에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

요약

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

초록

유전자 다양성의 효율적인 세대는 DNA 합성을 레이블에 고유한 분자 서명을 만들거나 실험실에서 단백질을 진화하는 데 사용할 수있는 귀중한 분자 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 주어진 대상 시퀀스 대형 (> 10 ¹¹⁾ 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 DNA의 중합 효소의 낮은 충실도 변형하여 ColE1 플라스미드 인코딩 원하는 순서의 복제 I (LF - 뽈 I)을 기반으로합니다. 플라스미드 대상은 E.의 mutator 변형으로 변화됩니다 대상 유전자의 위치에 따라 0.2, 1 변이 / 킬로바이트 사이 항복 대장균 및 고체 미디어에 도금. 높은 돌연변이 주파수는 돌연변이 유발의 과정을 iterating하여 얻을 수 있습니다. 더 복제 또는 PCR에 참여하지 않습니다과 같은 돌연변이 유발의 다른 방법에 비해, 우리의 프로토콜은 그 단순을 위해 의미합니다. 따라서, 우리의 방법은 mutational plasmids 또는 기타 폴 I 템플릿의 라벨 또는 원래의 대상에 존재하지 않는 활동의 진화에 대한 순서 공간 큰 부분을 탐험에 이상적입니다. PCR 또는 무작위 oligonucleotide 기반 방법을 제공은 또한 라이브러리의 특정 섹션의 후속 복제를 통해 얻을 수있는 꽉 공간을 제어합니다. 여기서 우리는 임의의 돌연변이 라이브러리를 만드는 방법을 보여주는 프로토콜을 제공하고 E.에서 마약을 기반으로 선택을 설정하는 방법 새로운 생화 학적 활동을 전시 돌연변이를 식별하는 대장균.

프로토콜

랜덤 돌연변이 도서관의 I. 생성

ColE1 플라스미드 복제 ^((1-3)에서 검토. 돌연변이 유발 우리의 방법이 원산지이나 복제 ColE1 플라스미드 인접에있는 대상 순서를 배치하고 낮은 충실도의 DNA 중합 효소에게 I을 표현하는 세포에 전파 기반의 폴 I의 mediates의 개시 (LF - 뽈 I). LF - 뽈 제가 복제의 충실도, 즉 I709N (모티브로), A759R (모티브 B) 및 D424A (교정의 운영을 중지시키지) ^4,5를 감소 세 변이를 인코딩 돌연변이의 DNA 중합 효소이다 LF - 뽈 나는 37에있는 주된 활동 °의 C. 복제된다. LF - 뽈 내가 폴 I (polA12) (6)의 온도에 민감한 allele을 가지고 E. 대장균 스트레인, JS200, 표현되도록 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성에 제한 조건이 결과에 따라 polA12 세포의 대상 순서가. 돌연변이 유발이 포화 문화 ^4보다 효율적입니다. 아직 불분명 아르 이유로, 돌연변이 유발이 지속 아니라, 돌연변이의 빈도를 즉, 숫자와 함께 선형적으로 증가하지 않습니다 세포가 새로운 미디어에 추가로 확장하는 허용하는 경우에도 문화, 채도에 도달 한 번. 따라서 세대의 더 라이브러리의 돌연변이 부하를 증가하는 것은 돌연변이 유발과 플라스미드 복구의 순찰을 반복해야합니다. 여기에 우리가 LF - 폴 I의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜 여기에 제시가 상당히 원하는 돌연변이 부하 (그림 1) 달성을위한 프로세스의 반복을 촉진하기 위해 우리의 원래의 설명 ^4에 비해 간소화되었습니다 있습니다.

자료

• 셀 : JS200 recA718 polA12 (TS) uvrA155 trpE65 롱 - 11 Sula 호텔
  • JS200 WT - 뽈 I : 야생 유형 (WT) 폴 I을 표현 JS200 세포
  • JS200 LF - 뽈 I : JS200 낮은 충실도 (LF) 폴 I을 표현
  • 판독 스트레인 : JS200 WT - 뽈 I 또는 (complementation)을 특정 활동을 부족한 변형
• 플라스미드 대상
  • 에서 복제된 대상 유전자로 복제 ColE1 원산지를 포함하는 플라스미드

1. 전 돌연변이 유발 : 전자 관할 JS200 LF - 폴 I 세포의 준비

1. 하룻밤 플라스미드 베어링 LF - 뽈 I (0.03mg / ML chloramphenicol)에 대한 적절한 항생제 선택을 포함하는 30 ° C (허용 조건)에서 성장 LB 판에서 단일 JS200 LF - 폴 I 콜로니를 선택하고 테스트에 식민지를 배치 chloramphenicol과 LB 8 ML을 포함하는 관. 30 문화를 성장 ° C와 하룻밤 250rpm에서 떨고.
2. 아침에, chloramphenicol과 400 ML LB을 포함하는 플라스크에 JS200 LF - 뽈 I의 8 ML를 따르고하여 문화를 확장합니다. 문화가 30기를 ° C는 0.4-0.7의 ₆₀₀ (일반적으로 3 - 4h)에 도달할 때까지 250rpm에서 떨고있는 동안.
3. 일단 0.4-0.7의 _600에서 15 분 동안 서부 유럽 표준시 얼음의 문화를 진정.
4. 원심 분리에 적합한 컨테이​​너에 차게 문화를 전송합니다. 4 원심 분리하여 세포 펠렛 ° C. 뜨는을 붓고, 다음 serological 피펫을 사용하여 컨테이너를 다시 중단 세포 멸균 및 냉각 (서부 유럽 표준시 얼음)에 10 % 글리세롤 10 ML를 추가합니다.
5. 50 ML 원뿔 관에 다시 정지 세포를 전송합니다. 4 15 분 동안 원심 후 10 % 글리세롤로 45 ML 표시 원뿔 튜브를 가득 채우고 ° C와 4000rpm.
6. , 뜨는을 붓고 원뿔 관에 10 % 글리세롤의 한 번 더 10 ML을 추가하고, serological 또는 일반 피펫을 사용하여 세포를 다시 일시 중지합니다. 다시 4 15 분 동안 10 % 글리세롤과 원심 분리기와 45 ML 표시 원뿔 튜브를 채워 ° C와 4000rpm. 두 번 이상 소금의 모든 흔적을 제거하는이 프로세스를 반복합니다.
7. 마지막 스핀 후 (즉, 10 % 글리세롤 2 ML과 세포 2 ML을 다시 중단) 동등 일부 10 % 글리세롤의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
8. 100 μL 여러 스토리지 튜브에 정지 세포 500 μL 사이 나누어지는. 드라이 아이스에있는 세포를 급속 냉동 후 -80에 그들을 저장 ° C.
9. 전기 관할 변환에 대한 세포를 사용하기 전에, 아래의 얼음이 천천히에있는 세포를 해동.

2. 돌연변이 유발 : 플라스미드 목표를 변형

1. 전기 관할 JS200 LF - 폴 I 세포와 2mm의 간격 electroporation의 쿠베트에 대상 플라스미드 DNA의 30 - 250ng 사이 피펫 40 μL.
   # 1 참고 : ColE1 플라스미드가 포함된 GFP는 컨트롤로 대상 유전자와 병렬로 돌연변이 유발을 통해 진행하실 수 있습니다. 판독 단계 완료 후, GFP는 LB 한천 플레이트에 도금 수 있으며, 돌연변이 유발에 대한 시각. 어둡거나 흐린 나타나는 식민지는 운영을 중지시키지 변이가 포함되어 있습니다.
2. 1800V에서 electroporator의 혼합물을 펄스. 각 샘플에 대한 균일한 electroporation 조건을 보장하기 위해 시간 상수를 (T _C) 확인, 이상적으로 T _C = 5-6 초.
3. 37 ° C (해상도에서 40 분 LB의 국물 1 ML에있는 세포 / DNA 혼합물을 복구250 rpm으로 흔들어 trictive 조건).
4. 100mm LB 한천 페트리 접시에 복구 문화의 플레이트 50 μL가 37 미리 예열 ° C chloramphenicol과 플라스미드 대상에 대한 선택 항생제의 적절한 농도를 모두 포함.
   참고 : # 2 : 접시 "근처 잔디밭"농도에서 세포를 목표로하고 있습니다. "근처 잔디밭"농도는 식민지의 독특한지만, 셀 수없는 명사 (> 1,000 식민지 / 100mm 요리)로 정의됩니다. 희석은 세포가 어떻게 전자 관할에 따라 달라집니다있는 경우, 도금. 세포는 매우 전자 관할하지 않다 "근처 잔디밭"는 복구 문화 '스트레이트'후 50, 뜨는을 부어, 4000rpm에서 2 분간 다시 중단 세포를 복구 문화를 원심 분리기 도금에 의해 달성되지 않는 경우 LB의 국물과 플레이트 문화의 μL.
5. 37 밤새 페트리 dishe (S) ° C. 품어

3. 돌연변이 유발 : 플라스미드 회수

1. 다음날, 세포를 통해 LB의 국물 2 ML을 pipetting하여 배양 접시를 씻으십시오. 멸균 삼각형 모양의 유리 막대로 접시를 그들을 "닦고"로 LB의 국물에 LB 한천 배양 접시에서 세균 식민지를 전송합니다. 첫째 LB의 국물 1 ML 추가 씻어를 수집하고 LB의 국물의 두 번째 ML과 절차를 반복합니다.
2. 플레이트 세척에서 플라스미드 DNA를 분리. (이 플라스미드 DNA가 라이브러리를 구성).
   # 3 참고 : LB 판에서 수집한 세차 전체 미니 준비가 너무 짙은 수 있습니다. 이 경우 미니 준비의 최대는 미니 준비 키트 (일반적으로,이 OD = 1로 씻어을 diluting 및 희석 문화 ~ 3 ML을 준비 관련)의 금액을 할당하거나 맥시 - 준비 최대 규모

4. 되풀이

1. 플라스미드 LF - 뽈 I를 linearizes 제한 효소로 플라스미드 DNA 격리의 1μg을 제한하지만, (보충 그림 1) 플라스미드 당신의 목표를 잘라하지 않습니다.
2. DNA 정제 키트를 사용하여 제한 다이제스트를 청소하십시오.
   # 4 참고 :이 단계는 제한 효소와 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 이 단계는 이후의 전자 관할 변환을 위해 소금 농도가 낮게 유지하는 것이 필수적입니다.
3. 신선한 JS200 LF - 뽈 I 세포로 제한 대상 - 플라스미드 도서관 뒤쪽의 다시 변환 30 - 250ng이 돌연변이 유발의 후속 반올림을 통해 라이브러리를 넣어.
   # 5 참고 : 제한 효소를 사용하여 나는 플라스미드 폴을 Linearizing 것은 플라스미드 대상이 변형 도착 보장합니다.
4. 섹션 2와 3을 반복합니다.

5. 판독

1. 플라스미드 대상과 내가 플라스미드 폴 모두 linearizes 제한 효소 (들)과 함께 격리 플라스미드 DNA를 제한합니다. plasmids의 수량과 품질을 보장​​하기 위해 1 % 아가로 오스 겔에 다이제스트를 실행합니다. ~ 분리된 플라스미드 DNA의 400ng을 제한하는 것이 일반적 분석에 충분합니다.
2. 플라스미드 LF - 뽈 I를 linearizes 제한 효소로 플라스미드 DNA 격리의 1μg을 제한하지만 목표는 플라스미드 잘라하지 않습니다.
3. DNA 정제 키트를 사용하여 제한 다이제스트를 청소하십시오.
4. 변이를 특징으로 판독 변형율로 제한 대상 플라스미드 라이브러리를 변환.

II. 그라데이션 성장 플레이트를 사용하여 돌연변이 화면과 뜨헤 분석.

우리 도서관에있는 광대한 유전적 다양성이 기능을 선택하는 결합 수있는 방법을 설명하기 위해, 여기서 우리는 E.의 생체내에서 마약을 기반으로 기능 선택을위한 프로토콜을 제공합니다 대장균. 이 방법은 고체 한천에 마약 기울기를 따라 성장을 기반으로합니다. 이것은 단일 약물 치료보다 넓은 다이나믹 레인지를 제공하고, 농도의 범위 (12까지) 여러 샘플의 동시 특성 수 있습니다. 또 다른 장점은이 분석의 비선형 판독은 2 배 범위 내에서 생존의 중간 차이를, 버퍼이다. 따라서,이 세포 독성 - 저항 분석 돌연변이 라이브러리를 선택하고 개별적인 돌연변이의 phenotypic 프로필을 결정하기 위해 견고하고 빠른 방법을 제공합니다. 그림. 2이 사용하는 각각의 예제를 보여줍니다 : 패널 인간 산화의 demethylase ABH2 ​​라이브러리에서 개별적인 돌연변이의 쇼 선택. WT 임계값 이상의 성장을 식민지는 methylating 에이전트 메틸 메탄 설 폰 산염 (MMS) ^7에 의한 세포 독성의 증가 보호를 위해 선택됩니다. 패널 B는 각각의 클론 특성화에 사용되는 그라디언트의 예제를 보여줍니다. 세 번째 세대 cephalosporin 항생제 cefotaxime에 대한 저항의 수준은 β - lactamase WT위한 한천 기울기에 두 확장 - 스펙트럼 돌연변이, R164H 및 E104K R164S G267R ⁴ 표시됩니다. 하나의 접시보다, 관찰 효과의 강도에 따라 적절한 것은 quantitation에 필요한있을 수 참고 : 0.4mg/ml 그라데이션은 제어 클론 직접 비교, 가장 강력한 돌연변이의 저항 수준을 허용하는 동안 수있는 높은 concen를 사용하여 설립cefotaxime (4mg/mL)의 tration.

자료

• 장비
  • 100x100x15mm 평방 배양 접시 (피셔 문화 # 0875711A)
  • 100mm 원형 페트리 접시
  • 25x75x1mm 유리 현미경 슬라이드 (피셔 문화가 # 1255015)
  • 50 ML 튜브는 졸업
• 미디어
  • LB 한천 : 56에 녹아과 물을 욕조에 equilibrated는 ° C
    # 6 참고 : 미디어의 온도 안정성 때문에 검사​​중인 약물이나 화합물의 활동에 영향을 줄 수 있습니다.
  • 소프트 아가르 : 42 녹인와 물을 욕조에 equilibrated ° C

1. 그라디언트의 건설

1. 광장 페트리 접시의 아래쪽 가장자리 중 하나에 걸쳐 균등하게 게재 마크 열 차선.
2. 아래 표시된 가장자리가 7mm 높긴하지만 그러한 인크 라인에 접시를 놓고;
   두꺼운 잔디 또는 다른 평평한 물체가 접시를 강화하도록 지원으로 사용할 수 있습니다. 25 ML을 부어 따뜻한 (~ 56 ° C) 경사 접시에 선택 에이전트 적절한 농도와 잘 혼합 LB ​​한천. 이것은 그라디언트의 맨 아래 레이어입니다. LB 한천이 균일하게 코팅 접시의 고가, 표시된 끝이 LB 한천의 ~ 1mm를 포함하고 낮춘 부분이 포함되어 있습니다 ~ LB 한천의 필름을 이러한 페트리 접시를 확인하십시오. 그럼 한천은 10~15분에 대해 설정할 수 있습니다.
   # 7 참고 : 소수성 선택 대리인의 경우 0.1 %의 계면 활성제 (antifoam B 유제)를 정지하고 약물의 균일한 분포를 용이하게하기 위해 LB 한천에 추가할 수 있습니다. 선택 에이전트 추가하기 전에 적극적으로 흔들림과 함께 따뜻한 멸균 LB 한천에 계면 활성제를 추가합니다. 계면 활성제는 작은 방울의 벌금 안개로 큰 방울 미디어가 너무는 뜨겁다 및 시험 약물의 균일한 분포를 억제 있습니다 나타내는 중지해야합니다.
3. LB 한천의 첫 번째 25 ML이 강화된 후, 접시는 평평한 표면에 이동합니다. 다음, 선택 에이전트없이 LB 한천의 25 ML는 첫 번째 LB 한천 표면을 오버레이에 붓고 있습니다. 이것은 그라디언트의 최상위 계층입니다. LB 한천은 하단 레이어의 전체 표면을 다루고 있는지 확인하십시오. 환기를위한 덮개 비스듬히로 커버하고, 한천은 10-15분에 대해 설정할 수 있습니다.
   # 8 참고 : 에어로졸 위험 및 테스트 화합물의 잠재적인 휘발 인식한다, 화학 안전 요구 사항을 정하는 경우 화학적 또는 생물 학적 안전 후드에 그라디언트를 부어.
   # 9 주 : 그라데이션 요리는 약물이나 시험 화합물 농도의 경사도를 보존하기 위해 4h 이내에 사용해야합니다.

2. 박테리아의 양도 스탬프

1. 소프트 한천 42 ° C.에 equilibrated해야 100mm 원형 페트리 접시의 뚜껑이나 하단에 액체 부드러운 한천 2 ML을 전송합니다. 다음 피펫 40 부드러운 한천에 세균성 문화의 μL 및 플레이트 로킹하여 섞는다.
   # 10 참고 : 세균성 문화의 성장 단계는 약물이나 시험 화합물에의 응답에 영향을 수 있습니다. 고정 단계에서 로그 단계 또는 야간 문화에 문화가 균일한 결과에 대한 일관성과 함께 사용해야합니다. 셀 밀도도 스큐 상대적인 결과를 수있다, 따라서 모든 문화가 ₆₀₀ 밀도 값과 일치하도록 희석한다. 숙박 문화가 ₆₀₀ 미만의 밀도 1.0로 희석해야
2. 소프트 한천 혼합과 유리 현미경 슬라이드의 긴 가장자리 외투. 그런 다음, 그라데이션 접시에 바닥 표시와 슬라이드의 가장자리를 코팅 (고농도에 낮은에서) 정렬, 한천의 표면에 슬라이드를 터치. 부드러운 터치의 기울기 표면에 부드러운 한천의 리본을 전송하기에 충분합니다. 슬라이드 그런 다음 세척 및 재사용을 위해 별도로 설정됩니다.
3. 세균성 샘플의 나머지를 위해,이 과정을 반복합니다. 여러 그라디언트가 실행되고있다면 참고 샘플은 각 기울기 접시에 포함되어야합니다.
4. 37 아래 밤새 그라데이션 접시 위로 품어 ° C. 부화의 시간과 온도는 37 가지 판독 박테리아 변종하지만 하룻밤을위한 다를 수 있습니다 ° C는 일반적으로 눈에 띄는 성장을위한 충분합니다.

3. 이미징 및 성장 분석

1. 이미징 : 하룻밤 성장 후, 그라디언트가 직접 몇 군데 또는 고정 및 대비 향상을 95 % EtOH에서 0.2mg / ML Acridine 오렌지의 솔루션을 물들일 수 있습니다. 접시는 얼룩 솔루션에서 5 분 상온에서 incubated이며, 다음 95 % EtOH로 씻은 다음 자외선 상자여 군데.
   # 11 참고 : 접시에서 식민지를 플러시 아니라 접시 위에 얼룩 솔루션과 세척을 바위와 구석에서 솔루션을 제거하지 않도록 조심.
2. 개인 돌연변이 plasmids의 표현형 분석을 위해, 농도 기울기에 대한 성장의 거리는 각 기울기에 대한 표준 정상화됩니다. 이러한 상대적인 값은 다음 그라디언트를 통해 비교할 수 있습니다.
   # 12 참고 : 날카로운 가장자리 또는 이상 확산 가장자리 (예 : 패널 그림 2에서 A와 B에 대한 비교) 관찰, 세포 독성 효과의 성격에 따라 수 있습니다. 확산 가장자리의 경우, 그것은 에지 O를 측정하는 것이 좋습니다개별 식민지가 증가 다양성을 표시하는 경향이 같은 지속 성장 F.
3. 라이브러리 선택은 부모 야생 유형 제어보다 높은 농도에서 성장 각각의 식민지가 고립 증가 보호에 기여 변이를 식별하는 순서가 있습니다.

III. 대표 결과 :

그림 1. 액체와 직접 도금 돌연변이 유발 프로토콜 사이의 비교. (아래) 여기서 제시 직접 도금 돌연변이 유발 프로토콜 빠른이며 오리지널 액체 돌연변이 유발 프로토콜 (상단)보다 적은 수의 단계를 필요로합니다. GFP가 기자로 사용하면 형광의 변화는 도서관에있는 유전적 다양성 선물을 나타내는 있습니다. 일반적으로 형광의 appreciably 감소 수준 12-18% 식민지에서 돌연변이 유발 결과 중 하나 사이클.

그림 2. 기울기 저항 assays. 패널 메틸 Methanesulfonate로 증가 저항 (MMS)에 대한 선택은. 인간의 산화 demethylase ABH2의 플라스미드 라이브러리는 MMS로 증가 저항이 선택되었습니다. 돌연변이 유발 프로토콜의 두 넷 반복을 대표하는 두 같은 라이브러리는 부모의 야생 유형 (WT)와 빈 벡터 (Δ)에 비해 표시됩니다. 화이트 라인은 각각의 돌연변이 식민지가 더욱 phenotypic 분석을위한 격리되었던 위의 한계를 나타냅니다. 확장된 대역 β - lactamase 활동을 나타내는 패널 B Cefotaxime 보호. R164H 및 E104K R164H G267R, 이전에 확인된 베타 - lactamase 두 가지 돌연변이가 다음과 LF - aztreonam 선택 ⁴ 결합 폴 I의 돌연변이 유발은 0.4μg/mL 및 4μg/mL cefotaxime 기울기에 표시됩니다. 야생 형 β - lactamase 효소가 빈 벡터, Δ을 표현하는 세포에 상대적으로 더 보호 수여하지 않습니다. 따라서 이러한 돌연변이가 새로운 생화 학적 활동을 ^8,9의 진화를 나타냅니다.

그림 3. 오라이 (D)에서 거리의 함수로 돌연변이 주파수는. 직접 도금 돌연변이 유발의 단일 사이클 다음과 같은 돌연변이 빈도는 복제의 ColE1 기원의 RNA / DNA 스위치에 비해 100 BP 간격에 대해 표시됩니다. β - lactamase는 중립 대상을 대표하지 않기 때문에 1600과 2400 사이의 영역이 표시되지 않습니다. β - lactamase 이상 지점이 지역에있는 변이의 전반적인 낮은 주파수 주어진 200 BP 간격을 나타냅니다. (R ² = 0.41와 이항 방정식) 경향이 라인으로 표시됩니다.

보충 그림 1. LF 투표소 I - 포함된 폴 나는 플라스미드. 시퀀스 (FastA 형식). 반복에 대한 두 플라스미드 폴 I를 linearizing (무작위 돌연변이 라이브러리 4 단계의 생성) 또는 판독 (5 단계) 때 사용할 수있는 적절한 제한 효소 (들)을 결정하는 순서 정보를 제공합니다. B 일반 기능과 플라스미드의 제한지도. 복제 pSC101 기원, chloramphenicol 저항 마커 (CAT) 및 LF - 폴 I 유전자의 위치가 제공됩니다. 단일 제한 사이트의 위치뿐만 아니라 표시됩니다.

도서관		직접 도금	액체 (1 일)	액체 (3 일간)
돌연변이 (#)		95	40	142
클론 합성	288	96	190
총 범위 (BP)	182000	102000	213000
돌연변 주파수 (X10 세 BP)	0.52	0.39	0.67
주파수 D <1000 (X10 세 BP)	0.92	0.41	0.70

표 1. 돌연변 주파수 세 돌연변이 유발 프로토콜에 대한 RNA / DNA 스위치에 인접한 1000 BP 이내 D <1000, IE 용 주파수 (# 변이 / BP의로 표시). 직접 도금, 액체 포화 (1 일), 액체 hypersaturation ( 3 일간).

		직접 도금	액체
돌연변이 (#)		95	182
스펙트럼 (%)
G하기	G하기	6.3	19.2
	C로 T	4.2	3.8
T에서 C	G하기	27.4	13.7
	T에서 C	35.8	35.2
T에	T에	5.3	8.2
	로 T	5.3	7.1
G로 T	G로 T	1.1	1.1
	C에	0.0	2.2
G T로	G T로	1.1	2.7
	로 C	2.1	2.7
G하기 위해 C	G하기 위해 C	2.1	1.1
	G에서 C	5.3	2.7
Indels	기능	3.2	0.0
	델	1.1	0.0
	N에	11.6	29.7
	N으로 G	33.7	19.2
	N에 T	10.5	12.1
	N을 C	40.0	39.0
	TS	73.7	72.0
	TV	22.1	28.0
	Indels	4.2	0

표 2. 직접 도금 및 액체에 대한 돌연변이 유발 변이의 통계. 표는 관찰 변이의 숫자 (번호) 및 돌연변이 유발의 단일 사이클 따라 변이 스펙트럼을 (%)를 보여줍니다. 스펙트럼은 뉴클레오 티드 변경, 보완 쌍별로 세분화하고, 돌연변이의 종류입니다.

토론

이 문서는 복제 또는 PCR에 대한 필요없이 대규모 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 플라스미드 인코딩 관심 일련의 오류가 자주 발생하는 복제를 기반으로합니다. 이론적으로, 돌연변이 크게 RNA / DNA 스위치의 바로 하류에 위치한 100-300 BP로 제한되어야 리더 스트랜드 중간의 크기는 폴 I ^2,10에 의해 생산. 우리는 플라스미드 오라이 증가 (그림 3)에서 거리로 주파수에 떨어지지만이 프로토콜에서 제시한 조건 하에서, 폴 I의 변이가 모든 플라스미드를 통해 발생하는 것으로 나타났습니다. 이 발견은 전환 또는 ColE1 플라스미드 복제하는 동안 폴 III에 폴 I에서 "스위치가"최소한의 실험 ^{조건이에서} 훨씬 더 점진적으로 이전에 보고된 것보다 것을 의미하고, 폴 I와 폴 사이의 기능 중복을 제안 이전의 연구에 동의 III ^11.

우리의 원래의 프로토콜은 액체 문화 (4)에서 돌연변이 유발을 설명했다. 이 프로토콜은 RNA / DNA 스위치 (표 1)에 인접한 1000 BP 내에 0.41 돌연변 / D <1000, IE 용 킬로바이트를 산출. 어떤 신선한 매체의 추가없이 3 일간 통에 액체 문화를 떠나는하여 Hypersaturation은 0.70 변이 / 킬로바이트하지만 매우 가난 플라스미드 수율 결과 (1 % 미만 1 일에 비해, 데이터는 표시되지 않음)에 돌연변이 주파수를 올립니다 ( 표 1). 여기에 우리가 직접 37 단단한 한천에 플라스미드 대상의 변환 도금을 기반으로 단순화된 프로토콜을 제시 ° C (그림 1). 이 절차는 돌연변이 유발의 돌연변이 /주기 (0.92 돌연변 / D <1000 KB)의 가장 큰 빈도를 생산 크게 반복을 용이하게합니다. 고체 미디어 문화 조건을 변경하면 변이 스펙트럼 (표 2)에 영향을 미칩니다. 직접 도금 돌연변이 유발이 표시는 (C → T 대 G → A와 → G → C T 대 비교) 액체 문화에서 볼 보완 기지 페어 대체 간의 이러한 비대칭성 감소시킵니다. 한편, 직접 도금 더 indels을 (이하 0.5 % 4 %에서) 생산 및 G / C 돌연변이 (74 %)의 overrepresentation로 이어지는 3 배로 → G 변이의 수를 감소. 전반적으로, 우리는 여기 제시 직접 도금 프로토콜의보다 단순 성과 효율성 향상 액체 돌연변이 유발에 의해 만들어진 약간 더 균형 돌연변이 스펙트럼의 장점을 능가 있다고 생각합니다.

플라스미드 대상 내에서 우리의 방법에 의해 생성되는 돌연변이가 원하는 대상 순서로 제한되지 않습니다. 그것이 오히려 양적 변화보다는 질적을 나타냅니다 그러나, 소설 생화학 활동의 발전, 목표 유전자 내에 돌연변이에 의존해야합니다. 따라서, 기울기 접시에 돌연변이 선별과 함께 플라스미드 돌연변이 유발을 결합하는 새로운 생화 학적 속성의 진화를위한 시스템 (대형 라이브러리와 선택의 가용성)의 장점에 capitalizes. 이러한 기존의 효소 활동을 최적화하거나 유전자의 특정 영역을 randomizing 등 무작위로 돌연변이 유발의 다른 응용 프로그램이 임의의 돌연변이 유발 다음 복제를 사용해야합니다. 이 경우에는, PCR의 증폭 제품 반대로 플라스미드의 도서관 것은 증폭 및 제한을 용이하게하여 복제의 효율성을 향상시킵니다.

요컨대, 우리는 단순과 생성된 라이브러리의 다양성을 위해 의미 주어진 대상 유전자의 무작위 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는이 방법이 새로운 생화 학적 활동의 효율적인 진화를위한 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리의 생체내 생성된 라이브러리는 기존 활동의 사이트에 특정 돌연변이 유발 또는 최적화를 허용, 쉽게 복제하실 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
carbenicillin	Cellgro	46100R6	0.1mg/ml final
tetracycline	Fisher Scientific	BP7640	0.05mg/ml final
chloramphenicol	Genlantis	M120100	0.03mg/ml final
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB Broth Miller	Difco Laboratories	244620
Soft Agar	Difco Laboratories	214580	Made in house
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A38401-1
Antifoam B emulsion	Sigma-Aldrich	A5757
Glycerol	Acros Organics	332030025
100x100x15mm sq dish	Fisher Scientific	0875711A
100mm rnd dish	Fisher Scientific	0875712A
Microscope slide 25x75x1mm	Gold Seal	3048
Electroporator 2510	Eppendorf
Electroporator 2510	Eppendorf
2mm gap tubes	Molecular BioProducts	5520
Zippy mini prep kit	Zymo Research Corp.	D4020