Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Özet

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Özet

Genetik çeşitliliğin verimli üretimi, DNA sentezi etiketlemek için tek bir moleküler imza oluşturmak için, ya da laboratuvarda proteinleri gelişmeye kullanılabilir, paha biçilmez bir moleküler aracı temsil eder. Burada, belirli bir hedef dizisi için büyük (> 10 ¹¹⁾ mutant kütüphaneler üretimi sağlayan bir protokol mevcut. Bu yöntem ColE1 plazmid DNA polimeraz düşük bir sadakat varyant bir kodlama istenen sırada çoğaltma I (LF-Pol I) dayanmaktadır. Plazmid hedef E. Mutator gerginlik dönüştü. , hedef gen konuma bağlı olarak 0.2 ve 1 mutasyonları / kb arasında verimli coli ve kaplama, katı ortam . Yüksek mutasyon mutagenez bu süreci yineleme frekansları elde edilir. Hiçbir klonlama veya PCR katılan mutagenez alternatif yöntemler ile karşılaştırıldığında, bizim protokol, sadeliği göze çarpıyor. Böylece, yöntem, plazmid ya da diğer Pol I şablonları mutasyon etiketlenmesi ya da orijinal hedef mevcut faaliyetlerinin gelişimi için sırasını alan büyük bölümlerini keşfetmek için ideal. PCR veya randomize oligonükleotid tabanlı yöntemler teklif de kütüphanede belirli bölümlerini sonraki klonlama yoluyla elde edilebilir sıkı mekansal kontrolü. Burada, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için nasıl gösteren protokolleri sağlamak ve E. ilaç tabanlı seçimleri nasıl kurmak için yeni biyokimyasal faaliyetler sergileyen mutantlar tanımlamak için coli.

Protokol

Rastgele Mutant Kütüphanesi I. Üretimi

Pol I aracılık başlatılması ColE1 plazmid çoğaltma ^((1-3) gözden mutagenez Bizim yöntemi bir ColE1 plazmid bitişik bir hedef dizisi kökeni veya çoğaltma yerleştirerek ve düşük kalitede DNA polimeraz I ifade hücreleri propaganda dayalı (LF-Pol I). LF-Pol çoğaltma sadakat, yani I709N (A) motifi olarak, A759R (motif B) ve D424A (redaksiyon inaktive) ^4,5 azalma üç mutasyon kodlama mutant DNA polimeraz LF-Pol I baskın aktivitesi 37 ° C. Çoğaltma hale LF-Pol Pol (polA12) (6) bir ısıya duyarlı allel bir E. coli suşu, JS200, ifade edilir ve böylece kısıtlayıcı koşullar altında, rastgele bir mutant kütüphane nesil polA12 hücreleri hedef sırası Mutagenez doymuş ^kültürleri 4 daha verimli hala belirsiz nedenlerden dolayı, mutagenez sürekli değildir, yani mutasyon frekans sayısı ile doğrusal olarak artmaz kuşakların kültür hücreleri taze medyada daha da genişletmek için izin bile, doygunluk ulaştığında Bu nedenle, daha kütüphane mutasyon yükü artan mutagenez ve plazmid kurtarma mermi iteratif gerektirir. LF-Pol I mutagenez protokolleri sağlar. Burada sunulan protokoller oldukça özgün açıklamasını ⁴ göre istenilen mutasyon yükü (Şekil 1) ulaşmak için sürecin iterasyon kolaylaştırmak için basitleştirilmiş olduğunu unutmayın.

Malzemeler

• Hücreler: JS200 recA718 polA12 (ts) uvrA155 trpE65 lon-11 Sula
  • JS200 WT-Pol I: vahşi tip (WT) Pol I ifade JS200 hücreleri
  • JS200 LF-Pol I: JS200 düşük sadakat (LF) ifade Pol I
  • Çalışma Saati suşu: JS200 WT-Pol I veya belirli bir aktivitesi olmayan bir yük (tamamlama)
• Plazmid Hedef
  • Klonlanmış hedef gen ile çoğaltma bir ColE1 kaynağı içeren plazmid

1. Önce Mutagenez: elektro-yetkili JS200 LF-Pol I hücreleri Hazırlanması

1. Gecede plazmid taşıyan LF-Pol (0.03mg / ml kloramfenikol) için uygun antibiyotik seçimi içeren 30 ° C (izin koşulları) yetiştirilen bir LB plaka tek bir JS200 LF-Pol I koloni seçin ve bir test koloni kloramfenikol ile 8 ml LB içeren tüp. 30 kültür büyütün ° C ve geceleme 250rpm az sallayarak.
2. Sabah, kloramfenikol ile 400 ml LB içeren bir balona JS200 LF-Pol I 8 mL dökerek kültür genişletin. 30 kültür büyümesine izin ° C 0.4-0.7 A ₆₀₀ (genellikle 3 - 4 saat) ulaşıncaya kadar 250rpm az sallayarak iken.
3. Bir kez 0.4-0.7 A _600, kültür, 15 dakika boyunca ıslak buz üzerinde soğutun .
4. Santrifüj için uygun bir kap soğuk kültür aktarın. 4 santrifüj Pelet hücreleri ° C Süpernatantı dökün ve ardından konteyner ve serolojik bir pipet kullanarak yeniden askıya hücreler steril ve soğuk ıslak buz üzerinde% 10 gliserol 10 ml ekleyin.
5. 50 ml konik bir tüp içine yeniden askıya hücreleri aktarın. 4 az 15 dakika süreyle santrifüj sonra, 45 ml işareti% 10 gliserol ile konik tüp doldurun ve ° C ve 4000rpm.
6. Süpernatantı dökün% 10 gliserol bir kez daha 10 ml konik tüp ekleyin ve serolojik veya normal bir pipet kullanarak hücrelerin yeniden askıya. Yine, 15 dakika boyunca% 10 gliserol ve santrifüj ile 4, 45 ml işareti konik tüp doldurmak ° C ve 4000rpm. Iki kez daha tuzları tüm izlerini silmek için bu işlemi tekrarlayın.
7. Final spin sonra, (yani 2 mL% 10 gliserol ile 2 mL hücrelerin yeniden askıya) eşit bir parçası% 10 gliserol hücre pelet yeniden askıya.
8. 100 mcL ve çeşitli depolama tüpler içine asma hücrelerinin 500 mcL arasındaki kısım. Kuru buz üzerinde hücreler Hızlı dondurma ve daha sonra bunları saklamak -80 ° C
9. Hücrelerin yetkili elektro-dönüşümler için kullanmadan önce, hücreleri yavaş yavaş buz üzerinde çözünme.

2. Mutagenez: plazmid hedef Dönüşümü

1. Pipet elektro-yetkili JS200 LF-Pol I hücreleri ve hedef plazmid DNA 2mm boşluk elektroporasyon küvet içinde 30-250ng arasında 40 mcL.
   Not 1: Bir ColE1 plazmid içeren GFP bir denetim olarak hedef gen ile paralel olarak mutagenez yoluyla yapılabilir. Okuma adımın tamamlanmasından sonra, GFP LB agar plakaları kaplama ve mutagenez için görüntülendi. Karanlık veya loş görünen Kolonileri inaktive mutasyonlar içerir.
2. Darbe 1800 Elektroporatör karışımı. Her örnek için tek tip elektroporasyon koşulları sağlamak için zaman sabiti _(T C) kontrol edin; ideal _{T C} = 5-6 sn .
3. 37 ° C (res az 40 dakika için 1 ml LB suyu hücre / DNA karışımı Kurtar250 rpm'de sallayarak trictive koşulları).
4. 100mm LB Agar Petri kabı kurtarma kültür Plaka 50 mcL 37 önceden ısıtılmış ° C kloramfenikol ve plazmid hedef için bir antibiyotik seçilmesi uygun bir konsantrasyon hem de içeren.
   Not: # 2: plaka, bir "yakın çim" konsantrasyonda hücreleri yöneltin. "Yakın bir çim" konsantrasyon farklı ama sayılamayan kolonilerin sayısı (> 1000 koloni / 100mm çanak) olarak tanımlanır. Seyreltme hücreleri nasıl elektro yeterli bağlıdır, eğer varsa, kaplama. Hücrelerin çok elektro-yetkili değildir ve bir "yakın çim" kurtarma kültürü "düzgün", daha sonra 50 süpernatantı dökün, 4000rpm az 2 dakika boyunca kurtarma hücreleri yeniden askıya kültür santrifüj kaplama tarafından ulaşılabilir değilse LB suyu ve plaka kültür mcL.
5. 37 ° gecede Petri dishe (ler) ° C inkübe

3. Mutagenez: Plazmid kurtarma

1. Ertesi gün, hücreleri üzerine 2 ml LB suyu pipetleme Petri bulaşıkları yıkamak. LB suyu steril bir üçgen biçimli bir cam çubuk ile plaka onları "fırçalama" bakteri kolonileri LB agar Petri kutularına aktarın. Ilk 1 ml LB suyu, yıkama toplamak ve LB suyu ikinci mL işlemi tekrarlayın.
2. Plaka yıkama plazmid DNA izole edin. (Bu plazmid DNA kütüphane teşkil).
   # 3 Not: LB plakadan toplanan yıkama bütünüyle mini-hazırlık için çok yoğun olabilir. Bu durumda, hazırlık mini-mini-hazırlık seti (tipik olarak, bu yıkama OD = 1 ile seyreltilmesi ve seyreltilmiş kültür ~ 3 mL prepping dahil) maksimum miktarda tahsis veya bir maxi-hazırlık büyütmek

4. Tekrarlama

1. Plazmid LF-Pol linearizes bir restriksiyon enzimi ile izole plazmid DNA 1μg kısıtlayın, ancak (Ek Şekil 1) plazmid hedef kesmiyor.
2. DNA saflaştırma kiti kullanılarak restriksiyon sindirimi temizleyin.
   # 4 Not: Bu adım restriksiyon enzimi ve tampon tüm izlerini ortadan kaldırır. Bu adım, sonraki elektro-yetkili dönüşümleri için tuz konsantrasyonu düşük tutmak için gereklidir.
3. Re-taze JS200 LF-Pol hücrelerin içine sınırlı bir hedef plazmid kütüphane geri dönüşümü 30-250ng mutagenez sonraki tur aracılığıyla kütüphane koymak.
   # 5 Not: restriksiyon enzimi kullanarak ben plazmid Pol doğrusallaştırma sadece plazmid hedef değiştirdi alır sağlar.
4. Bölüm 2 ve 3'ü tekrarlayın.

5. Çalışma Saati

1. Plazmid hedef ve ben plazmid Pol linearizes bir kısıtlama enzim (ler) ile izole plazmid DNA kısıtlayın. Plazmid miktar ve kalitesini sağlamak için% 1 agaroz jel sindirimi çalıştırın. ~ Izole plazmid DNA 400ng kısıtlanması genellikle analiz için yeterli.
2. Plazmid LF-Pol linearizes bir restriksiyon enzimi ile izole plazmid DNA 1μg kısıtlayın, ancak hedef plazmid kesmiyor.
3. DNA saflaştırma kiti kullanılarak restriksiyon sindirimi temizleyin.
4. Okuma mutasyonları karakterize bir gerginlik içine sınırlı bir hedef plazmid kütüphane dönüştürün.

II. Mutant Ekran ve Sürekli Analizi Gradient Büyüme Tabaklar kullanma.

Kütüphanelerde mevcut geniş genetik çeşitliliğin işlevsel bir seçim birleştiğinde nasıl göstermek için, burada E. in vivo ilaç tabanlı fonksiyonel seçimler için bir protokol coli. Bu yöntem katı agar bir ilaç degrade boyunca büyüme üzerine kuruludur. Bu, tek bir ilaç tedavisi daha geniş bir dinamik aralık (12 kadar) konsantrasyonlarının bir dizi içinde birden fazla numune eş zamanlı karakterizasyonu sağlar. Diğer bir avantajı, bu testin non-lineer okuma, 2 kat aralığında canlılığı orta farklılıklar, tamponlar olmasıdır. Böylece, bu sitotoksisite direnç tahlil mutant kütüphaneler seçmek ve bireysel mutantlar fenotipik profilini belirlemek için, sağlam ve hızlı bir araç sağlar. Şekil 2 Bu kullanımların her biri bir örnek gösterir: bir insan oksidatif demethylase ABH2 kütüphane tek tek mutantlar gösterir seçim paneli. WT eşiğinin üzerinde büyüyen Kolonileri metilasyon ajan metil metan sülfonat (MMS), ⁷ neden sitotoksisite artan koruma için seçilir. B Paneli degradelerin bireysel klon karakterizasyonu için kullanılan bir örnek gösterir. Üçüncü kuşak sefalosporin antibiyotik sefotaksim direnç seviyesi WT β-laktamaz için bir agar degrade ve iki genişlemiş spektrumlu mutantlar, R164H ve E104K R164S G267R ⁴ gösterilmiştir. Tek bir tabak daha fazla gözlenen etkileri gücüne bağlı olarak, yeterli kantitatif için gerekli olabilir Not: 0.4mg/ml degrade kontrol klonlar doğrudan karşılaştırma, en güçlü bir mutant direnç seviyesi sağlar sadece yüksek konsantrasyonu kullanılarak kurulacaksefotaksim (4mg/mL) tration.

Malzemeler

• Ekipman
  • 100x100x15mm kare Petri kapları (Fisher Bilim # 0875711A)
  • 100mm yuvarlak Petri kabı
  • 25x75x1mm cam mikroskop lamı (Fischer Bilim # 1.255.015)
  • 50 ml tüp bitirdi
• Medya
  • LB agar: 56 erimiş ve bir su banyosunda dengelenmiş ° C
    # 6 Not: medya sıcaklık istikrar ve böylece ilaç veya bileşik incelenmektedir faaliyet etkileyebilir.
  • Yumuşak Agar: 42 erimiş ve bir su banyosu içinde dengelenmiş ° C

1. Degrade İnşaatı

1. Mark on kare Petri kabı alt kenarı boyunca eşit aralıklı şerit,.
2. Rampa üzerinde işaretlenmiş alt kenarından 7mm yüksek olduğunu, böyle bir çanak koyun;
   kalın bir ot veya diğer düz bir nesne çanak yükseltmesine destek olarak kullanılabilir. 25 ml dökün ılık (~ 56 ° C) LB agar eğimli çanak içine seçerek ajan uygun bir konsantrasyon ile iyice karıştırılır. Bu degrade alt tabakasıdır. LB agar eşit kat Petri çanak çanak yükseltilmiş, belirgin sonuna ~ 1mm LB agar içerir ve alçaltılmış bir parçası içerir ~ LB agar 8mm emin olun. Daha sonra agar 10-15 dakika ayarlamanıza olanak verir.
   # 7 Not: hidrofobik seçerek ajanlar için süspansiyon ve ilaç tekdüze dağılım kolaylaştırmak için,% 0.1 sürfaktan (köpük B emülsiyon) LB agar ilave olabilir. Seçim ajan eklenmesi önce sallayarak kuvvetli sıcak steril LB agar sürfaktan ekleyin. Sürfaktan küçük damlacıkları ince bir pus gibi, büyük damlacıklar ortam çok sıcak ve tekdüze dağılım test ilacın inhibe edebilir askıya gerekir.
3. Ilk 25 ml LB agar sertleştikten sonra, çanak düz bir yüzeye taşınır. Daha sonra, 25 ml seçerek ajan olmadan LB agar ilk LB agar yüzeyini kaplamak için dökülür. Bu degrade üst tabakası. LB agar alt tabakanın tüm yüzeyini kaplayan emin olun. Havalandırma kapağı dengesiz örtün ve 10-15 dakika agar ayarlamanıza olanak verir.
   # 8 Not: aerosol tehlikeler ve potansiyel buharlaşma testi bileşik farkında olun; kimyasal güvenlik gereksinimleri tarafından reçete, bir kimyasal veya biyolojik güvenlik kabini gradyanlar dökün.
   # 9 Not: Gradient yemekler, ilaç ya da test bileşik konsantrasyonu degrade korumak için 4 saat içinde kullanılmalıdır.

2. Bakteri transferi Damga

1. Yumuşak agar 42 ° C'ye kadar dengelenmiş olmalıdır 100mm yuvarlak Petri kabı kapağı veya dibine 2 ml sıvı yumuşak agar aktarın. Pipet 40 mcL bakteriyel kültür ve yumuşak agar içine plaka sallanan karıştırın.
   # 10 Not: Bir bakteri kültürü büyüme aşamasında bir ilaç ya da test bileşik yanıtı etkileyebilir. Kültürler günlük sabit faz faz veya gece boyunca kültürler, tekdüze sonuçlar için tutarlılık ile kullanılmalıdır. Hücre yoğunluğu da çarpık göreceli sonuçlar, böylece tüm kültürlerde A ₆₀₀ yoğunluk değerleri eşleştirilir seyreltilmiş olmalıdır. Gecelik kültürler A ₆₀₀ yoğunluğu daha az 1.0 seyreltilmelidir
2. Yumuşak agar karışımında cam mikroskop lamı, uzun kenarı Coat. Daha sonra, degrade çanak kaplı, alt işareti ile slayt kenarı (düşük ve yüksek konsantrasyon) hizalayarak slayt agar yüzeyine dokunmayın. Yumuşak bir dokunuş, degrade yüzeyine yumuşak agar bir şerit aktarmak için yeterli. Slayt sonra temizlik ve yeniden kullanmak üzere bir kenara koyun.
3. Bakteri örnekleri geri kalanı için, bu işlemi tekrarlayın. Birden fazla gradyanlar yürütülüyor Referans örnekleri her degrade yemeği dahil edilmelidir.
4. 37 aşağı gecede degrade çanak üst inkübe ° C. Inkübasyon süreleri ve sıcaklıkları 37 farklı okuma bakteri suşlarının ama bir gecede farklı olabilir ° C genellikle görünür büyüme için yeterli olacaktır.

3. Görüntüleme ve Büyüme Analizi

1. Görüntüleme: gece büyümenin ardından, gradyanlar doğrudan görüntülü veya sabit ve kontrastı arttırmak için 0.2 mg / ml Akridin Orange% 95 EtOH bir çözüm lekeli olabilir. Plaka boyama çözüm, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, sonra% 95 EtOH ile yıkanır ve sonra UV ışık kutusu üzerinden görüntülü.
   # 11 Not: plaka koloniler hizada değil, plaka üzerinde, boyama çözümü ve yıkama köşesinden rock ve çözümleri kaldırmak için özen gösterin.
2. Bireysel mutant plazmid fenotip analizi için, konsantrasyon gradiyenti karşı büyüme mesafe her degrade bir standarda normalize. Bu göreli değerleri sonra gradyanlar arasında mukayese edilebilir.
   # 12 Not: keskin bir kenarı ya da daha yaygın bir kenar (örnek Panelleri Şekil 2 A ve B), sitotoksik etkisi niteliğine göre. Durumda diffüz kenarları, kenar o ölçmek için tavsiye edilirbireysel koloniler artan değişkenlik gösterme eğilimindedir f sürekli büyüme.
3. Kütüphane seçimi için, ebeveyn vahşi tip kontrol daha yüksek konsantrasyonlarda yetişen bireysel kolonileri izole edilmiş ve yüksek koruma katkıda mutasyonları tespit sıralı.

III. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. Sıvı ve doğrudan kaplama mutagenez protokolleri arasında karşılaştırma (alt), burada sunulan doğrudan kaplama mutagenez protokolü daha hızlıdır ve daha az sayıda adımlar orijinal sıvı mutagenez protokolü (üst) gerektirir. GFP bir muhabir olarak kullanıldığında, floresan farklılıklar kütüphanede genetik çeşitliliğin mevcut göstergesidir. Tipik olarak, floresan kayda değer azalma düzeyleri ile% 12-18 koloniler mutagenez sonuçları bir döngü.

Şekil 2. Gradient direnci testleri. Paneli Metil-Methanesulfonate artan direnci (MMS) için bir seçme. Insan oksidatif demethylase ABH2 Plazmid kütüphaneleri MMS artan direnç seçilmiştir. Mutagenez protokolü iki ve dört iterasyon temsil eden iki tür kütüphaneler ebeveyn vahşi tip (WT) ve boş bir vektör (Δ) ile karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir. Beyaz çizgi, daha fazla fenotipik analiz için bireysel mutant koloniler izole edildiği yukarıdaki eşiği ifade eder. Genişlemiş spektrumlu β-laktamaz aktivitesinin göstergesi B Paneli sefotaksimin koruma, R164H ve E104K R164H G267R, önceden belirlenen beta-laktamaz iki mutant LF - aztreonam seçimi ⁴ birleştiğinde Pol I mutagenez, bir 0.4μg/mL ve 4μg/mL sefotaksim degrade gösterilmiştir. Yabani tip β-laktamaz enzim boş bir vektör, Δ ifade hücrelere göre herhangi bir koruma sağladığını unutmayın. Bu nedenle, bu mutantlar yeni bir biyokimyasal faaliyet ^8,9 evrimi temsil ediyor.

Şekil 3. Ori uzaklık (d) bir fonksiyonu olarak mutasyon sıklığı direkt kaplama mutagenez tek bir döngü aşağıdaki mutasyon sıklığı çoğaltma ColE1 kökenli RNA / DNA anahtarı göre 100 bp aralıklarla gösterilir. Β-laktamaz nötr bir hedef temsil etmez, çünkü 1600 ve 2400 yılları arasında alanda temsil edilmemektedir. Β-laktamaz ötesinde noktaları bu alanda mutasyon düşük frekanslı verilen 200 bp aralıklarla temsil eder. (R ² = 0.41 olan binom denklemini) eğilim bir çizgi olarak gösterilmiştir.

Ek Şekil 1. LF Pol I-içeren Pol I plazmid. Seri çekim (Fasta biçimi) . Yineleme için plazmid Pol ya doğrusallaştırma (rastgele bir mutasyon kütüphane 4. adımı nesil) veya okuma (adım 5) kullanmak için uygun bir restriksiyon enzimi (ler) belirlemek için sıra B genel özellikleri ve plazmid kısıtlanması harita . pSC101 çoğaltma köken, kloramfenikol direnci işaretleyici (CAT) ve LF-Pol I gen yeri sunulmaktadır. Tek kısıtlama sitelerin yeri de belirtilir.

Kütüphane		Doğrudan Kaplama	Sıvı (1 gün)	Sıvı (3 gün)
Mutasyonlar (#)		95	40	142
Klonlar sıralı	288	96	190
Toplam Kapsama (bp)	182.000	102.000	213.000
Mutasyon frekans (x10 3 bp)	0,52	0,39	0,67
Freq d <1000 (x10 3 bp)	0,92	0,41	0,70

Tablo 1. Mutasyon frekansları d <1000, yani RNA / DNA anahtarı bitişik üç mutagenez protokoller için 1000 bp, içinde Frekansları (# mutasyonlar / bp olarak ifade): direkt kaplama, sıvı doygunluğu (1 gün), ve sıvı hypersaturation ( 3 gün).

		Doğrudan Kaplama	Sıvı
Mutasyonlar (#)		95	182
Spektrum (%)
G	G	6,3	19,2
	C, T	4,2	3,8
C T	G A	27,4	13,7
	C T	35,8	35,2
T	T	5,3	8,2
	Bir T	5,3	7,1
G - T	G - T	1,1	1,1
	C	0,0	2,2
G T kadar	G T kadar	1,1	2,7
	C	2,1	2,7
C G	C G	2,1	1,1
	C G	5,3	2,7
Indels	Ins	3,2	0,0
	Del	1,1	0,0
	N	11,6	29,7
	N G	33,7	19,2
	N T	10,5	12,1
	C N	40,0	39,0
	Ts	73,7	72,0
	TV	22,1	28,0
	Indels	4,2	0

Tablo 2. Doğrudan kaplama ve sıvı mutagenez için mutasyon Metrik. Tabloda gözlenen mutasyonların sayısı (sayı) ve mutagenez tek bir döngüsü aşağıdaki mutasyon spektrumu (%) sunar. Spektrum nükleotid değişiklikleri tamamlayıcı çifti tarafından bozuldu ve mutasyon tipine göre.

Tartışmalar

Bu makale, klonlama veya PCR için gerek kalmadan büyük rastgele mutant kütüphanelerinin oluşturulmasına imkan mutagenez protokol sunar. Bu yöntem bir plazmid kodlama ilgi bir dizi hata eğilimli çoğaltma dayanmaktadır. Teoride, mutasyonların büyük ölçüde RNA / DNA anahtarı hemen akış aşağısında bulunan 100-300 bp sınırlı olmalıdır lideri iplikçik ara boyutunu ben ^2,10 Pol tarafından üretilen. Plazmid ori artar (Şekil 3) uzaklık olarak sıklığı azalan ancak bu protokol sunulan koşullar altında, Pol I mutasyonların, tüm plazmid üzerinde meydana geldiği bulundu. Bu bulgu, geçiş veya ColE1 plazmid çoğaltma sırasında Pol III Pol I "anahtarı" en azından bizim deneysel ^koşulları 2 altında, daha önce rapor edilenden çok daha tedrici olduğunu ima eder ve Pol I ve Pol arasında işlevsel bir fazlalık gösteren daha önceki çalışmaların kabul eder III ^11.

Bizim orijinal protokol sıvı kültürleri (4) mutagenez nitelendirdi. Bu protokol, RNA / DNA anahtarı (Tablo 1) bitişik 1000 bp içinde 0.41 mutasyonlar / d <1000, yani kb verir. Herhangi bir yeni medya katkısı olmadan 3 gün boyunca çalkalayıcı sıvı kültürü bırakarak Hypersaturation 0.70 mutasyonlar kb / ama sonuç çok kötü plazmid verim (% 1'den daha az 1 gün ile karşılaştırıldığında; veriler gösterilmemiştir) mutasyon sıklığı yükseltir ( Tablo 1). Burada doğrudan 37 katı agar plazmid hedef dönüşümü kaplama dayalı basitleştirilmiş bir protokol mevcut ° C (Şekil 1). Bu prosedür mutagenez mutasyon / döngüsü (0.92 mutasyonlar / d <1000 kb) en büyük frekans üretir ve büyük ölçüde iterasyon kolaylaştırır. Katı ortam kültürü değişen koşullara da mutasyon spektrumu (Tablo 2) etkiler. Doğrudan kaplama mutagenez işaretli (karşılaştırmak C → T vs G → A ve A → G vs T → C) sıvı kültüründe görülen tamamlayıcı baz çifti oyuncu değişikliği arasındaki asimetri azaltır. Öte yandan, doğrudan kaplama daha fazla indels (% 0,5 'den az% 4 dan itibaren) üretilen ve G / C mutasyonlar (% 74) bir overrepresentation yol, 3-kat A → G mutasyonların sayısı azalmış. Genel olarak, burada sunulan doğrudan kaplama protokol daha fazla basitlik ve verimlilik artışı sıvı mutagenez tarafından üretilen biraz daha dengeli bir mutasyon yelpazenin faydaları daha ağır basar inanıyoruz.

Plazmid hedef içinde, bizim yöntemi ile üretilen mutasyonlar istenen hedef dizisine sınırlı değildir. Ancak, evrim roman biyokimyasal faaliyetlerin nicel bir değişiklik daha ziyade niteliksel bir temsil olarak, hedef gen içinde mutasyonlar bağımlı olmalıdır. Böylece, degrade plakalar üzerinde mutantlar tarama ile plazmid mutagenez birleştirerek, yeni bir biyokimyasal özellikleri evrim için sistem (büyük kütüphaneler ve seçim durumu) güçlü istifade. Diğer uygulamalar mevcut enzimatik faaliyetleri optimize etmek veya bir genin belirli alanlarda rastgele rastgele mutagenez rastgele mutagenez aşağıdaki klonlama gerektirir. Bu durumda, bir PCR ürünü aksine bir plazmid kütüphane, amplifikasyon ve kısıtlama kolaylaştırarak klonlama verimliliğini artırır.

Özetle, biz, sadeliği ve oluşturulan kütüphaneler çeşitliliğine sıyrılıyor belirli bir hedef gen için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Biz bu yöntem, yeni bir biyokimyasal faaliyetlerin verimli evrim için fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, bizim in vivo oluşturulan kütüphaneler, mevcut faaliyetleri siteye özgü mutagenez veya optimizasyon sağlayan, kolay klonlanmış olabilir .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
carbenicillin	Cellgro	46100R6	0.1mg/ml final
tetracycline	Fisher Scientific	BP7640	0.05mg/ml final
chloramphenicol	Genlantis	M120100	0.03mg/ml final
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB Broth Miller	Difco Laboratories	244620
Soft Agar	Difco Laboratories	214580	Made in house
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A38401-1
Antifoam B emulsion	Sigma-Aldrich	A5757
Glycerol	Acros Organics	332030025
100x100x15mm sq dish	Fisher Scientific	0875711A
100mm rnd dish	Fisher Scientific	0875712A
Microscope slide 25x75x1mm	Gold Seal	3048
Electroporator 2510	Eppendorf
Electroporator 2510	Eppendorf
2mm gap tubes	Molecular BioProducts	5520
Zippy mini prep kit	Zymo Research Corp.	D4020