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在这里,我们展示了一个简单的协议来创建一个给定的目标序列的随机突变体库。我们表明,这种方法,这是在大肠杆菌体内进行,如何可以再加上功能选择进化出新的酶活动。
遗传多样性的有效代一个宝贵的工具,可用于标签的DNA合成,创造出独特的分子签名,或演变在实验室中的蛋白质分子。在这里,我们提出了一个协议,允许大(> 10 月 11日)对于一个给定的目标序列的突变体库的生成。这种方法是基于一个ColE1质粒编码所需的顺序由低高保真DNA聚合酶变异的复制我(LF聚合物我)。目标质粒转化成五的mutator应变大肠杆菌和镀固体培养基上,在0.2和1个突变/ KB,根据靶基因的位置,之间产生。迭代这种突变的过程,取得了较高的突变频率。突变的替代方法相比,我们的协议代表了它的简单,没有克隆或PCR参与。因此,我们的方法是突变的质粒或其他POL我模板的标签,或探索在原来的目标,不存在活动的演变大部份的序列空间的理想选择。紧空间的控制,PCR或随机寡核苷酸为基础的方法提供也可以通过克隆库的特定部分的后续实现。在这里,我们提供的协议显示了如何创建一个随机突变体库,以及如何建立在大肠杆菌中的药物为基础的选择大肠杆菌对发现的突变体,表现出新的生化活动。
一,生成一个随机突变体库
波尔我介导启动ColE1质粒复制(检讨(1-3),我们诱变的方法是放置在一个ColE1质粒相邻的目标序列的来源或复制和传播细胞表达低高保真DNA聚合酶I的基础(LF聚合物我)。LF聚合物我是一个突变的DNA聚合酶I的编码三种突变,减少复制的保真度,即I709N(在图案中的一个),A759R(图案乙)和D424A (灭活校对)4,5 LF聚合物LF -波尔,我是在大肠杆菌菌株,JS200,我波尔(polA12)(6)的温度敏感等位基因表达,使我成为主要活动在37 ° C.复制数量目标序列。限制性条件下生成一个随机的突变体库的结果在polA12细胞的突变是更有效的在4饱和的文化,对于目前仍不清楚的原因,是不连续的突变,即基因突变频率不呈线性增加几代人的文化一旦达到饱和,即使细胞可以进一步扩大新媒体,因此,进一步增加了图书馆的突变负荷,需要反复的诱变和质粒恢复轮,在这里,我们提供LF聚合物我诱变的协议。注意:这里介绍的协议已经大大简化,以便为实现所需的突变负载(图1)迭代的过程相对于我们原来的描述4。
材料
1。前突变:JS200电主管LF聚合物我细胞的制备
2。突变:质粒转化的目标
3。质粒突变:恢复
4。迭代
5。读数
二。突变屏幕和性状分析,采用梯度生长板。
为了说明如何广阔的遗传多样性存在于我们的图书馆,可以再加上一个功能选择,在这里我们提供了药物在体内的功能在大肠杆菌中选择一个协议大肠杆菌 。这种方法是根据药物在固体琼脂梯度沿增长。这使得多个(最多12个)样品的浓度范围的同步特性,提供更广泛的动态范围比单一药物治疗。另一个优点是,这个实验中的非线性读数,缓冲区内2倍的范围内,适度的差异,在可行性。因此,这种细胞毒性电阻检测提供了一个强大的和迅速的方式,选择突变体库,并确定个别突变体的表型剖面。图2显示了每个使用的例子:面板显示的单个突变体的选择从人类的氧化去甲基ABH2库。以上WT门槛越来越殖民地被选中为增加引起的细胞毒作用的甲基化剂甲基磺酸(MMS),7保护。 B组显示,梯度用于个别克隆鉴定的一个例子。耐第三代头孢类抗生素头孢噻肟的水平,是野生型β-内酰胺酶的琼脂梯度和两个广谱的突变体,R164H,E104K R164S G267R 4所示。请注意,根据对所观察到的效果的力量,比单盘可能是必要的足够的定量的:0.4mg/ml梯度,同时可以控制克隆的直接比较,最有力的突变体的阻力水平只能建立使用较高的浓度tration头孢噻肟(4mg/mL)。
材料
1。建设梯度
2。邮票的细菌转移
3。成像和分析增长
三。代表性的成果:
图1。液体和直接电镀突变协议之间的比较 。直接电镀突变协议(底部)速度更快,需要比我们原来的液体诱变协议(顶部)步骤更少。当GFP作为一个记者,在荧光的变化指示库中的遗传多样性目前。通常情况下,一个周期的荧光水平明显下降12-18%的菌落突变结果。
图2。坡度阻力分析。阻力增大,甲基甲烷磺酸(MMS),A组的选择 。质粒人类的氧化去甲基ABH2库被选定为阻力增大到MMS。两个代表两个和四个迭代的诱变协议库是比较父母的野生型(WT)和空载体(Δ)所示。白线表示上述个别突变菌落作进一步的表型分析隔离阈值。B组用头孢噻肟的保护,超广谱β-内酰胺酶的活性的指标。R164H,E104K R164H G267R,先前发现的两种β-内酰胺酶突变体LF - POL我诱变耦合氨曲南选择4,显示在0.4μg/mL和4μg/mL头孢噻肟梯度。需要注意的是野生型β-内酰胺酶,赋予细胞表达一个空向量,Δ相对没有保护。因此,这些突变的一个新的生化活动8,9发展。
图3。作为ORI距离(D)功能的突变频率 。以下单周期的直接电镀诱变的突变频率是100 BP间隔相对ColE1起源的复制的RNA / DNA开关。 1600和2400之间的区域,是不是代表,因为β-内酰胺酶,并不代表一个中立的目标。超出β-内酰胺酶的点代表200 bp的突变在这方面的整体低频的间隔。趋势(二项式方程的R 2 = 0.41),显示为一条线。
补充图1。我含低频POL POL我质粒。一个序列 (FASTA格式)。序列信息确定适当的限制性内切酶(S)使用线性POL我质粒时,迭代(随机突变库第4步代)或读数(步骤5)。B一般功能和限制的质粒地图。 pSC101原产地复制,氯霉素抗性标记(CAT)和LF聚合物I基因的位置。以及单一酶切位点的位置表示。
图书馆 | 直接电镀 | 液体 (1天) | 液体 (3天) | |
突变(#) | 95 | 40 | 142 | |
克隆测序 | 288 | 96 | 190 | |
全覆盖(BP) | 182000 | 102000 | 213000 | |
突变频率(X10 3 BP) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
D <1000频率(X10 3 BP) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
表1。突变频率为D <1000,即频率(#突变/ BP)在1000 BP相邻的RNA / DNA开关,3个突变协议,:直接电镀,液体饱和度(1天),液体hypersaturation( 3天)。
直接电镀 | 液体 | ||
突变(#) | 95 | 182 | |
频谱(%) | |||
A至G | A至G | 6.3 | 19.2 |
T到彗星 | 4.2 | 3.8 | |
彗星为T | G为一个 | 27.4 | 13.7 |
彗星为T | 35.8 | 35.2 | |
A至T | A至T | 5.3 | 8.2 |
T为一个 | 5.3 | 7.1 | |
T到摹 | T到摹 | 1.1 | 1.1 |
A至C | 0.0 | 2.2 | |
摹到T | 摹到T | 1.1 | 2.7 |
C到A | 2.1 | 2.7 | |
C至G | C至G | 2.1 | 1.1 |
G到彗星 | 5.3 | 2.7 | |
INDELS | 宏 | 3.2 | 0.0 |
德尔 | 1.1 | 0.0 | |
A至N | 11.6 | 29.7 | |
G至N | 33.7 | 19.2 | |
T到ñ | 10.5 | 12.1 | |
彗星为N | 40.0 | 39.0 | |
TS | 73.7 | 72.0 | |
电视机 | 22.1 | 28.0 | |
INDELS | 4.2 | 0 |
表2。直接电镀液的诱变指标的突变 。表列出了观察到的突变数(数量)和突变谱(%)以下的单周期突变。互补对频谱分解,核苷酸的变化,突变类型。
本文介绍了突变的协议,它允许生成大量的随机突变库,而不需要进行克隆或PCR。这种方法是基于对容易出错的复制质粒的编码序列的利益。从理论上讲,基因突变应在很大程度上制约100-300位于下游的RNA / DNA开关立即基点,领导人链中间的大小产生波尔我 2,10 。我们发现,在本议定书中提出的条件下,波尔我的突变发生各地质粒,虽然在频率递减质粒ORI增加(图3)的距离。这一发现意味着过渡或"开关"我从波尔在ColE1质粒复制波尔三是比以前的报道更逐步至少在我们的实验条件,并同意与早先的研究表明POL我和波尔之间的功能冗余,三11。
我们原来的协议描述(4)液体培养的突变。该协议的产量在1000 BP相邻的RNA / DNA开关(见表1)D <1000,即0.41突变/ KB。离开3天的液体培养摇床,没有增加任何新媒体Hypersaturation引发基因突变频率0.70突变/ KB,但在十分恶劣的质粒产量的结果(小于1%相比,每日1次;,数据未显示)(表1)。在这里,我们提出了一个简化的协议基础上,直接电镀固体琼脂质粒改造的目标,在37 ° C(图1)。此过程产生的最大频率/周期诱变突变(0.92突变/ D <1000 KB),极大地方便了迭代。固体介质改变培养条件,也影响的突变谱(见表2)。直接电镀诱变降低之间存在明显的互补碱基对在液体培养基中看到换人的不对称性(比较C→T与摹→A和A→G与T→彗星)。另一方面,直接电镀生产更多的INDELS(小于0.5%至4%)和A→G突变的数量下降了3倍,领先的G / C突变(74%)的比例过高。总体而言,我们认为,更简单和直接电镀这里介绍的协议效率的提高超过了稍微平衡液体诱变产生的突变谱的好处。
在目标质粒,我们的方法所产生的突变是不限制到所需的靶序列。然而,新颖的生化活动的演变应依赖于内的靶基因的突变,因为它代表了定性,而不是一个由量变。因此,结合梯度板的突变体的筛选质粒突变,我们利用我们的系统演化的新的生化特性(大型图书馆和选择可用性)的优势。优化现有的酶活性的或随机的基因的特定领域,如随机突变的其他应用程序需要克隆的随机突变。在这种情况下,质粒库,而不是一个PCR扩增产物提高克隆的效率,促进扩增和限制性。
总之,我们展示了一个简单的协议创造一个给定的靶基因,因其简单性和生成的库的多样性,突出的随机突变体库。我们表明这种方法可以高效演进的新的生化活动的功能选择。此外,我们在体内生成的库可以轻松克隆,允许特定地点的突变或优化现有的活动。
这项工作已经支持K08奖CA116429 - 04到MC,并授予一个从征服癌症(关注)的基础#8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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