Method Article
ここでは、特定の標的配列のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、大腸菌の中で、生体内で行われるこの方法は、、新たな酵素活性を進化させ、機能の選択と結合することができる方法を示します。
遺伝的多様性の効率的な世代は、ユニークな分子の署名を作成するために、または実験室での蛋白質を進化させ、DNA合成のラベル付けに使用することができる貴重な分子ツールを表します。ここでは、特定の標的配列のための大規模な(> 10 11)変異体ライブラリーの生成を可能にするプロトコルを示す。このメソッドは、DNAポリメラーゼI(LF -ポルI)の低忠実度の変異によってColE1プラスミドエンコーディングの複製所望の配列に基づいています。目的プラスミドは、E.のミューテーター株に変換されます大腸菌と固形培地上にプレーティングは、標的遺伝子の位置に応じて、0.2と1の変異/ KBの間得た。より高い突然変異の頻度は、突然変異誘発のこのプロセスを繰り返すことにより達成されています。変異導入の代替方法と比較して、我々のプロトコルは、クローニングまたはPCRが含まれないとして、そのシンプルさで際立っている。このように、私たちの方法は、変異プラスミドまたは他のポル私のテンプレートのラベルまたは元のターゲットには存在しない活動の発展のためにシーケンス空間の大部分を探索するために理想的です。 PCRやランダムオリゴヌクレオチドベースの手法の提案も、ライブラリの特定のセクションのその後のクローニングによって達成できることをタイトな空間的な制御。ここでは、ランダム変異体ライブラリーを作成する方法とE.の薬剤ベースの選択を確立する方法を示すプロトコルを提供する新しい生化学的な活動を示す変異体を同定するために大腸菌 。
ランダム変異体ライブラリーのI.の生成
ColE1プラスミド複製のPOL私の仲介の開始(でレビュー(1-3)。変異導入の我々の方法は、起点または複製にColE1プラスミド隣接の標的配列を配置することに基づいており、低忠実度DNAポリメラーゼを発現する細胞で、それが伝播されている私(LF -ポルI)。LF -ポル私は、複製の忠実度、すなわちI709N(モチーフで)、A759R(モチーフBの)とD424A(校正を不活性化)4,5を減少させるthree変異をコードする変異DNAポリメラーゼです。 LF -ポル私は37優勢活動°のC.の複製になります。LF -ポル私はポルI(polA12)(6)の温度感受性対立遺伝子を持つ大腸菌株、JS200、で表現されるようにランダム変異体ライブラリーの世代で制約条件の結果は下polA12細胞中の標的配列。突然変異飽和培養液4のより効率的であるが。依然として不明である理由から、変異導入が連続していない、突然変異の頻度は数に比例して増加しない、すなわち細胞を新鮮な培地でさらに拡大することを許可されている場合でも、文化が、飽和状態に達するといったん。Therefore世代が、さらにライブラリの突然変異荷重を増加させると変異導入し、プラスミド回収のラウンドの反復が必要です。ここでは、LF -ポルI変異誘発のためのプロトコルを提供する。プロトコルが大幅に所望の変異の負荷(図1)を達成するためのプロセスの繰り返しを容易にするために、当社独自の記述の4に対して簡素化されているここで紹介することに注意してください。
材料
1。エレクトロコンピテントJS200 LF -ポルI細胞の調製:変異導入前
2。突然変異導入:目的プラスミドの変換
3。変異誘発:プラスミド回収
4。繰り返し
5。読み出し
II。グラデーションの成長板を用いた変異画面および特性解析。
私たちのライブラリに存在する膨大な遺伝的多様性が、機能を選択的に結合する方法を説明するために、ここではE.のin vivoでの薬剤ベースの機能を選択するためのプロトコルを提供する大腸菌 。このメソッドは、固形寒天上で薬剤の勾配に沿って成長に基づいています。これは、単一の薬物治療よりも広いダイナミックレンジを提供し、濃度の範囲で複数(最大12)の試料の同時特性評価が可能になります。もう一つの利点は、このアッセイの非線形読み出しが2倍の範囲内で、実行可能性の中等度の違いをバッファリングすることです。従って、この細胞毒性 - 抵抗性検定は、変異体ライブラリーを選択すると個々の変異体の表現型のプロファイルを決定するために、堅牢かつ迅速な手段を提供します。図。 2は、これらの用途のそれぞれの例を示しています。パネル、人間の酸化の脱メチル化酵素ABH2ライブラリから個々の変異体の示す選択。 WTしきい値を超えて成長しているコロニーは、メチル化剤メチルメタンスルホネート(MMS)7によって引き起こされる細胞毒性からの保護を強化するために選択されています。パネルBは、個々のクローンの特性評価に使用するグラデーションの例を示しています。第三世代セファロスポリン系抗生物質セフォタキシムに耐性のレベルは、WTβ-ラクタマーゼに対する2つの拡張型変異体、R164HとE104K R164S G267R 4の寒天の勾配で示されています。単板よりも、観察された効果の強さに応じてする十分な定量のために必要となる場合があることに注意してください:0.4mg/ml勾配は対照クローンへの直接比較、最も強力な変異体の抵抗のレベルを可能にしながらできるだけより高い濃度を使用して確立するセフォタキシム(4mg/mL)のtration。
材料
1。勾配の建設
2。細菌の転送をスタンプ
3。イメージングと成長の分析
III。代表的な結果:
図1。 (下)ここで紹介する液体との直接メッキ突然変異誘発プロトコル間の比較。ダイレクトメッキの変異誘発のプロトコルが高速ですし、私たちのオリジナルの液体の突然変異誘発のプロトコル(上)よりも少ない手順が必要になります。 GFPをレポーターとして使用される場合、蛍光の変化は、ライブラリ内の遺伝的多様性の存在を示すものである。一般的に、蛍光のかなりの減少レベル12から18パーセントのコロニーにおける変異誘発の結果の1サイクル。
図2。勾配抵抗アッセイ。人間の酸化的脱メチル化酵素ABH2のパネルメチルメタンスルホン(MMS)への抵抗の増加のための選択。プラスミドライブラリーは、MMSへの抵抗の増加のために選択した。変異誘発のプロトコルの2つのと4回の繰り返しを表す2つのようなライブラリは、親の野生型(WT)と空のベクター(Δ)と比較して示されています。白い線は、個々の突然変異体コロニーがさらに表現型解析のために隔離されたしきい値を示します。 拡張型β-ラクタマーゼ活性を示すパネルBセフォタキシムの保護は、。R164HとE104K R164H G267R、以前に同定されたβ-ラクタマーゼの2つの変異体は、次のLF -アズトレオナムの選択4に結合さPOL私の突然変異誘発は、0.4μg/mLと4μg/mLセフォタキシムの勾配で示されています。野生型β-ラクタマーゼ酵素は空のベクトル、Δを発現する細胞からの相対には保護を付与するものではありませんので注意してください。したがって、これらの変異体は、新たな生化学的活性8,9の進化を表しています。
図3。オリ(D)からの距離の関数としての変異頻度は。ダイレクトメッキの突然変異誘発の単一サイクルは、次の変異頻度は、複製のColE1由来のRNA / DNAスイッチへの相対は100bp間隔で表示されます。 β-ラクタマーゼは、中立的な目標を表していないので、1600と2400の間の領域も表示されません。 β-ラクタマーゼ超えた点は、この領域の変異の全体的な低周波を与えられた200塩基対の間隔を表します。 (R 2 = 0.41の二項式、)傾向は線として表示されます。
補足図1。私はプラスミドLFポル私含有ポル。シーケンス (FASTA形式)。繰り返し(ランダム変異ライブラリの手順4の生成)または読み出し(ステップ5)のいずれか私はプラスミドポルを線形化するときに使用する適切な制限酵素(s)を決定するための配列情報。B一般的な機能とプラスミドの制限酵素地図。複製のpSC101起源、クロラムフェニコール耐性マーカー(CAT)とLF -ポルI遺伝子の位置が表示されます。単一の制限部位の位置も同様に示されています。
図書館 | ダイレクトめっき | 液体 (1日) | 液体 (3日) | |
突然変異(#) | 95 | 40 | 142 | |
クローンは、配列を決定 | 288 | 96 | 190 | |
合計カバレッジ(BP) | 182000 | 102000 | 213000 | |
突然変異周波数(× 10 3塩基) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
周波数D <1000(X10 3塩基) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
表1。突然変異の頻度 D <1000用周波数(#突然変異/ BPのように表される)、という3つの突然変異誘発のプロトコルのためのRNA / DNAスイッチに隣接する1000塩基、内:ダイレクトメッキ、液体飽和度(1日)、および液体hypersaturation( 3日間)。
ダイレクトめっき | 液体 | ||
突然変異(#) | 95 | 182 | |
スペクトラム(%) | |||
Gへ | Gへ | 6.3 | 19.2 |
CのT | 4.2 | 3.8 | |
TへのC | Gへ | 27.4 | 13.7 |
TへのC | 35.8 | 35.2 | |
Tへ | Tへ | 5.3 | 8.2 |
にT | 5.3 | 7.1 | |
GのT | GのT | 1.1 | 1.1 |
Cへ | 0.0 | 2.2 | |
G Tへ | G Tへ | 1.1 | 2.7 |
にC | 2.1 | 2.7 | |
GのC | GのC | 2.1 | 1.1 |
CにG | 5.3 | 2.7 | |
indelsの | イン | 3.2 | 0.0 |
デル | 1.1 | 0.0 | |
Nへ | 11.6 | 29.7 | |
NにG | 33.7 | 19.2 | |
NのT | 10.5 | 12.1 | |
NへのC | 40.0 | 39.0 | |
TS | 73.7 | 72.0 | |
TV | 22.1 | 28.0 | |
indelsの | 4.2 | 0 |
表2。ダイレクトプレーティングと液体変異誘発のための突然変異のメトリック。表では、変異誘発の単一サイクル後に観察突然変異の数(数の)と突然変異のスペクトルを(%で)提示。スペクトルは、相補的なペアで、ヌクレオチドの変化によって、及び変異の種類により分類されます。
この記事では、クローニングまたはPCRを必要とせずに大規模なランダム変異体ライブラリーの生成を可能にする突然変異誘発プロトコールを示します。このメソッドは、コードするプラスミド目的の配列のエラーが発生しやすいのレプリケーションに基づいています。理論的には、突然変異の大部分はRNA / DNAスイッチのすぐ下流に位置する100から300 bpに制限しなければならない、リーダー鎖の中間の大きさは、ポル私2,10によって生産。我々は、プラスミドのoriが増加する(図3)からの距離と周波数の減少が、このプロトコルで提示条件の下で、ポル私の変異は、すべてのプラスミド上で発生することがわかった。この知見は、転移やColE1プラスミド複製中にはPol IIIにはPol Iから"スイッチが"少なくとも我々の実験条件2の下に、はるかに緩やかな以前の報告よりであることを意味し、そしてポル私とポルとの間の機能的な冗長性を示唆する以前の研究と一致III 11。
当社独自のプロトコルでは、液体培養(4)に変異を説明。このプロトコルは、RNA / DNAスイッチ(表1)に隣接する1000塩基の中で、すなわち、D <1000 0.41突然変異/ kbを得られます。どんな新鮮な培地を添加せずに3日間振盪機で液体培養を残すことHypersaturationは0.70突然変異/ kbに、非常に貧しいプラスミド収量の結果(1%未満1日目と比較すると、データは示していない)への変異頻度を発生させます(表1)。ここでは、直接37 ° C(図1)における固体寒天上で目的プラスミドの形質転換をめっきに基づいて簡易プロトコルを提示する。この手順では、変異誘発の突然変異/サイクル(0.92突然変異/ D <1000 KB)の最大周波数を生成し、非常に反復を容易にします。固体培地に培養条件を変更すると、突然変異のスペクトル(表2)に影響します。ダイレクトメッキの突然変異誘発は、マークは(C→T対G→AとA→GとT→Cを比較)液体培地で見られる相補的塩基対の置換の間に非対称性が減少。一方、直接めっきはより多くのindelsの(0.5%未満から4%へ)生産され、3倍で→G変異の数を減少し、G / Cの変異(74%)のoverrepresentationにつながる。全体的に、我々はここで紹介するダイレクトプレーティングプロトコルのより簡潔さと効率性の向上が液体変異導入により生成少しよりバランスのとれた突然変異スペクトルのメリットを上回ると信じています。
プラスミドターゲット内に、私たちのメソッドによって生成される変異が所望の標的配列に限定されるものではない。それは定性的ではなく定量的な変化を表しているしかし、小説生化学的活動の進化は、標的遺伝子内の変異に依存する必要があります。従って、勾配プレート上の変異体のスクリーニングとのプラスミド変異を組み合わせることで新たな生化学的性質の進化のための私たちのシステム(大規模なライブラリや選択の可用性)の強みを利用しています。このような既存の酵素活性の最適化や遺伝子の特定の領域をランダム化するようなランダム変異誘発の他のアプリケーションでは、ランダム変異誘発は、次のクローニングを必要としません。この場合、PCRの増幅産物とは対照的に、プラスミドでライブラリを持つことは、増幅し、制限を容易にすることにより、クローニングの効率を向上させます。
要するに、我々は、そのシンプルさのために、生成されたライブラリの多様性のため目立つ所定の標的遺伝子のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、このメソッドは新しい生化学的活動の効率的な発展のための機能的な選択と結合することができる方法を示します。さらに、私たちは、 生体内で生成されたライブラリ内の既存の活動の部位特異的変異誘発または最適化を可能に、容易にクローニングすることができる。
この作品は、K08 MCへの賞CA116429 - 04と今コンカーがんからの助成金によって(懸念)基礎#8501によってサポートされています
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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