导演蛋白质的演化突变和功能选择协议 E。大肠杆菌</em

摘要

在这里，我们展示了一个简单的协议来创建一个给定的目标序列的随机突变体库。我们表明，这种方法，这是在大肠杆菌体内进行，如何可以再加上功能选择进化出新的酶活动。

摘要

遗传多样性的有效代一个宝贵的工具，可用于标签的DNA合成，创造出独特的分子签名，​​或演变在实验室中的蛋白质分子。在这里，我们提出了一个协议，允许大（> 10 ^月 11日）对于一个给定的目标序列的突变体库的生成。这种方法是基于一个ColE1质粒编码所需的顺序由低高保真DNA聚合酶变异的复制我（LF聚合物我）。目标质粒转化成五的mutator应变大肠杆菌和镀固体培养基上，在0.2和1个突变/ KB，根据靶基因的位置，之间产生。迭代这种突变的过程，取得了较高的突变频率。突变的替代方法相比，我们的协议代表了它的简单，没有克隆或PCR参与。因此，我们的方法是突变的质粒或其他POL我模板的标签，或探索在原来的目标，不存在活动的演变大部份的序列空间的理想选择。紧空间的控制，PCR或随机寡核苷酸为基础的方法提供也可以通过克隆库的特定部分的后续实现。在这里，我们提供的协议显示了如何创建一个随机突变体库，以及如何建立在大肠杆菌中的药物为基础的选择大肠杆菌对发现的突变体，表现出新的生化活动。

研究方案

一，生成一个随机突变体库

波尔我介导启动ColE1质粒复制（检讨^（1-3），我们诱变的方法是放置在一个ColE1质粒相邻的目标序列的来源或复制和传播细胞表达低高保真DNA聚合酶I的基础（LF聚合物我）。LF聚合物我是一个突变的DNA聚合酶I的编码三种突变，减少复制的保真度，即I709N（在图案中的一个），A759R（图案乙）和^D424A （灭活校对）4,5 LF聚合物LF -波尔，我是在大肠杆菌菌株，JS200，我波尔（polA12）（6）的温度敏感等位基因表达，使我成为主要活动在37 ° C.复制数量目标序列。限制性条件下生成一个随机的突变体库的结果在polA12细胞的突变是更^有效的在4饱和的文化，对于目前仍不清楚的原因，是不连续的突变，即基因突变频率不呈线性增加几代人的文化一旦达到饱和，即使细胞可以进一步扩大新媒体，因此，进一步增加了图书馆的突变负荷，需要反复的诱变和质粒恢复轮，在这里，我们提供LF聚合物我诱变的协议。注意：这里介绍的协议已经大大简化，以便为实现所需的突变负载（图1）迭代的过程相对于我们原来^的描述4。

材料

• 细胞：JS200 recA718 polA12（TS）uvrA155 trpE65 LON - 11苏拉
  • JS200的WT - POL：JS200细胞表达野生型（WT）波尔我
  • JS200低频聚合物我：JS200表达低的保真度（星期三）波尔我
  • 读数应变：JS200的WT - POL I或（互补）的应变，缺乏一个特定的活动
• 目标质粒
  • 质粒的克隆目标基因的复制ColE1起源

1。前突变：JS200电主管LF聚合物我细胞的制备

1. 从30℃（宽松的条件，请选择）长出了LB平板单一JS200 LF聚合物我的殖民地一夜之间LF聚合物我（0.03mg / mL氯霉素）的质粒轴承包含适当的抗生素选择和放置到测试的殖民地管内含有与氯霉素的LB 8毫升。文化增长30 ° C和摇晃一夜之间在250rpm。
2. 在早上，扩大与氯霉素含有400毫升LB培养基的烧瓶中倒入8毫升JS200 LF - 波尔我的文化。让文化的增长在30 ° C，而在250rpm晃动，直到达到0.4-0.7一个_600（一般为3 - 4H）。
3. 一旦在0.4-0.7一个_600，冷却15分钟的湿冰文化。
4. 将冷冻文化离心适当的容器。沉淀细胞在4 ° C离心倒掉上清液，然后加10毫升无菌和冰鲜（湿冰）10％的甘油，使用血清吸管容器和重新暂停细胞。
5. 重悬细胞转移到50 mL锥形管。填充锥形管，用10％甘油45毫升标记，然后离心15分钟，在4 ° C和4000RPM。
6. 倒掉上清液，加一次10毫升10％甘油的锥形管，并重新暂停使用血清或正常吸管的细胞。同样，填补了10％甘油和15分钟的离心锥管45毫升标记在4 ° C和4000RPM。重复这一过程中，两次以除去所有盐的痕迹。
7. 最终分拆后，重新暂停在相等的部分10％的甘油的颗粒细胞（即重新暂停2毫升细胞与2毫升10％甘油）。
8. 分装在100μL和500μL悬浮细胞成几个存储管。速冻干冰的细胞，然后存放在-80 ° C。
9. 在使用电主管转换的细胞，慢慢在冰上解冻的细胞。

2。突变：质粒转化的目标

1. 吸取40微升电主管JS200 LF聚合物我细胞与成2mm的差距电比色皿的目标质粒DNA 30 - 250ng。
   注1：一个ColE1质粒含有绿色荧光蛋白可以通过与作为对照的靶基因平行突变进行。读出一步完成后，GFP可镀的LB琼脂平板和诱变可视化。出现深色或暗淡的殖民地包含失活的突变。
2. 在electroporator 1800V脉冲的混合物。检查的时间常数_（T C），以确保对每一个样品的均匀电条件; _理想 T C = 5-6秒。
3. 恢复细胞/ DNA混合物在37℃（40分钟1 mL LB培养基中trictive条件）在250转摇晃。
4. 板50μL恢复文化的一个100mm的LB琼脂培养皿上预先加热至37 ° C含有氯霉素和目标质粒的抗生素选择适当的浓度。
   注：＃2：目标板在“不久的草坪”浓度的细胞。一个“附近的草坪”的浓度被定义为一个鲜明的殖民地，但不可数数（> 1000菌落/百毫米盘）。镀稀释，如果有的话，将取决于如何电主管细胞。如果细胞不是很电主管和一个“附近的草坪”是不是可以实现电镀恢复文化“整齐”，然后离心2分钟，恢复文化在4000RPM，倒出上清液，在50个重新暂停细胞μLLB培养基和板块的文化。
5. 孵育的Petri洗涤在37（S）一夜之间° C。

3。质粒突变：恢复

1. 第二天，洗移液2 mL LB培养基中的细胞在培养皿中。从LB琼脂培养皿中的细菌菌落转移到LB培养基“净化”他们用消毒的三角形状的玻璃棒板。首先加入1 mL LB培养基中，收集洗，重复第二毫升LB肉汤步骤。
2. 隔离的质粒DNA从洗板。 （质粒DNA构成的库）。
   注3：从LB平板收集洗可能过于密集在其全部的小预习。如果是这样的情况下，小型预习最大配发金额由您的迷你准备试剂盒（通常情况下，这涉及稀释洗OD = 1和预备〜3毫升稀释后的文化），或扩展到最大准备

4。迭代

1. 孤立的质粒DNA用限制性内切酶线性化LF聚合物我质粒1μg限制，但不削减目标质粒（补充图1）。
2. 使用DNA纯化试剂盒，清理限制性消化。
   注4：这一步中删除所有的限制性内切酶和它的缓冲区的痕迹。这一步是必须保持低盐浓度为后续电主管转换。
3. 重新改造限制的目标质粒到新鲜JS200 LF聚合物细胞库回30 - 250ng通过随后的几轮的诱变库。
   注5：POL我质粒用限制性内切酶线性化，确保目标质粒得到转化。
4. 重复第2和第3。

5。读数

1. 限制孤立的质粒DNA用限制性内切酶（S）的线性化目标质粒和POL我质粒。运行在1％琼脂糖凝胶的精华，以确保质粒的数量和质量。限制〜400ng的孤立的质粒DNA通常是足够进行分析。
2. 孤立的质粒DNA用限制性内切酶线性化LF聚合物我质粒1μg限制，但不会削减你的目标质粒。
3. 使用DNA纯化试剂盒，清理限制性消化。
4. 转换成读出的应变表征突变质粒文库的限制目标。

二。突变屏幕和性状分析，采用梯度生长板。

为了说明如何广阔的遗传多样性存在于我们的图书馆，可以再加上一个功能选择，在这里我们提供了药物在体内的功能在大肠杆菌中选择一个协议大肠杆菌 。这种方法是根据药物在固体琼脂梯度沿增长。这使得多个（最多12个）样品的浓度范围的同步特性，提供更广泛的动态范围比单一药物治疗。另一个优点是，这个实验中的非线性读数，缓冲区内2倍的范围内，适度的差异，在可行性。因此，这种细胞毒性电阻检测提供了一个强大的和迅速的方式，选择突变体库，并确定个别突变体的表型剖面。图2显示了每个使用的例子：面板显示的单个突变体的选择从人类的氧化去甲基ABH2库。以上WT门槛越来越殖民地被选中为增加引起的细胞毒作用的甲基化剂甲基磺酸^{（MMS），7}保护。 B组显示，梯度用于个别克隆鉴定的一个例子。耐第三代头孢类抗生素头孢噻肟的水平，是野生型β-内酰胺酶的琼脂梯度和两个广谱的突变体^{，R164H，E104K} R164S G267R 4所示。请注意，根据对所观察到的效果的力量，比单盘可能是必要的足够的定量的：0.4mg/ml梯度，同时可以控制克隆的直接比较，最有力的突变体的阻力水平只能建立使用较高的浓度tration头孢噻肟（4mg/mL）。

材料

• 设备
  • 100x100x15mm平方米培养皿（费舍尔科学＃0875711A）
  • 100毫米一轮培养皿
  • 25x75x1mm玻璃显微镜幻灯片（菲舍尔科学＃1255015）
  • 50毫升管毕业
• 媒体
  • LB琼脂融化水浴中平衡，并在56 ° C
    注6：媒体的温度可能会影响稳定，因而正在研究的药物或复合活动。
  • 软琼脂融化，在水浴中平衡至42 ° C

1。建设梯度

1. 马克十车道，跨平方米的培养皿底部的一个边缘均匀间隔。
2. 放置在一个倾斜等，显着的底部边缘升高7毫米的菜;
   厚的草或其他平面物体上，可以被用来作为支持提升菜。倒入25毫升温水（〜56 ° C）以及LB琼脂混合成斜盘选择代理的适当集中。这是一个渐变的底层。确保LB琼脂均匀覆盖的培养皿中，这样的菜明显升高，最终包含LB琼脂〜1mm和降低部分包含〜LB琼脂8毫米。然后让琼脂为10-15分钟。
   注7：对于疏水性选择剂，可添加0.1％的表面活性剂（消泡剂乙乳液）的LB琼脂，便于悬挂和均匀分布的药物。添加表面活性剂的热情无菌的LB琼脂剧烈摇晃前除了选择代理。表面活性剂应暂停作为一个小水滴的罚款阴霾的，大的飞沫媒体太热，并可能抑制试验药物的均匀分布。
3. 第25 mL的LB琼脂硬化后，菜是一个平坦的表面上移动。下一步，没有选择剂25毫升LB琼脂倒入覆盖第一的LB琼脂表面。这是一个渐变的顶层。确保LB琼脂覆盖整个表面的底层。盖上盖通风那副，并允许琼脂为10-15分钟。
   注8：了解气溶胶的危害和对测试化合物的潜在挥发;倒在化学安全要求“规定的化学或生物安全罩的梯度。
   注9：渐变的食物应在4h内用于维持的药物或测试化合物的浓度梯度。

2。邮票的细菌转移

1. 软琼脂应平衡至42 ° C。转移到一个100mm的圆形培养皿底部的盖子或2毫升的液体软琼脂。吸取40μL的细菌培养到软琼脂，然后混合摇板。
   注10：细菌培养的成长阶段，可能会影响其药物或测试化合物的反应。日志相或固定相过夜培养的文化，应采用统一的结果的一致性。细胞密度也可以倾斜的相对结果，因此所有的文化，应稀释_至 600密度值匹配。稀释过夜培养应该有一个₆₀₀的密度小于1.0
2. 外套的长边与软琼脂混合物的玻璃显微镜幻灯片。然后，对准梯度菜涂层边缘的底部标志的幻灯片（从低到高浓度），触摸琼脂表面的幻灯片。柔软的触感足以转移的梯度表面的软琼脂剪彩。幻灯片，然后预留的清洁和重用。
3. 重复这一过程中，其余的细菌样本。参考样品应包括在每个梯度菜，如果正在运行多个梯度。
4. 梯度菜自上而下一夜之间在37 ° C。时间和孵化温度，可能会有所不同不同的读出的菌株，但一夜之间在37 ° C时的典型足够明显增长。

3。成像和分析增长

1. 成像：经过一夜的增长，梯度可以直接成像或固定和0.2mg的/ mL的吖啶橙与95％乙醇溶液，以提高对比度染色。板在室温下孵育5分钟，染色溶液中，，然后用95％乙醇，然后在一个紫外线灯箱成像。
   注11：小心不刷新板的殖民地，而是岩石板的染色和洗涤溶液和删除的解决方案，从角落。
2. 个别突变质粒表型分析，对浓度梯度增长的距离是一个标准，每个梯度归。这些相对值，然后可以跨梯度相比。
   注12：根据不同的细胞毒作用的性质，锋利的边缘或更弥漫的边缘，可观察（例如主机A和乙在图2比较）。在弥漫边缘的情况下，最好是衡量边缘Øf持续增长，作为单独的殖民地往往表现出增加的变异。
3. 对于库中选择，浓度比亲本的野生型控制的生长的单个菌落分离和测序，以确定更多的保护作出贡献的突变。

三。代表性的成果：

图1。液体和直接电镀突变协议之间的比较 。直接电镀突变协议（底部）速度更快，需要比我们原来的液体诱变协议（顶部）步骤更少。当GFP作为一个记者，在荧光的变化指示库中的遗传多样性目前。通常情况下，一个周期的荧光水平明显下降12-18％的菌落突变结果。

图2。坡度阻力分析。阻力增大，甲基甲烷磺酸（MMS），A组的选择 。质粒人类的氧化去甲基ABH2库被选定为阻力增大到MMS。两个代表两个和四个迭代的诱变协议库是比较父母的野生型（WT）和空载体（Δ）所示。白线表示上述个别突变菌落作进一步的表型分析隔离阈值。B组用头孢噻肟的保护，超广谱β-内酰胺酶的活性的指标。R164H，E104K R164H G267R，先前发现的两种β-内酰胺酶突变体LF - POL我诱变耦合氨曲南选择^4，显示在0.4μg/mL和4μg/mL头孢噻肟梯度。需要注意的是野生型β-内酰胺酶，赋予细胞表达一个空向量，Δ相对没有保护。因此，这些突变的一个新的生化活动^8,9发展。

图3。作为ORI距离（D）功能的突变频率 。以下单周期的直接电镀诱变的突变频率是100 BP间隔相对ColE1起源的复制的RNA / DNA开关。 1600和2400之间的区域，是不是代表，因为β-内酰胺酶，并不代表一个中立的目标。超出β-内酰胺酶的点代表200 bp的突变在这方面的整体低频的间隔。趋势（二项式方程的R ² = 0.41），显示为一条线。

补充图1。我含低频POL POL我质粒。一个序列 （FASTA格式）。序列信息确定适当的限制性内切酶（S）使用线性POL我质粒时，迭代（随机突变库第4步代）或读数（步骤5）。B一般功能和限制的质粒地图。 pSC101原产地复制，氯霉素抗性标记（CAT）和LF聚合物I基因的位置。以及单一酶切位点的位置表示。

图书馆		直接电镀	液体 （1天）	液体 （3天）
突变（＃）		95	40	142
克隆测序	288	96	190
全覆盖（BP）	182000	102000	213000
突变频率（X10 3 BP）	0.52	0.39	0.67
D <1000频率（X10 3 BP）	0.92	0.41	0.70

表1。突变频率为D <1000，即频率（＃突变/ BP）在1000 BP相邻的RNA / DNA开关，3个突变协议，：直接电镀，液体饱和度（1天），液体hypersaturation（ 3天）。

		直接电镀	液体
突变（＃）		95	182
频谱（％）
A至G	A至G	6.3	19.2
	T到彗星	4.2	3.8
彗星为T	G为一个	27.4	13.7
	彗星为T	35.8	35.2
A至T	A至T	5.3	8.2
	T为一个	5.3	7.1
T到摹	T到摹	1.1	1.1
	A至C	0.0	2.2
摹到T	摹到T	1.1	2.7
	C到A	2.1	2.7
C至G	C至G	2.1	1.1
	G到彗星	5.3	2.7
INDELS	宏	3.2	0.0
	德尔	1.1	0.0
	A至N	11.6	29.7
	G至N	33.7	19.2
	T到ñ	10.5	12.1
	彗星为N	40.0	39.0
	TS	73.7	72.0
	电视机	22.1	28.0
	INDELS	4.2	0

表2。直接电镀液的诱变指标的突变 。表列出了观察到的突变数（数量）和突变谱（％）以下的单周期突变。互补对频谱分解，核苷酸的变化，突变类型。

讨论

本文介绍了突变的协议，它允许生成大量的随机突变库，而不需要进行克隆或PCR。这种方法是基于对容易出错的复制质粒的编码序列的利益。从理论上讲，基因突变应在很大程度上制约100-300位于下游的RNA / DNA开关立即基点，领导人链中间的大小产生波尔^我 2,10 。我们发现，在本议定书中提出的条件下，波尔我的突变发生各地质粒，虽然在频率递减质粒ORI增加（图3）的距​​离。这一发现意味着过渡或“开关”我从波尔在ColE1质粒复制波尔三是比以前的报道更逐步至少在我们的实验条件，并同意与早先的研究表明POL我和波尔之间的功能冗余，三^11。

我们原来的协议描述（4）液体培养的突变。该协议的产量在1000 BP相邻的RNA / DNA开关（见表1）D <1000，即0.41突变/ KB。离开3天的液体培养摇床，没有增加任何新媒体Hypersaturation引发基因突变频率0.70突变/ KB，但在十分恶劣的质粒产量的结果（小于1％相比，每日1次;，数据未显示）（表1）。在这里，我们提出了一个简化的协议基础上，直接电镀固体琼脂质粒改造的目标，在37 ° C（图1）。此过程产生的最大频率/周期诱变突变（0.92突变/ D <1000 KB），极大地方便了迭代。固体介质改变培养条件，也影响的突变谱（见表2）。直接电镀诱变降低之间存在明显的互补碱基对在液体培养基中看到换人的不对称性（比较C→T与摹→A和A→G与T→彗星）。另一方面，直接电镀生产更多的INDELS（小于0.5％至4％）和A→G突变的数量下降了3倍，领先的G / C突变（74％）的比例过高。总体而言，我们认为，更简单和直接电镀这里介绍的协议效率的提高超过了稍微平衡液体诱变产生的突变谱的好处。

在目标质粒，我们的方法所产生的突变是不限制到所需的靶序列。然而，新颖的生化活动的演变应依赖于内的靶基因的突变，因为它代表了定性，而不是一个由量变。因此，结合梯度板的突变体的筛选质粒突变，我们利用我们的系统演化的新的生化特性（大型图书馆和选择可用性）的优势。优化现有的酶活性的或随机的基因的特定领域，如随机突变的其他应用程序需要克隆的随机突变。在这种情况下，质粒库，而不是一个PCR扩增产物提高克隆的效率，促进扩增和限制性。

总之，我们展示了一个简单的协议创造一个给定的靶基因，因其简单性和生成的库的多样性，突出的随机突变体库。我们表明这种方法可以高效演进的新的生化活动的功能选择。此外，我们在体内生成的库可以轻松克隆，允许特定地点的突变或优化现有的活动。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
carbenicillin	Cellgro	46100R6	0.1mg/ml final
tetracycline	Fisher Scientific	BP7640	0.05mg/ml final
chloramphenicol	Genlantis	M120100	0.03mg/ml final
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB Broth Miller	Difco Laboratories	244620
Soft Agar	Difco Laboratories	214580	Made in house
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A38401-1
Antifoam B emulsion	Sigma-Aldrich	A5757
Glycerol	Acros Organics	332030025
100x100x15mm sq dish	Fisher Scientific	0875711A
100mm rnd dish	Fisher Scientific	0875712A
Microscope slide 25x75x1mm	Gold Seal	3048
Electroporator 2510	Eppendorf
Electroporator 2510	Eppendorf
2mm gap tubes	Molecular BioProducts	5520
Zippy mini prep kit	Zymo Research Corp.	D4020