חדש 8,9.
איור 3. שכיחות המוטציה כפונקציה של המרחק בין אורי (ד). תדירות המוטציה הבאה מחזור אחד של mutagenesis ציפוי ישיר מוצג במרווחים של 100 נ"ב לעומת מתג RNA / DNA המוצא ColE1 של שכפול. האזור שבין 1600 ו - 2400 אינו מיוצג כי β-lactamase אינו מהווה יעד נייטרלי. נקודות מעבר β-lactamase מייצגים 200 נ"ב במרווחים לאור בתדר נמוך הכולל של מוטציה באזור זה. המגמה (המשוואה הבינומית, עם R 2 = 0.41) מוצג כקו.
משלים באיור 1. פול LF אני המכילים פול אני פלסמיד. רצף (פורמט FastA). רצף מידע לקביעת אנזים הגבלה תקין (ים) לשימוש בעת linearizing פול אני פלסמיד או עבור איטרציה (דור צעד ספריה מוטציה אקראית 4) או readout (שלב 5). B תכונות כלליות מפת הגבלה של הפלסמיד. מיקום ממוצא pSC101 של שכפול, סמן התנגדות chloramphenicol (CAT) ו LF-Pol גן אני מוצגים. המיקום של אתרי ההגבלה יחיד מצוין גם כן.
ספריה | ישיר ציפוי | נוזל (1 כל יום) | נוזל (3 ימים) | |
מוטציות (#) | 95 | 40 | 142 | |
רצף המשובטים | 288 | 96 | 190 | |
סה"כ כיסוי (נ"ב) | 182.000 | 102.000 | 213.000 | |
מוטציה freq (x10 3 נ"ב) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
תדר d <1000 (x10 3 נ"ב) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
טבלה 1. מוטציה תדרים תדרים (כפי שבאה לידי ביטוי # של מוטציות / bp) עבור d <1000, כלומר בתוך 1000 bp סמוך למעבר RNA / DNA, במשך שלושה פרוטוקולים mutagenesis:. ציפוי ישיר, הרוויה נוזלי (1 כל יום), ו hypersaturation נוזלי ( 3 ימים).
ישיר ציפוי | נוזל | ||
מוטציות (#) | 95 | 182 | |
ספקטרום (%) | |||
A ל-G | A ל-G | 6.3 | 19.2 |
T ל-C | 4.2 | 3.8 | |
C ל-T | G ל-A | 27.4 | 13.7 |
C ל-T | 35.8 | 35.2 | |
ל-T | ל-T | 5.3 | 8.2 |
T ל-A | 5.3 | 7.1 | |
T ל-G | T ל-G | 1.1 | 1.1 |
ל-C | 0.0 | 2.2 | |
G ל T | G ל T | 1.1 | 2.7 |
C ל-A | 2.1 | 2.7 | |
C ל-G | C ל-G | 2.1 | 1.1 |
G ל-C | 5.3 | 2.7 | |
Indels | Ins | 3.2 | 0.0 |
דל | 1.1 | 0.0 | |
אל N | 11.6 | 29.7 | |
G ל N | 33.7 | 19.2 | |
T ל N | 10.5 | 12.1 | |
C ל N | 40.0 | 39.0 | |
Ts | 73.7 | 72.0 | |
טלויזיה | 22.1 | 28.0 | |
Indels | 4.2 | 0 |
טבלה 2. מדדי של מוטציה עבור ציפוי ישיר mutagenesis נוזלי. הלוח מציג את מספר מוטציות שנצפו (במספר) ואת ספקטרום מוטציה (ב%) לאחר מחזור אחד של mutagenesis. הספקטרום הוא נשבר על ידי זוגות משלימים, על ידי שינויים נוקלאוטיד, ולפי סוג של מוטציה.
מאמר זה מציג פרוטוקול mutagenesis המאפשר את הדור של ספריות גדולות מוטציה אקראית ללא צורך בשיבוט או PCR. שיטה זו מבוססת על שכפול וטעייה מועדים של קידוד פלסמיד רצף של עניין. בתיאוריה, מוטציות יש להגביל במידה רבה 100-300 נ"ב ממוקם מיד במורד הזרם של הבורר RNA / DNA, בגודל של מנהיג גדיל ביניים הופק על ידי פול אני 2,10. מצאנו כי בתנאים שהוצגו פרוטוקול זה, פול מוטציות אני להתרחש בכל רחבי הפלסמיד, אם כי בתדירות הולכת ופוחתת ככל המרחק גדל פלסמיד אורי (איור 3). ממצא זה מרמז כי המעבר או "הבורר" של פול אני אל Pol III במהלך שכפול ColE1 פלסמיד הוא הרבה יותר הדרגתית מאשר שדווח קודם לכן, לפחות בתנאי הניסוי שלנו 2, ומסכים עם מחקרים קודמים מציע יתירות פונקציונלית בין Pol Pol ו אני III 11.
הפרוטוקול המקורי שלנו תיאר mutagenesis בתרבויות נוזלי (4). פרוטוקול זה מניב 0.41 מוטציות / kb עבור d <1000, כלומר בתוך 1000 bp סמוך RNA / DNA מתג (טבלה 1). Hypersaturation ידי עזיבת תרבות נוזל בתוך שייקר במשך 3 ימים ללא תוספת של כל מדיה טרי מעלה את שכיחות המוטציה על 0.70 מוטציות / kb אבל התוצאה היא תשואה פלסמיד עני מאוד (פחות מ -1% לעומת יום 1; מידע לא מוצג) ( טבלה 1). כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על ציפוי ישירות את הטרנספורמציה של יעד פלסמיד על אגר מוצק ב 37 ° C (איור 1). פרוצדורה זו מייצרת את תדר הגדול ביותר של מוטציה / מעגל mutagenesis (0.92 מוטציות / kb עבור d <1000) ו מאוד מקל איטרציה. שינוי התנאים תרבות התקשורת מוצק משפיע גם על ספקטרום מוטציה (טבלה 2). Mutagenesis ציפוי ישיר מפחית סימנה את האסימטריה בין משלים צמד החלפות בסיס לראות תרבות נוזלי (להשוות C → T לעומת G → A ו-G מול → T → C). מצד שני, ציפוי ישיר מיוצר indels יותר (0.5% פחות מאשר 4%) וירידה במספר מוטציות G → ידי 3-לקפל, המובילה לייצוג יתר של G / C מוטציות (74%). בסך הכל, אנו מאמינים כי פשטות ויעילות מוגברת של פרוטוקול ציפוי ישיר שהוצגו כאן עולה על היתרונות של ספקטרום מוטציה מעט מאוזן יותר המיוצר על ידי mutagenesis נוזלי.
במגבלת היעד של פלסמיד, מוטציות הנוצר על ידי השיטה שלנו לא מוגבלים רצף היעד הרצוי. עם זאת, ההתפתחות של פעילויות ביוכימיות רומן צריך להיות תלוי מוטציות בתוך הגן היעד, שכן היא מייצגת איכותי ולא שינוי כמותי. לפיכך, שילוב mutagenesis הפלסמיד שלנו עם הקרנה של מוטציות על צלחות שיפוע מנצל את היתרונות של המערכת שלנו (ספריות גדולות וזמינות של מבחר) לאבולוציה של מאפיינים ביוכימיים חדשים. יישומים אחרים של mutagenesis אקראי כגון אופטימיזציה של הפעילות האנזימטית קיימים או אקראי אזורים ספציפיים של גן דורשים שיבוט הבאים mutagenesis אקראי. במקרה זה, בעל ספריה הפלסמיד לעומת מוצר הגברה PCR משפר את יעילות שיבוט ידי הקלת הגברה הגבלה.
לסיכום, אנחנו מדגימים את פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית עבור גן מטרה בהתחשב בעובדה בולטת בפשטותה לגיוון של ספריות שנוצר. אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להיות יחד עם בחירות פונקציונלי לאבולוציה יעיל של פעילויות ביוכימיות חדש. בנוסף, שלנו vivo שנוצר ספריות ניתן לשכפל בקלות, ומאפשר לאתר ספציפי mutagenesis או אופטימיזציה של הפעילות הקיימת.
עבודה זו נתמכה על ידי פרס CA116429 K08-04 ל MC ועל ידי מענק מטעם סרטן לכבוש את עכשיו (הנוגעים) תשתית # 8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved