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여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.
유전자 다양성의 효율적인 세대는 DNA 합성을 레이블에 고유한 분자 서명을 만들거나 실험실에서 단백질을 진화하는 데 사용할 수있는 귀중한 분자 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 주어진 대상 시퀀스 대형 (> 10 11) 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 DNA의 중합 효소의 낮은 충실도 변형하여 ColE1 플라스미드 인코딩 원하는 순서의 복제 I (LF - 뽈 I)을 기반으로합니다. 플라스미드 대상은 E.의 mutator 변형으로 변화됩니다 대상 유전자의 위치에 따라 0.2, 1 변이 / 킬로바이트 사이 항복 대장균 및 고체 미디어에 도금. 높은 돌연변이 주파수는 돌연변이 유발의 과정을 iterating하여 얻을 수 있습니다. 더 복제 또는 PCR에 참여하지 않습니다과 같은 돌연변이 유발의 다른 방법에 비해, 우리의 프로토콜은 그 단순을 위해 의미합니다. 따라서, 우리의 방법은 mutational plasmids 또는 기타 폴 I 템플릿의 라벨 또는 원래의 대상에 존재하지 않는 활동의 진화에 대한 순서 공간 큰 부분을 탐험에 이상적입니다. PCR 또는 무작위 oligonucleotide 기반 방법을 제공은 또한 라이브러리의 특정 섹션의 후속 복제를 통해 얻을 수있는 꽉 공간을 제어합니다. 여기서 우리는 임의의 돌연변이 라이브러리를 만드는 방법을 보여주는 프로토콜을 제공하고 E.에서 마약을 기반으로 선택을 설정하는 방법 새로운 생화 학적 활동을 전시 돌연변이를 식별하는 대장균.
랜덤 돌연변이 도서관의 I. 생성
ColE1 플라스미드 복제 ((1-3)에서 검토. 돌연변이 유발 우리의 방법이 원산지이나 복제 ColE1 플라스미드 인접에있는 대상 순서를 배치하고 낮은 충실도의 DNA 중합 효소에게 I을 표현하는 세포에 전파 기반의 폴 I의 mediates의 개시 (LF - 뽈 I). LF - 뽈 제가 복제의 충실도, 즉 I709N (모티브로), A759R (모티브 B) 및 D424A (교정의 운영을 중지시키지) 4,5를 감소 세 변이를 인코딩 돌연변이의 DNA 중합 효소이다 LF - 뽈 나는 37에있는 주된 활동 °의 C. 복제된다. LF - 뽈 내가 폴 I (polA12) (6)의 온도에 민감한 allele을 가지고 E. 대장균 스트레인, JS200, 표현되도록 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성에 제한 조건이 결과에 따라 polA12 세포의 대상 순서가. 돌연변이 유발이 포화 문화 4보다 효율적입니다. 아직 불분명 아르 이유로, 돌연변이 유발이 지속 아니라, 돌연변이의 빈도를 즉, 숫자와 함께 선형적으로 증가하지 않습니다 세포가 새로운 미디어에 추가로 확장하는 허용하는 경우에도 문화, 채도에 도달 한 번. 따라서 세대의 더 라이브러리의 돌연변이 부하를 증가하는 것은 돌연변이 유발과 플라스미드 복구의 순찰을 반복해야합니다. 여기에 우리가 LF - 폴 I의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜 여기에 제시가 상당히 원하는 돌연변이 부하 (그림 1) 달성을위한 프로세스의 반복을 촉진하기 위해 우리의 원래의 설명 4에 비해 간소화되었습니다 있습니다.
자료
1. 전 돌연변이 유발 : 전자 관할 JS200 LF - 폴 I 세포의 준비
2. 돌연변이 유발 : 플라스미드 목표를 변형
3. 돌연변이 유발 : 플라스미드 회수
4. 되풀이
5. 판독
II. 그라데이션 성장 플레이트를 사용하여 돌연변이 화면과 뜨헤 분석.
우리 도서관에있는 광대한 유전적 다양성이 기능을 선택하는 결합 수있는 방법을 설명하기 위해, 여기서 우리는 E.의 생체내에서 마약을 기반으로 기능 선택을위한 프로토콜을 제공합니다 대장균. 이 방법은 고체 한천에 마약 기울기를 따라 성장을 기반으로합니다. 이것은 단일 약물 치료보다 넓은 다이나믹 레인지를 제공하고, 농도의 범위 (12까지) 여러 샘플의 동시 특성 수 있습니다. 또 다른 장점은이 분석의 비선형 판독은 2 배 범위 내에서 생존의 중간 차이를, 버퍼이다. 따라서,이 세포 독성 - 저항 분석 돌연변이 라이브러리를 선택하고 개별적인 돌연변이의 phenotypic 프로필을 결정하기 위해 견고하고 빠른 방법을 제공합니다. 그림. 2이 사용하는 각각의 예제를 보여줍니다 : 패널 인간 산화의 demethylase ABH2 라이브러리에서 개별적인 돌연변이의 쇼 선택. WT 임계값 이상의 성장을 식민지는 methylating 에이전트 메틸 메탄 설 폰 산염 (MMS) 7에 의한 세포 독성의 증가 보호를 위해 선택됩니다. 패널 B는 각각의 클론 특성화에 사용되는 그라디언트의 예제를 보여줍니다. 세 번째 세대 cephalosporin 항생제 cefotaxime에 대한 저항의 수준은 β - lactamase WT위한 한천 기울기에 두 확장 - 스펙트럼 돌연변이, R164H 및 E104K R164S G267R 4 표시됩니다. 하나의 접시보다, 관찰 효과의 강도에 따라 적절한 것은 quantitation에 필요한있을 수 참고 : 0.4mg/ml 그라데이션은 제어 클론 직접 비교, 가장 강력한 돌연변이의 저항 수준을 허용하는 동안 수있는 높은 concen를 사용하여 설립cefotaxime (4mg/mL)의 tration.
자료
1. 그라디언트의 건설
2. 박테리아의 양도 스탬프
3. 이미징 및 성장 분석
III. 대표 결과 :
그림 1. 액체와 직접 도금 돌연변이 유발 프로토콜 사이의 비교. (아래) 여기서 제시 직접 도금 돌연변이 유발 프로토콜 빠른이며 오리지널 액체 돌연변이 유발 프로토콜 (상단)보다 적은 수의 단계를 필요로합니다. GFP가 기자로 사용하면 형광의 변화는 도서관에있는 유전적 다양성 선물을 나타내는 있습니다. 일반적으로 형광의 appreciably 감소 수준 12-18% 식민지에서 돌연변이 유발 결과 중 하나 사이클.
그림 2. 기울기 저항 assays. 패널 메틸 Methanesulfonate로 증가 저항 (MMS)에 대한 선택은. 인간의 산화 demethylase ABH2의 플라스미드 라이브러리는 MMS로 증가 저항이 선택되었습니다. 돌연변이 유발 프로토콜의 두 넷 반복을 대표하는 두 같은 라이브러리는 부모의 야생 유형 (WT)와 빈 벡터 (Δ)에 비해 표시됩니다. 화이트 라인은 각각의 돌연변이 식민지가 더욱 phenotypic 분석을위한 격리되었던 위의 한계를 나타냅니다. 확장된 대역 β - lactamase 활동을 나타내는 패널 B Cefotaxime 보호. R164H 및 E104K R164H G267R, 이전에 확인된 베타 - lactamase 두 가지 돌연변이가 다음과 LF - aztreonam 선택 4 결합 폴 I의 돌연변이 유발은 0.4μg/mL 및 4μg/mL cefotaxime 기울기에 표시됩니다. 야생 형 β - lactamase 효소가 빈 벡터, Δ을 표현하는 세포에 상대적으로 더 보호 수여하지 않습니다. 따라서 이러한 돌연변이가 새로운 생화 학적 활동을 8,9의 진화를 나타냅니다.
그림 3. 오라이 (D)에서 거리의 함수로 돌연변이 주파수는. 직접 도금 돌연변이 유발의 단일 사이클 다음과 같은 돌연변이 빈도는 복제의 ColE1 기원의 RNA / DNA 스위치에 비해 100 BP 간격에 대해 표시됩니다. β - lactamase는 중립 대상을 대표하지 않기 때문에 1600과 2400 사이의 영역이 표시되지 않습니다. β - lactamase 이상 지점이 지역에있는 변이의 전반적인 낮은 주파수 주어진 200 BP 간격을 나타냅니다. (R 2 = 0.41와 이항 방정식) 경향이 라인으로 표시됩니다.
보충 그림 1. LF 투표소 I - 포함된 폴 나는 플라스미드. 시퀀스 (FastA 형식). 반복에 대한 두 플라스미드 폴 I를 linearizing (무작위 돌연변이 라이브러리 4 단계의 생성) 또는 판독 (5 단계) 때 사용할 수있는 적절한 제한 효소 (들)을 결정하는 순서 정보를 제공합니다. B 일반 기능과 플라스미드의 제한지도. 복제 pSC101 기원, chloramphenicol 저항 마커 (CAT) 및 LF - 폴 I 유전자의 위치가 제공됩니다. 단일 제한 사이트의 위치뿐만 아니라 표시됩니다.
도서관 | 직접 도금 | 액체 (1 일) | 액체 (3 일간) | |
돌연변이 (#) | 95 | 40 | 142 | |
클론 합성 | 288 | 96 | 190 | |
총 범위 (BP) | 182000 | 102000 | 213000 | |
돌연변 주파수 (X10 세 BP) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
주파수 D <1000 (X10 세 BP) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
표 1. 돌연변 주파수 세 돌연변이 유발 프로토콜에 대한 RNA / DNA 스위치에 인접한 1000 BP 이내 D <1000, IE 용 주파수 (# 변이 / BP의로 표시). 직접 도금, 액체 포화 (1 일), 액체 hypersaturation ( 3 일간).
직접 도금 | 액체 | ||
돌연변이 (#) | 95 | 182 | |
스펙트럼 (%) | |||
G하기 | G하기 | 6.3 | 19.2 |
C로 T | 4.2 | 3.8 | |
T에서 C | G하기 | 27.4 | 13.7 |
T에서 C | 35.8 | 35.2 | |
T에 | T에 | 5.3 | 8.2 |
로 T | 5.3 | 7.1 | |
G로 T | G로 T | 1.1 | 1.1 |
C에 | 0.0 | 2.2 | |
G T로 | G T로 | 1.1 | 2.7 |
로 C | 2.1 | 2.7 | |
G하기 위해 C | G하기 위해 C | 2.1 | 1.1 |
G에서 C | 5.3 | 2.7 | |
Indels | 기능 | 3.2 | 0.0 |
델 | 1.1 | 0.0 | |
N에 | 11.6 | 29.7 | |
N으로 G | 33.7 | 19.2 | |
N에 T | 10.5 | 12.1 | |
N을 C | 40.0 | 39.0 | |
TS | 73.7 | 72.0 | |
TV | 22.1 | 28.0 | |
Indels | 4.2 | 0 |
표 2. 직접 도금 및 액체에 대한 돌연변이 유발 변이의 통계. 표는 관찰 변이의 숫자 (번호) 및 돌연변이 유발의 단일 사이클 따라 변이 스펙트럼을 (%)를 보여줍니다. 스펙트럼은 뉴클레오 티드 변경, 보완 쌍별로 세분화하고, 돌연변이의 종류입니다.
이 문서는 복제 또는 PCR에 대한 필요없이 대규모 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 플라스미드 인코딩 관심 일련의 오류가 자주 발생하는 복제를 기반으로합니다. 이론적으로, 돌연변이 크게 RNA / DNA 스위치의 바로 하류에 위치한 100-300 BP로 제한되어야 리더 스트랜드 중간의 크기는 폴 I 2,10에 의해 생산. 우리는 플라스미드 오라이 증가 (그림 3)에서 거리로 주파수에 떨어지지만이 프로토콜에서 제시한 조건 하에서, 폴 I의 변이가 모든 플라스미드를 통해 발생하는 것으로 나타났습니다. 이 발견은 전환 또는 ColE1 플라스미드 복제하는 동안 폴 III에 폴 I에서 "스위치가"최소한의 실험 조건이에서 훨씬 더 점진적으로 이전에 보고된 것보다 것을 의미하고, 폴 I와 폴 사이의 기능 중복을 제안 이전의 연구에 동의 III 11.
우리의 원래의 프로토콜은 액체 문화 (4)에서 돌연변이 유발을 설명했다. 이 프로토콜은 RNA / DNA 스위치 (표 1)에 인접한 1000 BP 내에 0.41 돌연변 / D <1000, IE 용 킬로바이트를 산출. 어떤 신선한 매체의 추가없이 3 일간 통에 액체 문화를 떠나는하여 Hypersaturation은 0.70 변이 / 킬로바이트하지만 매우 가난 플라스미드 수율 결과 (1 % 미만 1 일에 비해, 데이터는 표시되지 않음)에 돌연변이 주파수를 올립니다 ( 표 1). 여기에 우리가 직접 37 단단한 한천에 플라스미드 대상의 변환 도금을 기반으로 단순화된 프로토콜을 제시 ° C (그림 1). 이 절차는 돌연변이 유발의 돌연변이 /주기 (0.92 돌연변 / D <1000 KB)의 가장 큰 빈도를 생산 크게 반복을 용이하게합니다. 고체 미디어 문화 조건을 변경하면 변이 스펙트럼 (표 2)에 영향을 미칩니다. 직접 도금 돌연변이 유발이 표시는 (C → T 대 G → A와 → G → C T 대 비교) 액체 문화에서 볼 보완 기지 페어 대체 간의 이러한 비대칭성 감소시킵니다. 한편, 직접 도금 더 indels을 (이하 0.5 % 4 %에서) 생산 및 G / C 돌연변이 (74 %)의 overrepresentation로 이어지는 3 배로 → G 변이의 수를 감소. 전반적으로, 우리는 여기 제시 직접 도금 프로토콜의보다 단순 성과 효율성 향상 액체 돌연변이 유발에 의해 만들어진 약간 더 균형 돌연변이 스펙트럼의 장점을 능가 있다고 생각합니다.
플라스미드 대상 내에서 우리의 방법에 의해 생성되는 돌연변이가 원하는 대상 순서로 제한되지 않습니다. 그것이 오히려 양적 변화보다는 질적을 나타냅니다 그러나, 소설 생화학 활동의 발전, 목표 유전자 내에 돌연변이에 의존해야합니다. 따라서, 기울기 접시에 돌연변이 선별과 함께 플라스미드 돌연변이 유발을 결합하는 새로운 생화 학적 속성의 진화를위한 시스템 (대형 라이브러리와 선택의 가용성)의 장점에 capitalizes. 이러한 기존의 효소 활동을 최적화하거나 유전자의 특정 영역을 randomizing 등 무작위로 돌연변이 유발의 다른 응용 프로그램이 임의의 돌연변이 유발 다음 복제를 사용해야합니다. 이 경우에는, PCR의 증폭 제품 반대로 플라스미드의 도서관 것은 증폭 및 제한을 용이하게하여 복제의 효율성을 향상시킵니다.
요컨대, 우리는 단순과 생성된 라이브러리의 다양성을 위해 의미 주어진 대상 유전자의 무작위 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는이 방법이 새로운 생화 학적 활동의 효율적인 진화를위한 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리의 생체내 생성된 라이브러리는 기존 활동의 사이트에 특정 돌연변이 유발 또는 최적화를 허용, 쉽게 복제하실 수 있습니다.
이 작품은 수상 K08 MC로 CA116429 - 04과 지금 정복 암에서 부여 (우려) 기초 # 8501에 의해 지원되었습니다
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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