Method Article
Здесь мы показываем, простой протокол для создания случайных мутантов библиотека для данной целевой последовательности. Мы покажем, как этот метод, который проводится в естественных условиях в кишечной палочки, могут быть связаны с функциональными выбор развиваться новые ферментативной деятельности.
Эффективной генерации генетического разнообразия представляет бесценный молекулярной инструмент, который может быть использован для обозначения синтеза ДНК, чтобы создать уникальные молекулярные подписи или развиваться белки в лаборатории. Здесь мы приводим протокол, который позволяет поколение больших (> 10 11) мутант библиотеки для данной целевой последовательности. Этот метод основан на репликации ColE1 плазмиды, кодирующей желаемой последовательности по низким верности вариант ДНК-полимеразы I (LF-Pol I). Целевой плазмиды превращается в мутатор штамма E. палочки и высевали на твердые среды, что дает от 0,2 до 1 мутации / кб, в зависимости от расположения гена-мишени. Более высокие частоты мутаций достигается путем перебора этот процесс мутагенеза. По сравнению с альтернативными методами мутагенеза, наш протокол выделяется своей простотой, так как не клонирование или ПЦР участвуют. Таким образом, наш метод идеально подходит для маркировки мутационные плазмид или других шаблонов я Pol или исследовать большие участки последовательности пространство для развития деятельности, не присутствующие в первоначальной цели. Жесткие пространственные управления, ПЦР или рандомизированных олигонуклеотидных методов, основанных на предложение также может быть достигнуто за счет последующего клонирования отдельных разделов библиотеки. Здесь мы предлагаем протоколов, показывающий, как создать случайный мутант библиотеки и как установить наркотиков основе выбора в E. палочки для выявления мутантов выставке новых биохимических деятельности.
И. Генерация случайных Мутант библиотека
Pol I посредником начала ColE1 плазмидной репликации (см. обзор (1-3). Наш метод мутагенеза основана на размещении последовательности-мишени в ColE1 плазмиды, прилегающих к происхождению или репликации и распространения его в клетках, экспрессирующих низкой точности ДНК-полимеразы I (LF-Pol I). LF-Pol I является мутантом ДНК-полимеразы I кодирования три мутации, которые снижают точность репликации, а именно I709N (в мотив), A759R (в мотиве Б) и D424A (инактивации корректура) 4,5 . LF-Pol I выражается в штамм E.coli, JS200, которая чувствительных к температуре аллель Pol I (polA12) (6) так, что LF-Pol I становится преобладающей активности при 37 ° C. Репликация последовательности-мишени в клетках под polA12 ограничительных условиях приводит генерации случайного мутант библиотеки. мутагенеза является более эффективным в насыщенном культур 4. По причинам, которые до сих пор неясно, мутагенез не является непрерывным, то есть частота мутаций не увеличивается линейно с увеличением числа поколений, когда-то культура достигает насыщения, даже если клетки допускаются к дальнейшему расширению в свежей информации. Таким образом, дальнейшее увеличение нагрузки мутации библиотеки требует итерационных раундов мутагенеза и плазмиды восстановления. Здесь мы предлагаем протоколов для LF-Pol мутагенеза я. Обратите внимание, что протоколы, представленные здесь была значительно упрощена по сравнению с нашей первоначальной 4 описание в целях содействия итерации процесса для достижения желаемого мутации нагрузки (рис. 1).
Материалы
1. Перед Мутагенез: Подготовка электрокомпетентных JS200 LF-Pol клетки я
2. Мутагенез: Преобразование целевой плазмиды
3. Мутагенез: плазмиды восстановления
4. Итерация
5. Считывание
II. Мутант экрана и черт анализ с помощью пластины градиент роста.
Для того, чтобы проиллюстрировать, как огромное генетическое разнообразие присутствует в нашей библиотеки могут быть связаны с функциональной отбора, здесь мы предоставляем протокол для наркотиков основе функционального выбора в естественных условиях в E. палочки. Этот метод основан на рост вдоль градиента наркотиков на твердом агаре. Это позволяет одновременную характеристику нескольких (до 12) образцов в диапазоне концентраций, что обеспечивает более широкий динамический диапазон, чем один лечения наркозависимости. Еще одним преимуществом является то, что нелинейные считывание этого анализа буферов умеренные различия в жизнеспособности, в течение 2-кратный диапазон. Таким образом, этот цитотоксичность сопротивления препарат обеспечивает надежный и быстрый способ, чтобы выбрать мутант библиотек и определить фенотипические профиля отдельных мутантов. Рис. 2 показан пример каждого из этих применений: панель показывает, подбор индивидуальных мутантов человека окислительного деметилазы ABH2 библиотеки. Колоний, растущих над WT порог выбраны для усиления защиты от цитотоксичности вызванных метилирующих агент метил метан сульфонат (MMS) 7. Группа B показывает пример того, градиенты для отдельных характеристик клона. Уровень сопротивления третьего поколения цефалоспоринов антибиотик цефотаксим показано на агар градиент для WT β-лактамаз и в течение двух расширенного спектра мутантов, R164H и E104K R164S G267R 4. Обратите внимание, что в зависимости от силы наблюдаемых эффектов, более чем одной пластиной может быть необходимо для адекватной количественной: в то время 0.4mg/ml градиента позволяет прямое сравнение с контрольной клонов, уровень сопротивления из самых мощных мутантов можно только устанавливается с помощью более высокой концентрацииконцентрация цефотаксима (4mg/mL).
Материалы
1. Строительство градиент
2. Stamp передачи бактерий
3. Работа с изображениями и анализа роста
III. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Сравнение между жидкостью и прямое покрытие протоколов мутагенеза. Прямого протокол мутагенеза покрытий, представленные здесь (внизу) быстрее и требует меньше шагов, чем наши оригинальные жидкости протокол мутагенеза (сверху). Когда GFP используется в качестве репортера, изменения флуоресценции указывают на генетическое разнообразие настоящее время в библиотеке. Как правило, один цикл мутагенеза приводит к 12-18% колоний заметно снижение уровня флуоресценции.
Рисунок 2. Анализы Градиент сопротивления. Группа выбора для повышения устойчивости к метил-метансульфонат (MMS). Плазмиды библиотеки человека окислительного деметилазы ABH2 были отобраны для повышенной устойчивостью к MMS. Два таких библиотек, представляющих два и четыре итерации мутагенеза протокола приведены в сравнении с родительскими дикого типа (WT) и пустой вектор (Δ). Белая линия обозначает порог, выше которого отдельные мутантов колонии были изолированы для дальнейшей фенотипического анализа. Группа B Цефотаксим защиты, что свидетельствует о расширенного спектра β-лактамазы деятельности. R164H и E104K R164H G267R, двух мутантов бета-лактамазы ранее выявленных следующие LF- Pol I мутагенеза связаны с азтреонам выбора 4, показаны на 0.4μg/mL и 4μg/mL градиент цефотаксим. Обратите внимание, что дикого типа β-лактамазы фермента дает никакой защиты по отношению к клеток, экспрессирующих пустой вектор, Δ. Таким образом, эти мутанты представляют собой эволюцию нового биохимической активностью 8,9.
Рисунок 3. Мутация частоты в зависимости от расстояния от ориентации (г). Частота мутаций после одного цикла прямого мутагенеза покрытия показана на 100 б.п. интервалы по отношению к РНК / ДНК выключатель ColE1 начала репликации. Области между 1600 и 2400 не представлен, поскольку β-лактамаз не является нейтральным цели. Пункты за пределами β-лактамазы представляют 200 б.п. интервалы с учетом общей низкой частоты мутаций в этой области. Тренд (биномиального уравнения с R 2 = 0,41) показан в виде линии.
Дополнительное рисунке 1. LF Pol I-содержащих Pol I плазмиды. Последовательность (FASTA формате). Информация о последовательности для определения соответствующего фермента ограничения (ы) для использования при линеаризации Pol I плазмиды либо для итерации (генерация случайного шага библиотеки мутации 4) или считывания (шаг 5). B Общие характеристики и ограничения карта плазмиды. Расположение pSC101 начала репликации, хлорамфеникол маркером устойчивости (КПП) и LF-Pol I гена представлены. Расположения одного сайты рестрикции указывается также.
Библиотека | Прямое покрытие | Жидкость (1 день) | Жидкость (3 дня) | |
Мутации (#) | 95 | 40 | 142 | |
Клоны последовательно | 288 | 96 | 190 | |
Всего покрытия (б.п.) | 182000 | 102000 | 213000 | |
Мутация частота (x10 3 б.п.) | 0,52 | 0,39 | 0,67 | |
Freq г <1000 (x10 3 б.п.) | 0,92 | 0,41 | 0,70 |
Таблица 1. Мутация частот Частоты (в виде # мутаций / б.п.) для й <1000, то есть в 1000 б.п., прилегающих к РНК / ДНК выключатель, в течение трех мутагенеза протоколов. Прямого покрытия, жидком насыщения (1 день), и жидкие hypersaturation ( 3 дня).
Прямое покрытие | Жидкость | ||
Мутации (#) | 95 | 182 | |
Спектр (%) | |||
К G | К G | 6,3 | 19,2 |
Т-С | 4,2 | 3,8 | |
С до Т | G к | 27,4 | 13,7 |
С до Т | 35,8 | 35,2 | |
Т | Т | 5,3 | 8,2 |
Т к | 5,3 | 7,1 | |
T в G | T в G | 1,1 | 1,1 |
А до С | 0,0 | 2,2 | |
G Т | G Т | 1,1 | 2,7 |
С до | 2,1 | 2,7 | |
С до G | С до G | 2,1 | 1,1 |
G на С | 5,3 | 2,7 | |
Indels | Ins | 3,2 | 0,0 |
Дель | 1,1 | 0,0 | |
К N | 11,6 | 29,7 | |
G на N | 33,7 | 19,2 | |
Т к N | 10,5 | 12,1 | |
С до N | 40,0 | 39,0 | |
Ц. | 73,7 | 72,0 | |
Телевизор | 22,1 | 28,0 | |
Indels | 4,2 | 0 |
Таблица 2. Метрики мутации для прямого покрытия и жидких мутагенеза. Таблице представлены число наблюдаемых мутаций (в номер) и мутации спектра (в%) после одного цикла мутагенеза. Спектр разбивается на комплементарных пар, по нуклеотидных изменений, а также тип мутации.
В этой статье представлены мутагенеза протокол, который позволяет генерировать большие случайные мутант библиотек без необходимости для клонирования или ПЦР. Этот метод основан на подверженных ошибкам репликации плазмиды, кодирующей последовательности интерес. В теории, мутации должны быть в значительной степени ограничена 100-300 б.п. расположен непосредственно за РНК / ДНК переключателя, размер лидер прядь промежуточных производства Pol I 2,10. Мы обнаружили, что в условиях, представленные в этом протоколе, Pol I мутации происходят по всей плазмиды, хотя уменьшение частоты по мере удаления от плазмиды увеличивает ориентацию (рис. 3). Это открытие означает, что переход или "переключение" с Pol I к Pol III во время репликации плазмиды ColE1 гораздо более постепенным, чем сообщалось ранее, по крайней мере в условиях нашего эксперимента 2, и согласуется с ранее исследованиям, функциональной избыточности между Pol I и Пол III 11.
Наш первоначальный протокол, описанный мутагенеза в жидких культурах (4). Этот протокол дает 0,41 мутации / KB для й <1000, то есть в 1000 б.п., прилегающих к РНК / ДНК переключатель (табл. 1). Hypersaturation, оставив жидкость культуры в шейкере в течение 3 дней, без добавления каких-либо свежих СМИ повышает частоту мутаций до 0,70 мутации / кб, но приводит к очень плохим плазмиды доходность (менее 1% по сравнению с 1-й день; данные не приведены) ( Таблица 1). Здесь мы приводим упрощенный протокол, основанный на покрытие непосредственно преобразования целевой плазмиды на твердом агаре при температуре 37 ° С (рис. 1). Эта процедура производит крупнейших частота мутаций / цикл мутагенеза (0,92 мутации / KB для й <1000) и значительно облегчает итерации. Изменение условий культивирования на твердых средах также влияет на мутации спектра (табл. 2). Прямая мутагенеза покрытие уменьшает резкая асимметрия между комплементарным основанием пару замен видел в культуральной жидкости (сравните C → T по сравнению с G → и → G по сравнению с T → C). С другой стороны, прямое покрытие произведено более indels (от менее чем 0,5% до 4%) и снижение числа мутаций → G на 3 раза, что привело к чрезмерной долей G / C мутации (74%). В целом, мы считаем, что большей простотой и повышение эффективности прямой протокол покрытия, представленные здесь перевешивает выгоды от несколько более сбалансированный спектр мутаций производства жидкого мутагенеза.
В рамках целевой плазмиды, мутации порожденных наш метод не ограничены желаемой последовательности-мишени. Однако, развитие новых биохимических деятельности должно зависеть от мутаций в ген-мишень, так как она представляет качественный, а не количественные изменения. Таким образом, объединяя наши плазмиды мутагенеза с скрининг мутантов на градиент пластин капитализирует на сильные стороны нашей системы (крупные библиотеки и наличие выбора) для эволюции новых биохимических свойств. Другие приложения случайного мутагенеза таких как оптимизация существующих ферментативной деятельности или случайной конкретных областях гена требуют клонирования следующие случайные мутагенеза. В этом случае, имея библиотеку в плазмиды, в отличие от продуктов ПЦР-амплификации повышает эффективность клонирования путем содействия усиления и ограничения.
В общем, мы демонстрируем простой протокол для создания случайных мутантов библиотека для данной целевой ген, который выделяется своей простотой и для разнообразия библиотеки генерируется. Мы покажем, как этот метод может использоваться в сочетании с функциональной выбор для эффективного развития новых биохимических деятельности. Кроме того, наши в естественных условиях генерируемых библиотеки могут быть легко клонирована, позволяя сайт-специфического мутагенеза или оптимизации существующих видов деятельности.
Эта работа была поддержана K08 награду CA116429-04 к МС и грантом властвуй Рак Теперь (КОНЦЕРН) учредительные # 8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены