בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

Summary

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

Abstract

הדור יעיל של המגוון הגנטי מייצג כלי מולקולרית יסולא בפז כי ניתן להשתמש בתווית סינתזה של DNA, כדי ליצור חתימות מולקולרי ייחודי, או להתפתח חלבונים במעבדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר דור (> 10 ¹¹⁾ ספריות גדולות מוטציה עבור רצף יעד נתון. שיטה זו מבוססת על שכפול של קידוד ColE1 פלסמיד רצף הרצוי על ידי גרסה נמוכה נאמנות של פולימראז ה-DNA אני (LF-Pol אני). היעד פלסמיד הופכת זן המוטטורי של E. coli ו מצופה על התקשורת מוצק, מניב בין 0.2 ל 1 מוטציות / kb, בהתאם למיקום של גן המטרה. תדרים מוטציה גבוהה מושגות על ידי iterating תהליך זה של mutagenesis. בהשוואה לשיטות חלופיות mutagenesis, פרוטוקול שלנו בולטת בפשטותה, שכן לא שיבוט PCR או מעורבים. לכן, השיטה שלנו הוא אידיאלי עבור תיוג מוטאציות של פלסמידים או אחרת אני תבניות פול או לחקור חלקים גדולים של מרחב רצף לאבולוציה של פעילויות לא נוכח היעד המקורי. השליטה במרחב הדוק כי PCR או להציע אקראי oligonucleotide שיטות המבוססות יכול גם להיות מושגת באמצעות שיבוט הבאות של חלקים מסוימים של הספרייה. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מראה כיצד ליצור ספריה מוטציה אקראית וכיצד להקים התרופה מבוססת בחירות E. coli כדי לזהות מוטציות מציג פעילויות ביוכימיות חדש.

Protocol

אני דור ספריית מוטציה אקראית

פול אני מתווכת חניכה של שכפול ColE1 פלסמיד (הנסקרת ב ^(1-3). השיטה שלנו של mutagenesis מבוסס על הנחת רצף היעד ColE1 פלסמיד סמוך למקור או שכפול הפצת זה בתאים לבטא נמוכה נאמנות פולימראז ה-DNA אני (LF-Pol אני). LF-Pol אני הוא פולימראז ה-DNA מוטנטי אני קידוד שלוש מוטציות כי הירידה נאמנות של שכפול, כלומר I709N (מוטיב), A759R (מוטיב B) D424A (inactivating הגהה) ^4,5 . LF-Pol אני מתבטא זן החיידק, JS200, בעל אלל טמפרטורה רגיש של פול אני (polA12) (6), כך LF-Pol אני הופך את הפעילות השולט על 37 ° C. שכפול של רצף היעד polA12 תאים תחת תנאים מגבילים תוצאות בדור של ספריה מוטציה אקראית. mutagenesis יעיל יותר בתרבויות רווי ^4. מסיבות שאינן ברורות עדיין, mutagenesis אינו רציף, כלומר תדירות המוטציה אינה מגדילה באופן ליניארי עם מספר דורות של תרבות אחת מגיע לרוויה, גם אם תאים מותר להרחיב עוד יותר בתקשורת טריים. לכן, נוסף להגדיל את העומס מוטציה של הספרייה דורש איטרטיבי סבבי mutagenesis ושחזור פלסמיד. כאן אנו מספקים פרוטוקולים mutagenesis אני LF-Pol. שים לב כי הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מפושטת ניכרת ביחס ⁴ התיאור המקורי שלנו על מנת להקל איטרציה של התהליך להשגת לטעון מוטציה הרצוי (איור 1).

חומרים

• תאים: JS200 recA718 polA12 (TS) uvrA155 trpE65 לון-11 Sula
  • JS200 WT-Pol אני: JS200 תאים לבטא סוג הבר (WT) Pol אני
  • JS200 LF-Pol אני: JS200 להביע נאמנות נמוכה (LF) Pol אני
  • זן readout: JS200 WT-Pol אני או (עבור השלמה) זן חסר פעילות ספציפיים
• פלסמיד יעד
  • פלסמיד המכיל מקור ColE1 של שכפול גנטי עם היעד משובטים ב

1. לפני mutagenesis: הכנת אלקטרו המוסמכת JS200 LF-Pol התאים לי

1. פיק יחיד JS200 LF-Pol המושבה אני מהצלחת LB גדל בקצב של 30 ° C (בתנאי מתירני) לילה המכילים את מבחר אנטיביוטי מתאים הנושאת את הפלסמיד LF-Pol אני (0.03mg / mL chloramphenicol) והמקום המושבה לתוך מבחן שפופרת המכילה 8 מ"ל של LB עם chloramphenicol. לגדול התרבות ב 30 ° C ו 250rpm רועד בכל לילה.
2. בבוקר, להרחיב את התרבות על ידי מזיגת 8 מ"ל של JS200 LF-Pol אני לתוך בקבוק המכיל 400 מ"ל LB עם chloramphenicol. בואו התרבות יגדל ב 30 ° C תוך רועד בכל 250rpm עד שהוא מגיע ₆₀₀ של 0.4-0.7 (בדרך כלל 3-4H).
3. פעם ב ₆₀₀ של 0.4-0.7, הקור תרבות על קרח רטוב במשך 15 דקות.
4. העברת התרבות מקורר למיכל מתאים צנטריפוגה. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C. יוצקים את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של גליצרול (על קרח רטוב) סטרילית צונן 10% המיכל מחדש להשעות את התאים בעזרת פיפטה סרולוגיות.
5. העברה מחדש מושעה תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מלאו את צינור חרוטי עד 45 מ"ל סימן עם גליצרול 10% ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 4 ° C ו 4000rpm.
6. יוצקים את supernatant, להוסיף 10 מ"ל פעם יותר של גליצרול 10% צינור חרוטי, מחדש להשעות את התאים בעזרת פיפטה סרולוגיות או רגיל. שוב, למלא את צינור חרוטי על 45 מ"ל סימן עם גליצרול 10% צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 4 ° C ו 4000rpm. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות כדי להסיר את כל עקבות של מלחים.
7. אחרי הסיבוב האחרון, מחדש להשעות את גלולה של תאים בחלק שווה גליצרול 10% (כלומר מחדש להשעות 2 מ"ל של תאים עם 2 מ"ל של גליצרול 10%).
8. Aliquot μL בין 100 לבין 500 μL של התאים תלוי לתוך צינורות אחסון מספר. מהיר להקפיא את התאים קרח יבש ולאחר מכן לאחסן אותם ב -80 ° C.
9. לפני השימוש תאים אלקטרו המוסמכת טרנספורמציות, להפשיר את התאים בהדרגה על הקרח.

2. Mutagenesis: הפיכת היעד פלסמיד

1. פיפטה 40 μL של אלקטרו המוסמכת JS200 LF-Pol התאים לי בין 30-250ng של ה-DNA היעד הפלסמיד לתוך קובט electroporation הפער 2mm.
   הערה # 1: ה-GFP ColE1 המכיל פלסמיד יכול להתבצע באמצעות mutagenesis במקביל הגן היעד כביקורת. לאחר השלמת השלב readout, GFP יכול להיות מצופה על צלחות אגר LB ו דמיינו עבור mutagenesis. המושבות המופיעות כהה או עמום מכילים מוטציות inactivating.
2. דופק את התערובת electroporator ב 1800V. בדוק את זמן קבוע (ט _ג) כדי להבטיח תנאים electroporation אחיד עבור כל דגימה; אידיאלי T _C = 5-6 שניות.
3. לשחזר את תערובת תאים / מ"ל ​​1-DNA של מרק LB במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (מיל 'התנאים trictive) רועד בסל"ד 250.
4. פלייט 50 μL של התרבות התאוששות על צלחת פטרי אגר LB 100mm מראש לחמם 37 ° C המכיל שני chloramphenicol ואת הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה על בחירת היעד פלסמיד.
   הערה: מס '2: כוון אל צלחת התאים על ריכוז "ליד הדשא". ריכוז "ליד הדשא" מוגדר כמספר ברורה אך רבים מספור של מושבות (> 1000 מושבות / תבשיל 100mm). דילול מצופה, אם בכלל, תלוי איך אלקטרו המוסמכת התאים. אם התאים אינם מאוד אלקטרו מוכשר "הדשא ליד" אינו בר השגה על ידי ציפוי התרבות התאוששות "מסודר", ולאחר מכן צנטריפוגות התרבות התאוששות עבור 2 דקות 4000rpm, לשפוך את supernatant, מחדש להשעות את התאים 50 μL של מרק LB ו צלחת התרבות.
5. דגירה dishe פטרי (ים) לילה בשעה 37 ° C.

3. Mutagenesis: התאוששות פלסמיד

1. למחרת, לשטוף את צלחות פטרי ידי pipetting 2 מ"ל של מרק LB על התאים. העברת מושבות חיידקים מן המנות אגר LB פטרי על מרק LB על ידי "קרצוף" להם את צלחת עם מוט בצורת משולש זכוכית מעוקר. הוסף 1 מ"ל של מרק LB הראשונה, לאסוף את לשטוף לחזור על התהליך עם מ"ל השני של מרק LB.
2. לבודד את הדנ"א פלסמיד מתוך לשטוף את הצלחת. (זה ה-DNA פלסמיד מהווה את הספרייה).
   הערה # 3: לשטוף שנאספו צלחת LB עשוי להיות צפוף מדי מיני הכנה בשלמותה. אם זה המקרה, מיני הכנה מקסימלית הסכום המוקצב על ידי ערכת שלך מיני הכנה (בדרך כלל, זה מעורב דילול לשטוף שלך OD = 1 ו prepping ~ 3 מ"ל של התרבות בדילול מלא) או בהיקף של עד prep-maxi

4. איטרציה

1. הגבל 1μg של ה-DNA פלסמיד מבודד עם אנזים הגבלה כי linearizes LF-Pol אני פלסמיד, אבל לא לחתוך היעד שלך פלסמיד (משלים איור 1).
2. לנקות את לעכל הגבלה באמצעות ערכת טיהור DNA.
   הערה # 4: צעד זה מסיר כל עקבות של אנזים הגבלה המאגר שלה. צעד זה חיוני כדי לשמור על ריכוז מלח נמוך אלקטרו המוסמכת טרנספורמציות הבאים.
3. Re-transform 30-250ng של חזרה לספריה מוגבלת הפלסמיד לתוך היעד טרי JS200 LF-Pol אני תאים לשים את ספריה באמצעות סיבובים הבאים של mutagenesis.
   הערה מס '5: Linearizing פול אני הפלסמיד בעזרת אנזים הגבלה מבטיחה רק את המטרה פלסמיד מקבל טרנספורמציה.
4. חזור על סעיפים 2 ו 3.

5. Readout

1. הגבל את הדנ"א פלסמיד מבודד עם אנזים הגבלה (ים) כי linearizes הן היעד הפלסמיד ואת פול אני פלסמיד. הפעל את לעיכול על 1% agarose ג'ל על מנת להבטיח כמות ואיכות של פלסמידים. הגבלת ~ 400ng של ה-DNA פלסמיד בודד הוא בדרך כלל מספיקים לניתוח.
2. הגבל 1μg של ה-DNA פלסמיד מבודד עם אנזים הגבלה כי linearizes LF-Pol אני פלסמיד, אבל לא לחתוך פלסמיד היעד שלך.
3. לנקות את לעכל הגבלה באמצעות ערכת טיהור DNA.
4. המרה ספריית היעד מוגבלת הפלסמיד לתוך זן readout לאפיין את המוטציות.

השנייה. מסך Mutant וניתוח Trait באמצעות פלטות צמיחה הדרגתי.

כדי להמחיש עד כמה את המגוון הגנטי העצום הנוכחי בספריות שלנו יכול להיות מצמידים את מבחר פונקציונלי, כאן אנו מספקים פרוטוקול של התרופה מבוסס בחירות פונקציונלי in vivo ב E. coli. שיטה זו מבוססת על צמיחה לאורך שיפוע תרופה על אגר מוצק. זה מאפשר אפיון סימולטני של מספר רב של דגימות (עד 12) על פני טווח של ריכוזים, מתן טווח דינמי רחב יותר מאשר טיפול בתרופה בודדת. יתרון נוסף הוא כי את ההודעה הלא ליניארית של assay זה מאגרים הבדלים מתונה הכדאיות, בטווח של פי 2. לכן, זה assay cytotoxicity עמידות מספק אמצעי חזקים ומהירים כדי לבחור ספריות מוטציה ולקבוע את פרופיל פנוטיפי של מוטציות בודדות. איור. 2 מציג דוגמה של כל אחד מן השימושים הללו: פאנל מבחר מופעים של מוטציות בודדות מתוך ספריה האדם demethylase ABH2 חמצוני. מושבות גדל מעל הסף WT נבחרים הגנה מוגברת מפני cytotoxicity נגרמת על ידי sulfonate methylating מתיל מתאן סוכן (MMS) ^7. לוח ב 'מציג דוגמה הדרגתיים המשמש לאפיון שיבוט אדם. רמת התנגדות cefotaxime הדור השלישי אנטיביוטיקה צפלוספורין מוצג על שיפוע אגר עבור WT β-lactamase ובמשך שני המורחבת ספקטרום מוטנטים, R164H ו E104K R164S G267R ^4. שים לב כי בהתאם עוצמת ההשפעות שנצפו, יותר מאשר צלחת אחת עשוי להיות נחוץ עבור quantitation נאות: בעוד שיפוע 0.4mg/ml מאפשר השוואה ישירה שיבוטים שליטה, את רמת ההתנגדות של מוטציה החזק ביותר יכול רק תוקם באמצעות הריכוז גבוה יותרtration של cefotaxime (4mg/mL).

חומרים

• ציוד
  • 100x100x15mm מרובע פטרי מנות (פישר Sci # 0875711A)
  • 100mm צלחת פטרי עגול
  • מיקרוסקופ 25x75x1mm זכוכית שקופית (פישר Sci # 1255015)
  • צינור 50 מ"ל בוגר
• מדיה
  • אגר LB: נמס equilibrated באמבט מים 56 ° C
    הערה מס '6: טמפרטורה של התקשורת עשוי להשפיע על יציבות ולכן הפעילות של התרופה או תרכובת נבדקות.
  • אגר רך: נמס equilibrated באמבט מים עד 42 ° C

1. בניית שיפוע

1. אחרי עשרה נתיבים, מחולקת באופן שווה על פני קצה אחד של החלק התחתון של צלחת פטרי רבועים.
2. מניחים את צלחת בשיפוע כזה בקצה המסומן התחתונה היא 7mm גבוהות;
   דשא עבה או אובייקט שטוח אחרים יכולים לשמש תמיכה לרומם את המנה. יוצקים 25 מ"ל של חם (~ 56 ° C) אגר LB מעורבב היטב עם ריכוז מתאים של הסוכן בחירת לתוך צלחת נוטה. זוהי השכבה התחתונה של שיפוע. ודא אגר LB שווה המעילים צלחת פטרי כזה בסוף גבוהות, מסומן המנה מכילה ~ 1mm של אגר LB והחלק הוריד מכיל ~ 8mm של אגר LB. ואז לאפשר אגר לקביעת במשך 10-15 דקות.
   הערה # 7: עבור סוכני בחירת הידרופובי, פעילי שטח 0.1% (antifoam B אמולסיה) ניתן להוסיף אגר LB כדי להקל על השעיה ועל התפלגות אחידה של התרופה. הוסף פעילי שטח כדי לחמם את אגר LB סטרילי עם נמרצת רועד לפני תוספת של הסוכן בחירה. פעילי שטח צריך להשעות כמו ערפל עדין של טיפות קטנות, טיפות גדולות מצביעים התקשורת הוא חם מדי ועלול לעכב את התפלגות אחידה של התרופה הבדיקה.
3. לאחר first 25 מ"ל של אגר LB יש מוקשה, המנה מועברת אל משטח שטוח. בשלב הבא, 25 מ"ל של אגר LB ללא סוכן בחירת נמזג אל שכבת פני השטח first אגר LB. זוהי השכבה העליונה של שיפוע. ודא אגר LB מכסה את כל פני השטח של השכבה התחתונה. מכסים עם מכסה באלכסון לאוורור, ולאפשר אגר לקביעת במשך 10-15 דקות.
   הערה # 8: להיות מודע לסכנות אירוסול ו volatilization הפוטנציאל של המתחם הבדיקה; לשפוך הדרגתיים במנדף כימי או ביולוגי בטיחות אם שקבע דרישות בטיחות כימית.
   הערה # 9: מנות צבע יש להשתמש בתוך 4H לשמור על שיפוע של התרופה או תרכובת ריכוז הבדיקה.

2. חותמת העברת חיידקים

1. אגר רך צריך להיות equilibrated על 42 ° C. העברת 2 מ"ל של אגר רך נוזלי לתוך המכסה או התחתון של צלחת פטרי 100mm עגול. פיפטה 40 μL של התרבות חיידקים לתוך אגר הרך ואז לערבב ידי נדנדה את הצלחת.
   הערה מס '10: שלב הצמיחה של התרבות חיידקי עשוי להשפיע על התגובה שלה לתרופה או מתחם הבדיקה. תרבויות בשלב יומן או תרבויות לילה בשלב נייחים אמור לשמש עבור תוצאות עקביות עם מדים. צפיפות התאים גם יכול להטות תוצאות יחסית, ולכן כל התרבויות צריך להיות מדולל להיות מתאימים ₆₀₀ ערכים צפיפות. תרבויות לינה צריך להיות מדולל יש ₆₀₀ צפיפות פחות מ 1.0
2. מעיל הקצה הארוך של השקופית זכוכית מיקרוסקופ עם התערובת אגר רך. ואז, יישור קצה מצופה של השקופית עם סימן התחתון (מהנמוך ריכוז גבוה) על צלחת שיפוע, לגעת להחליק על פני השטח של אגר. מגע רך מספיק כדי להעביר סרט של אגר רך על פני השטח הדרגתי. שקופית מוגדר אז בצד לניקוי ושימוש חוזר.
3. חזור על תהליך זה, לשארית של דגימות חיידקים. דגימות הפניה לכלול בצלחת בכל שיפוע אם הדרגתיים מרובים מתנהלים.
4. דגירה העליון צלחת שיפוע כלפי מטה לילה בשעה 37 ° C. טיימס וטמפרטורות של דגירה עשוי להיות שונה עבור readout זני חיידקים שונים אבל הלילה בשעה 37 ° C הוא בדרך כלל מספיק לצמיחה גלוי.

3. הדמיה וניתוח צמיחה

1. הדמיה: לאחר צמיחה לילה, מילויים ניתן הדמיה ישירות או קבוע מוכתם פתרון של 0.2mg / mL Acridine EtOH אורנג' ב 95%, כדי לשפר את החדות. צלחת הוא מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, בפתרון מכתים, שטף אז עם EtOH 95% ו צילמו אז על תיבת אור UV.
   הערה # 11: הקפד לא לשטוף מושבות מהצלחת אלא רוק הפתרון מכתים ושוטף על צלחת ולהסיר את פתרונות מהפינות.
2. לניתוח של פלסמידים פנוטיפ מוטנטי בודדים, מרחק של צמיחה נגד שיפוע הריכוז הוא מנורמל סטנדרט על כל שיפוע. ערכים אלה יחסיים מכן ניתן להשוות ברחבי הדרגתיים.
   הערה # 12: בהתאם לאופי של אפקט ציטוטוקסי, קצה חד או יתרון מפוזר יותר ניתן לצפות (השוו עבור פאנלים למשל A ו-B באיור 2). במקרה של קצוות מפוזר, רצוי למדוד את קצה of צמיחה מתמשכת, כמו במושבות הפרט נוטה להראות השתנות מוגברת.
3. לבחירת הספרייה, מושבות בודדות לגדול בריכוזים גבוהים יותר מאשר סוג של ההורים לשלוט בטבע מבודדות רצף לזהות מוטציות לתרום הגנה מוגברת.

ג. נציג תוצאות:

באיור 1. השוואה בין פרוטוקולים mutagenesis נוזלי ישיר ציפוי. ציפוי ישיר mutagenesis פרוטוקול המוצג כאן (למטה) הוא מהיר יותר ודורש פחות צעדים פרוטוקול mutagenesis נוזל המקורי שלנו (למעלה). כאשר ה-GFP משמש ככתב, וריאציות הקרינה מעידים על להציג את המגוון הגנטי בספריה. בדרך כלל, מחזור אחד של תוצאות mutagenesis במושבות 12-18% עם ירידה ניכרת של רמות הקרינה.

איור 2. מבחני עמידות צבע. לוח מבחר להתנגדות מוגברת מתיל-Methanesulfonate (MMS). פלסמיד של ספריות demethylase האנושי ABH2 חמצוני נבחרו התנגדות מוגברת MMS. שתי ספריות אלה המייצגים שתיים עד ארבע חזרות של פרוטוקול mutagenesis מוצגים בהשוואה לסוג בר הורית (WT) ואת וקטור ריק (Δ). הקו הלבן מציין את סף שמעליה מושבות מוטציה הפרט בודדו פנוטיפי לניתוח נוסף. לוח ב 'הגנה Cefotaxime, המעידים על פעילות β-lactamase ספקטרום המורחבת. R164H R164H ו E104K G267R, שתי מוטציות של בטא lactamase זוהו בעבר הבאה LF- פול mutagenesis אני מצמידים את הבחירה aztreonam ^4, מוצגים על 0.4μg/mL לבין שיפוע 4μg/mL cefotaxime. שים לב wild-type β-lactamase אנזים מעניק שום הגנה יחסית תאים להביע וקטור ריק, Δ. לכן, מוטציות אלה מייצגים את ההתפתחות של פעילות ביוכימי חדש ^8,9.

איור 3. שכיחות המוטציה כפונקציה של המרחק בין אורי (ד). תדירות המוטציה הבאה מחזור אחד של mutagenesis ציפוי ישיר מוצג במרווחים של 100 נ"ב לעומת מתג RNA / DNA המוצא ColE1 של שכפול. האזור שבין 1600 ו - 2400 אינו מיוצג כי β-lactamase אינו מהווה יעד נייטרלי. נקודות מעבר β-lactamase מייצגים 200 נ"ב במרווחים לאור בתדר נמוך הכולל של מוטציה באזור זה. המגמה (המשוואה הבינומית, עם R ² = 0.41) מוצג כקו.

משלים באיור 1. פול LF אני המכילים פול אני פלסמיד. רצף (פורמט FastA). רצף מידע לקביעת אנזים הגבלה תקין (ים) לשימוש בעת linearizing פול אני פלסמיד או עבור איטרציה (דור צעד ספריה מוטציה אקראית 4) או readout (שלב 5). B תכונות כלליות מפת הגבלה של הפלסמיד. מיקום ממוצא pSC101 של שכפול, סמן התנגדות chloramphenicol (CAT) ו LF-Pol גן אני מוצגים. המיקום של אתרי ההגבלה יחיד מצוין גם כן.

ספריה		ישיר ציפוי	נוזל (1 כל יום)	נוזל (3 ימים)
מוטציות (#)		95	40	142
רצף המשובטים	288	96	190
סה"כ כיסוי (נ"ב)	182.000	102.000	213.000
מוטציה freq (x10 3 נ"ב)	0.52	0.39	0.67
תדר d <1000 (x10 3 נ"ב)	0.92	0.41	0.70

טבלה 1. מוטציה תדרים תדרים (כפי שבאה לידי ביטוי # של מוטציות / bp) עבור d <1000, כלומר בתוך 1000 bp סמוך למעבר RNA / DNA, במשך שלושה פרוטוקולים mutagenesis:. ציפוי ישיר, הרוויה נוזלי (1 כל יום), ו hypersaturation נוזלי ( 3 ימים).

		ישיר ציפוי	נוזל
מוטציות (#)		95	182
ספקטרום (%)
A ל-G	A ל-G	6.3	19.2
	T ל-C	4.2	3.8
C ל-T	G ל-A	27.4	13.7
	C ל-T	35.8	35.2
ל-T	ל-T	5.3	8.2
	T ל-A	5.3	7.1
T ל-G	T ל-G	1.1	1.1
	ל-C	0.0	2.2
G ל T	G ל T	1.1	2.7
	C ל-A	2.1	2.7
C ל-G	C ל-G	2.1	1.1
	G ל-C	5.3	2.7
Indels	Ins	3.2	0.0
	דל	1.1	0.0
	אל N	11.6	29.7
	G ל N	33.7	19.2
	T ל N	10.5	12.1
	C ל N	40.0	39.0
	Ts	73.7	72.0
	טלויזיה	22.1	28.0
	Indels	4.2	0

טבלה 2. מדדי של מוטציה עבור ציפוי ישיר mutagenesis נוזלי. הלוח מציג את מספר מוטציות שנצפו (במספר) ואת ספקטרום מוטציה (ב%) לאחר מחזור אחד של mutagenesis. הספקטרום הוא נשבר על ידי זוגות משלימים, על ידי שינויים נוקלאוטיד, ולפי סוג של מוטציה.

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול mutagenesis המאפשר את הדור של ספריות גדולות מוטציה אקראית ללא צורך בשיבוט או PCR. שיטה זו מבוססת על שכפול וטעייה מועדים של קידוד פלסמיד רצף של עניין. בתיאוריה, מוטציות יש להגביל במידה רבה 100-300 נ"ב ממוקם מיד במורד הזרם של הבורר RNA / DNA, בגודל של מנהיג גדיל ביניים הופק על ידי פול אני ^2,10. מצאנו כי בתנאים שהוצגו פרוטוקול זה, פול מוטציות אני להתרחש בכל רחבי הפלסמיד, אם כי בתדירות הולכת ופוחתת ככל המרחק גדל פלסמיד אורי (איור 3). ממצא זה מרמז כי המעבר או "הבורר" של פול אני אל Pol III במהלך שכפול ColE1 פלסמיד הוא הרבה יותר הדרגתית מאשר שדווח קודם לכן, לפחות בתנאי הניסוי שלנו ^2, ומסכים עם מחקרים קודמים מציע יתירות פונקציונלית בין Pol Pol ו אני III ^11.

הפרוטוקול המקורי שלנו תיאר mutagenesis בתרבויות נוזלי (4). פרוטוקול זה מניב 0.41 מוטציות / kb עבור d <1000, כלומר בתוך 1000 bp סמוך RNA / DNA מתג (טבלה 1). Hypersaturation ידי עזיבת תרבות נוזל בתוך שייקר במשך 3 ימים ללא תוספת של כל מדיה טרי מעלה את שכיחות המוטציה על 0.70 מוטציות / kb אבל התוצאה היא תשואה פלסמיד עני מאוד (פחות מ -1% לעומת יום 1; מידע לא מוצג) ( טבלה 1). כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על ציפוי ישירות את הטרנספורמציה של יעד פלסמיד על אגר מוצק ב 37 ° C (איור 1). פרוצדורה זו מייצרת את תדר הגדול ביותר של מוטציה / מעגל mutagenesis (0.92 מוטציות / kb עבור d <1000) ו מאוד מקל איטרציה. שינוי התנאים תרבות התקשורת מוצק משפיע גם על ספקטרום מוטציה (טבלה 2). Mutagenesis ציפוי ישיר מפחית סימנה את האסימטריה בין משלים צמד החלפות בסיס לראות תרבות נוזלי (להשוות C → T לעומת G → ​​A ו-G מול → T → C). מצד שני, ציפוי ישיר מיוצר indels יותר (0.5% פחות מאשר 4%) וירידה במספר מוטציות G → ​​ידי 3-לקפל, המובילה לייצוג יתר של G / C מוטציות (74%). בסך הכל, אנו מאמינים כי פשטות ויעילות מוגברת של פרוטוקול ציפוי ישיר שהוצגו כאן עולה על היתרונות של ספקטרום מוטציה מעט מאוזן יותר המיוצר על ידי mutagenesis נוזלי.

במגבלת היעד של פלסמיד, מוטציות הנוצר על ידי השיטה שלנו לא מוגבלים רצף היעד הרצוי. עם זאת, ההתפתחות של פעילויות ביוכימיות רומן צריך להיות תלוי מוטציות בתוך הגן היעד, שכן היא מייצגת איכותי ולא שינוי כמותי. לפיכך, שילוב mutagenesis הפלסמיד שלנו עם הקרנה של מוטציות על צלחות שיפוע מנצל את היתרונות של המערכת שלנו (ספריות גדולות וזמינות של מבחר) לאבולוציה של מאפיינים ביוכימיים חדשים. יישומים אחרים של mutagenesis אקראי כגון אופטימיזציה של הפעילות האנזימטית קיימים או אקראי אזורים ספציפיים של גן דורשים שיבוט הבאים mutagenesis אקראי. במקרה זה, בעל ספריה הפלסמיד לעומת מוצר הגברה PCR משפר את יעילות שיבוט ידי הקלת הגברה הגבלה.

לסיכום, אנחנו מדגימים את פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית עבור גן מטרה בהתחשב בעובדה בולטת בפשטותה לגיוון של ספריות שנוצר. אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להיות יחד עם בחירות פונקציונלי לאבולוציה יעיל של פעילויות ביוכימיות חדש. בנוסף, שלנו vivo שנוצר ספריות ניתן לשכפל בקלות, ומאפשר לאתר ספציפי mutagenesis או אופטימיזציה של הפעילות הקיימת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
carbenicillin	Cellgro	46100R6	0.1mg/ml final
tetracycline	Fisher Scientific	BP7640	0.05mg/ml final
chloramphenicol	Genlantis	M120100	0.03mg/ml final
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB Broth Miller	Difco Laboratories	244620
Soft Agar	Difco Laboratories	214580	Made in house
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A38401-1
Antifoam B emulsion	Sigma-Aldrich	A5757
Glycerol	Acros Organics	332030025
100x100x15mm sq dish	Fisher Scientific	0875711A
100mm rnd dish	Fisher Scientific	0875712A
Microscope slide 25x75x1mm	Gold Seal	3048
Electroporator 2510	Eppendorf
Electroporator 2510	Eppendorf
2mm gap tubes	Molecular BioProducts	5520
Zippy mini prep kit	Zymo Research Corp.	D4020