Method Article
Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.
A geração eficiente de diversidade genética representa uma ferramenta valiosa molecular que pode ser usado para rotular a síntese de DNA, para criar assinaturas única molecular, ou a evoluir proteínas no laboratório. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a geração de grandes (> 10 11) bibliotecas mutante para uma seqüência alvo. Este método é baseado na replicação de um plasmídeo codificando ColE1 a seqüência desejada por uma variante de baixa fidelidade da DNA polimerase I (LF-Pol I). O alvo do plasmídeo é transformada em uma cepa de E. mutator coli e semeadas em meios sólidos, rendendo entre 0,2 e 1 mutações / kb, dependendo da localização do gene alvo. Freqüências mais altas de mutação são alcançados por iteração deste processo de mutagênese. Em comparação com métodos alternativos de mutagênese, nosso protocolo destaca-se pela sua simplicidade, como nenhuma clonagem ou PCR estão envolvidos. Assim, nosso método é ideal para a rotulagem de mutação de plasmídeos ou modelos I, com Pol ou para explorar grandes seções de espaço de seqüência para a evolução das actividades não presentes no alvo original. O rígido controle espacial que PCR ou randomizado oligonucleotídeos baseados em oferecer métodos também podem ser alcançados por meio da clonagem posterior de seções específicas da biblioteca. Aqui nós fornecemos protocolos mostrando como criar uma biblioteca de mutantes aleatórios e como estabelecer droga baseada em seleções em E. coli para identificar mutantes exibindo novas atividades bioquímicas.
I. Geração de uma Biblioteca Aleatório Mutant
Pol I iniciação media de ColE1 replicação do plasmídeo (revisto em (1-3). Nosso método de mutagênese se baseia em colocar uma seqüência alvo de um plasmídeo adjacentes ColE1 a origem ou a replicação e propagação em células que expressam baixa fidelidade DNA polimerase I (LF-Pol I). LF-Pol I é uma DNA polimerase mutante eu codificação de três mutações que diminuem a fidelidade da replicação, ou seja, I709N (em motif A), A759R (em motivo B) e D424A (inativação de revisão) 4,5 . LF-Pol I é expressa em uma cepa de E. coli, JS200, que tem um alelo sensíveis à temperatura da Pol I (polA12) (6), para que LF-Pol I torna-se a atividade predominante a 37 ° C. A replicação do seqüência alvo em polA12 células sob condições restritivas resultados na geração de uma biblioteca aleatória mutante. Mutagênese é mais eficiente em culturas saturadas 4. Por razões que ainda não estão claros, mutagênese não é contínua, ou seja, a freqüência de mutação não aumenta linearmente com o número das gerações uma vez que a cultura atinge a saturação, mesmo se as células estão autorizados a expandir ainda mais na mídia fresco. Portanto, aumentando ainda mais a carga de mutação da biblioteca exige iterativo rodadas de mutagênese e recuperação plasmídeo. Aqui nós fornecemos protocolos para LF-Pol mutagênese I. Note-se que os protocolos aqui apresentados foram bastante simplificadas em relação a nossos 4 descrição original, a fim de facilitar a iteração do processo para atingir a carga mutação desejada (Fig. 1).
Materiais
1. Antes de Mutagênese: Preparação de electro-JS200 células competentes LF-Pol I
2. Mutagênese: Transformando o alvo plasmídeo
3. Mutagênese: recuperação Plasmid
4. Iteração
5. Leitura
II. Tela mutante e Análise de Traço Usando placas de crescimento Gradiente.
A fim de ilustrar como a grande diversidade genética presente em nossas bibliotecas podem ser acoplados a uma seleção funcional, aqui nós fornecer um protocolo de drogas baseado em seleções funcional in vivo em E. coli. Este método baseia-se crescimento ao longo de um gradiente de droga em ágar sólido. Isto permite a caracterização simultânea de múltiplas amostras (até 12) em uma faixa de concentrações, proporcionando uma maior gama dinâmica do que um tratamento medicamentoso único. Outra vantagem é que a leitura não-linear deste ensaio buffers diferenças moderadas da viabilidade, dentro de uma faixa de 2 vezes. Assim, este ensaio de citotoxicidade resistência fornece um meio robusto e rápido para selecionar mutantes e bibliotecas para determinar o perfil fenotípico de mutantes individual. Fig. 2 mostra um exemplo de cada um desses usos: Um painel de seleção de mutantes mostra individual de um oxidativo demetilase humana ABH2 biblioteca. Colônias que crescem acima do limiar WT são selecionados para maior proteção contra a citotoxicidade causada pela metilação de metano sulfonato de agente de metila (MMS) 7. Painel B mostra um exemplo de gradientes utilizados para a caracterização clone individual. O nível de resistência à terceira geração de cefalosporinas com antibióticos cefotaxima é mostrado em um gradiente de agar para WT β-lactamase e por duas espectro estendido-mutantes, R164H e R164S E104K G267R 4. Note que, dependendo da força dos efeitos observados, mais do que uma única placa pode ser necessário para a quantificação adequada: enquanto o gradiente 0.4mg/ml permite a comparação direta com o controle de clones, o nível de resistência do mutante mais poderosa só pode ser estabelecida usando uma maior concentraçãoconcentração de cefotaxima (4mg/ml).
Materiais
1. Construção do gradiente
2. Selo de transferência de bactérias
3. Analisando imagens e Crescimento
III. Resultados representativos:
Figura 1. Comparação entre protocolos de mutagênese líquido e direta em placas. O protocolo de mutagênese direta plating apresentado aqui (em baixo) é mais rápido e exige menos etapas do que o nosso protocolo de mutagênese originais líquido (superior). Quando GFP é utilizada como um repórter, as variações de fluorescência são indicativos da diversidade genética presente na biblioteca. Tipicamente, um ciclo de resultados mutagênese em colônias 12-18% com níveis significativamente diminuídos de fluorescência.
Figura 2. Resistência ensaios gradiente. Um painel de seleção para aumento da resistência ao Metil-metanossulfonato (MMS). Bibliotecas Plasmid do ser humano oxidativo demetilase ABH2 foram selecionados para aumento da resistência ao MMS. Duas bibliotecas que representem dois e quatro iterações do protocolo de mutagênese são mostrados em relação ao tipo parental selvagem (WT) eo vetor vazio (Δ). A linha branca representa o limiar acima do qual individuais colônias mutantes foram isolados para análise fenotípica mais. Painel B proteção Cefotaxima, indicativo de espectro estendido atividade β-lactamase. R164H e E104K R164H G267R, dois mutantes de beta-lactamase previamente identificados seguintes LF- Pol mutagênese eu acoplado ao aztreonam seleção 4, são mostrados em uma 0.4μg/mL e um gradiente cefotaxima 4μg/mL. Note que o tipo selvagem da enzima β-lactamase não confere proteção em relação a células que expressam um vetor vazio, Δ. Portanto, esses mutantes representam a evolução de uma nova atividade bioquímica 8,9.
Figura 3. Freqüência de mutação em função da distância da ori (d). A frequência de mutação após um único ciclo de mutagênese plaqueamento direto é mostrado para intervalos de 100 pb em relação ao interruptor de RNA / DNA da origem ColE1 de replicação. A área entre 1600 e 2400 não é representado por β-lactamase não representa um alvo neutro. Os pontos além β-lactamase intervalos representam 200 bp, dada a baixa freqüência de mutação nesta área. A tendência (equação binomial, com um R 2 = 0,41) é mostrado como uma linha.
Figura suplementares 1. Pol LF Pol I-I contendo plasmídeo. A seqüência (formato FASTA). Informações de seqüência para a determinação da enzima de restrição adequada (s) para usar quando linearização da Pol I plasmídeo ou para a iteração (geração de um passo aleatório mutação biblioteca 4) ou de leitura (passo 5). B características gerais e mapa de restrição do plasmídeo. A localização da origem de replicação pSC101, o marcador de resistência cloranfenicol (CAT) e LF-Pol gene que são apresentados. A localização de sítios de restrição único é indicado também.
Biblioteca | Plating direta | Líquido (1 dia) | Líquido (3 dias) | |
Mutações (#) | 95 | 40 | 142 | |
Clones seqüenciados | 288 | 96 | 190 | |
Cobertura total (bp) | 182000 | 102000 | 213000 | |
Mutação freq (x10 3 bp) | 0,52 | 0,39 | 0,67 | |
Freq d <1000 (x10 3 bp) | 0,92 | 0,41 | 0,70 |
Tabela 1. Freqüências de mutação Frequências (expresso em n º de mutações / bp) para d <1000, ou seja, dentro da bp 1000 ao lado do interruptor de RNA / DNA, por três protocolos mutagênese:. Plaqueamento direto, saturação de líquido (1 dia), e hypersaturation líquido ( 3 dias).
Plating direta | Líquido | ||
Mutações (#) | 95 | 182 | |
Espectro (%) | |||
A a G | A a G | 6,3 | 19,2 |
T para C | 4,2 | 3,8 | |
C para T | G a A | 27,4 | 13,7 |
C para T | 35,8 | 35,2 | |
A a T | A a T | 5,3 | 8,2 |
T a A | 5,3 | 7,1 | |
T para G | T para G | 1,1 | 1,1 |
A para C | 0,0 | 2,2 | |
G para T | G para T | 1,1 | 2,7 |
C para A | 2,1 | 2,7 | |
C para G | C para G | 2,1 | 1,1 |
G para C | 5,3 | 2,7 | |
Indels | Ins | 3,2 | 0,0 |
Del | 1,1 | 0,0 | |
A a N | 11,6 | 29,7 | |
G a N | 33,7 | 19,2 | |
T para N | 10,5 | 12,1 | |
C para N | 40,0 | 39,0 | |
Ts | 73,7 | 72,0 | |
TV | 22,1 | 28,0 | |
Indels | 4,2 | 0 |
Tabela 2. Métricas de mutação para plaqueamento direto e mutagênese líquido. O quadro apresenta o número de mutações observadas (em número) eo espectro de mutação (em%) após um único ciclo de mutagênese. O espectro é dividido em pares complementares, por mudanças de nucleotídeos, e pelo tipo de mutação.
Este artigo apresenta um protocolo de mutagênese que permite a geração de grandes bibliotecas de mutantes aleatórios sem a necessidade de clonagem ou PCR. Este método baseia-se propenso a erros de replicação de um plasmídeo uma seqüência de interesse. Em teoria, as mutações devem ser em grande parte restrita à 100-300 pb, localizado imediatamente a jusante do interruptor de RNA / DNA, o tamanho do líder vertente intermediários produzidos por Pol I 2,10. Descobrimos que nas condições apresentadas neste protocolo, mutações Pol I ocorrem em todo o plasmídeo, embora diminuindo em freqüência como a distância entre os aumentos plasmídeo ori (Figura 3). Este achado implica que a transição ou "switch" de Pol I Pol III ColE1 durante a replicação do plasmídeo é muito mais gradual do que o anteriormente reportado, pelo menos, nas nossas condições experimentais 2, e concorda com estudos anteriores sugerindo uma redundância funcional entre I e Pol Pol III 11.
Nosso protocolo original descrito mutagênese em culturas de líquido (4). Este protocolo produz mutações 0,41 / kb para d <1000, ou seja, dentro da bp 1000 ao lado do RNA / DNA switch (Tabela 1). Hypersaturation deixando a cultura líquido no shaker durante 3 dias sem a adição de qualquer mídia fresco aumenta a freqüência de mutação para 0,70 mutações / kb, mas resulta em muito pobre rendimento plasmídeo (menos de 1% em relação ao dia 1; dados não mostrados) ( Tabela 1). Aqui apresentamos um protocolo simplificado baseado diretamente plating a transformação do plasmídeo em ágar-alvo sólido a 37 ° C (Figura 1). Este procedimento produz a maior freqüência de mutação / ciclo de mutagênese (0,92 mutações / kb para d <1,000) e facilita muito a iteração. Mudanças nas condições de cultura para meios sólidos também afeta o espectro de mutação (Tabela 2). Mutagênese plaqueamento direto reduz a marcada assimetria entre substituições de bases complementares par visto na cultura líquida (compare C → T vs G → A e A → G vs T → C). Por outro lado, plaqueamento direto produzido indels mais (de menos de 0,5% a 4%) e diminuiu o número de mutações A → G em 3 vezes, levando a uma super-representação de G / C mutações (74%). No geral, acreditamos que a maior simplicidade e maior eficiência do protocolo de plaqueamento direto aqui apresentados superam os benefícios do espectro de mutação um pouco mais equilibrada produzidos por mutagênese líquido.
Dentro da meta plasmídeo, as mutações geradas pelo nosso método não se restringem à seqüência alvo desejado. No entanto, a evolução do romance de atividades bioquímicas deve ser dependente de mutações no gene alvo, uma vez que representa uma mais qualitativa do que uma mudança quantitativa. Assim, combinando a nossa mutagênese plasmídeo com a triagem de mutantes em placas gradiente capitaliza os pontos fortes do nosso sistema (grandes bibliotecas e disponibilidade de seleção) para a evolução de novas propriedades bioquímicas. Outras aplicações de mutagênese aleatória como a otimização existentes atividades enzimáticas ou randomizing áreas específicas de um gene exigem clonagem seguintes mutagênese aleatória. Neste caso, tendo a biblioteca em um plasmídeo, por oposição a um produto de amplificação PCR melhora a eficiência da clonagem, facilitando a amplificação e restrição.
Em suma, nós demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante de um gene-alvo, dado que se destaca por sua simplicidade e pela diversidade das bibliotecas geradas. Nós mostramos como esse método pode ser acoplado com seleções funcionais para a evolução eficiente de novas atividades bioquímicas. Além disso, nossa in vivo gerado bibliotecas podem ser facilmente clonados, permitindo site-specific mutagênese ou otimização das atividades existentes.
Este trabalho tem sido apoiado por K08 prêmio CA116429-04 para MC e por uma concessão do Cancer Conquer Now (preocupação) # fundação 8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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