Method Article
Ici nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutant pour une séquence cible donnée. Nous montrons comment cette méthode, qui est réalisée in vivo chez Escherichia coli, peuvent être couplées avec des sélections fonctionnelles d'évoluer de nouvelles activités enzymatiques.
La génération efficace de la diversité génétique représente un outil précieux moléculaire qui peut être utilisé pour étiqueter synthèse de l'ADN, afin de créer des signatures moléculaires uniques, ou de faire évoluer les protéines dans le laboratoire. Ici, nous présentons un protocole qui permet la génération de grande taille (> 10 11) banques de mutants pour une séquence cible donnée. Cette méthode est basée sur la réplication d'un plasmide d'encodage ColE1 la séquence désirée par une variante basse-fidélité de l'ADN polymérase I (Pol LF-I). Le plasmide cible est transformé en une souche de E. mutator coli et étalées sur un milieu solide, ce qui donne entre 0,2 et 1 mutations / ko, en fonction de la localisation du gène cible. Fréquences de mutation plus élevés sont obtenus par itération de ce processus de mutagenèse. Comparé à d'autres méthodes de mutagenèse, notre protocole se distingue par sa simplicité, comme le clonage ou la PCR ne sont impliqués. Ainsi, notre méthode est idéale pour l'étiquetage mutationnel de plasmides ou autres modèles, je Pol ou à explorer une grande partie de l'espace de séquence pour l'évolution des activités non présentes dans la cible originale. Le contrôle serré spatiale que la PCR ou randomisé à base d'oligonucléotides offrent des méthodes peuvent aussi être atteints par clonage ultérieur des sections spécifiques de la bibliothèque. Ici nous fournir des protocoles montrant comment créer une bibliothèque aléatoire de mutants et comment établir des médicaments à base des sélections dans E. coli afin d'identifier des mutants présentant de nouvelles activités biochimiques.
Génération d'une bibliothèque I. aléatoire Mutant
Pol I médie l'initiation de la réplication plasmidique ColE1 (examiné dans (1-3). Notre méthode de mutagenèse est basé sur le placement d'une séquence cible dans un plasmide ColE1 adjacentes à l'origine ou la réplication et la propager dans les cellules exprimant l'ADN polymérase basse-fidélité, je (LF-Pol I). LF-Pol I est une ADN polymérase I mutant codant trois mutations qui diminuent la fidélité de la réplication, à savoir I709N (dans le motif A), A759R (dans le motif B) et D424A (inactivation relecture) 4,5 . LF-Pol I est exprimé dans une souche de E. coli, JS200, qui a un allèle sensibles à la température de Pol I (polA12) (6) de telle sorte que la LF-Pol I devient l'activité prédominante à 37 ° C. La réplication de l' séquence cible dans polA12 cellules sous des conditions restrictives des résultats dans la génération aléatoire d'une bibliothèque de mutants. mutagenèse est plus efficace dans les cultures saturées 4. Pour des raisons encore obscures, la mutagenèse n'est pas continu, c'est à dire la fréquence des mutations n'augmente pas linéairement avec le nombre des générations fois la culture atteint la saturation, même si les cellules sont autorisés à développer davantage dans des milieux frais. Par conséquent, à accroître encore la charge de mutation de la bibliothèque nécessite séries itératives de la mutagenèse et la récupération de plasmide. Ici nous fournir des protocoles pour LF-Pol mutagenèse j'ai. Notez que les protocoles présentés ici ont été considérablement simplifiées par rapport à nos 4 description originale afin de faciliter l'itération du processus pour parvenir à la charge mutation désirée (figure 1).
Matériaux
1. Avant de mutagenèse: Préparation des électro-compétentes JS200 cellules I LF-Pol
2. Mutagenèse: Transformer le plasmide cible
3. Mutagenèse: récupération plasmidique
4. Itération
5. Lecture
II. Ecran Mutant et analyse en utilisant des plaques de croissance Trait dégradé.
Afin d'illustrer la façon dont la grande diversité génétique présente dans nos bibliothèques peuvent être couplés à une sélection fonctionnelle, ici nous fournir un protocole pour les médicaments à base sélections fonctionnelle in vivo dans E. coli. Cette méthode est basée sur la croissance le long d'un gradient de drogue sur gélose solide. Cela permet la caractérisation simultanée de plusieurs échantillons (jusqu'à 12) sur une plage de concentrations, fournissant une gamme dynamique plus large qu'un traitement médicamenteux seul. Un autre avantage est que la lecture non linéaire de ce dosage tampons de légères différences dans la viabilité, dans une fourchette de 2 fois. Ainsi, ce test de cytotoxicité de résistance fournit un moyen robuste et rapide pour sélectionner les bibliothèques de mutants et de déterminer le profil phénotypique des mutants individuels. Fig. 2 montre un exemple de chacune de ces utilisations: panneau montre une sélection de mutants individuels à partir d'un oxydant déméthylase humaine ABH2 bibliothèque. Colonies de croissance au-dessus du seuil de WT sont sélectionnés pour une protection accrue contre la cytotoxicité causée par le méthanesulfonate de méthyle agent de méthylation (MMS) 7. Groupe B montre un exemple de gradients utilisés pour la caractérisation des clones individuels. Le niveau de résistance à la troisième génération céfotaxime antibiotique céphalosporine est montré sur une pente de gélose pour WT β-lactamase et pour deux à spectre étendu mutants, R164H et E104K R164S G267R 4. Notez que selon la force des effets observés, plus que d'une seule plaque peut être nécessaire pour la quantification adéquate: tandis que le gradient 0.4mg/ml permet une comparaison directe avec les clones de contrôle, le niveau de résistance du mutant plus puissants ne peuvent être établie en utilisant une concentration plus élevéetration de céfotaxime (4mg/mL).
Matériaux
1. Construction de la pente
2. Cachet transfert de bactéries
3. Imagerie et analyse de la croissance
III. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Comparaison entre les liquides et les protocoles de mutagenèse directe placage. Le protocole ensemencement direct mutagenèse présentés ici (en bas) est plus rapide et nécessite moins d'étapes que notre protocole de mutagenèse originale liquide (en haut). Lorsque la GFP est utilisée en tant que journaliste, les variations de fluorescence sont indicatifs de la diversité génétique présente dans la bibliothèque. Typiquement, un cycle de mutagenèse des résultats dans des colonies de 12-18% avec des niveaux sensiblement diminué de fluorescence.
Figure 2. Tests de résistance dégradé. Groupe A de sélection pour une résistance accrue à Methyl-méthanesulfonate (MMS). Bibliothèques de plasmides de l'humain déméthylase oxydatif ABH2 ont été sélectionnées pour une résistance accrue aux MMS. Deux de ces bibliothèques représentent deux et quatre itérations du protocole de mutagenèse sont présentés en comparaison avec le type parental sauvage (WT) et le vecteur vide (Δ). La ligne blanche représente le seuil à partir duquel chaque colonies mutantes ont été isolés pour l'analyse phénotypique plus loin. Panel B céfotaxime protection, indicatif de spectre étendu β-lactamase activité. R164H et E104K R164H G267R, deux mutants de beta-lactamase précédemment identifiés suivants LF- Pol I mutagenèse couplée à la sélection aztréonam 4, sont présentées sur une 0.4μg/mL et un gradient 4μg/mL céfotaxime. Notez que le type sauvage β-lactamase enzyme confère pas de protection par rapport aux cellules exprimant un vecteur vide, Δ. Par conséquent, ces mutants représentent l'évolution d'une nouvelle activité biochimique 8,9.
Figure 3. Fréquence de mutation en fonction de la distance par Ori (d). La fréquence de mutation après un seul cycle de mutagenèse ensemencement direct est indiqué pour des intervalles de 100 pb par rapport à l'interrupteur ARN / ADN de l'origine de réplication ColE1. La région entre 1600 et 2400 n'est pas représenté parce β-lactamase ne représente pas une cible neutre. Les points au-delà β-lactamase représentent des intervalles de 200 pb étant donné la fréquence de la mutation globale faible dans ce domaine. La tendance (équation binôme, avec un R 2 = 0,41) est représentée par une ligne.
Figure 1 supplémentaire. Pol I-LF contenant Pol I plasmide. Une séquence (format fasta). Information sur la séquence pour déterminer l'enzyme de restriction appropriée (s) à utiliser lors de la linéarisation du plasmide Pol I soit pour l'itération (génération d'une étape bibliothèque mutation aléatoire 4) ou de lecture (étape 5). B Caractéristiques générales et carte de restriction du plasmide. Le emplacement de l'origine pSC101 de réplication, le marqueur de résistance au chloramphénicol (CAT) et LF-Pol gène I sont présentés. La localisation des sites de restriction unique est indiqué aussi bien.
Bibliothèque | Ensemencement direct | Liquid (1 jour) | Liquid (3 jours) | |
Mutations (#) | 95 | 40 | 142 | |
Clones séquencés | 288 | 96 | 190 | |
Couverture totale (pb) | 182000 | 102000 | 213000 | |
Mutation freq (x10 3 pb) | 0,52 | 0,39 | 0,67 | |
Freq d <1000 (x10 3 pb) | 0,92 | 0,41 | 0,70 |
Tableau 1. Fréquences de mutation Fréquences (exprimée en nombre de mutations / pb) pour d <1000, c'est à dire au sein du BP 1000 à côté de l'interrupteur ARN / ADN, pour trois protocoles mutagenèse:. Ensemencement direct, la saturation de liquide (1 jour), et hypersaturation liquide ( 3 jours).
Ensemencement direct | Liquid | ||
Mutations (#) | 95 | 182 | |
Spectre (%) | |||
A à G | A à G | 6.3 | 19,2 |
T à C | 4.2 | 3.8 | |
C à T | G à A | 27,4 | 13,7 |
C à T | 35,8 | 35,2 | |
A à T | A à T | 5.3 | 8.2 |
T à A | 5.3 | 7.1 | |
T à G | T à G | 1.1 | 1.1 |
A à C | 0.0 | 2.2 | |
G à T | G à T | 1.1 | 2.7 |
C à A | 2.1 | 2.7 | |
C à G | C à G | 2.1 | 1.1 |
G à C | 5.3 | 2.7 | |
Indels | Ins | 3.2 | 0.0 |
Del | 1.1 | 0.0 | |
A à N | 11,6 | 29,7 | |
G à N | 33,7 | 19,2 | |
T à N | 10,5 | 12,1 | |
C à N | 40,0 | 39,0 | |
Ts | 73,7 | 72,0 | |
Tv | 22,1 | 28,0 | |
Indels | 4.2 | 0 |
Tableau 2. Métriques de mutation pour l'ensemencement direct et la mutagénèse liquide. Le tableau présente le nombre de mutations observées (en nombre) et le spectre de mutation (en%) après un seul cycle de mutagenèse. Le spectre est ventilé par paires complémentaires, par des changements de nucléotides, et par le type de mutation.
Cet article présente un protocole de mutagenèse qui permet la génération aléatoire des grandes banques de mutants sans la nécessité pour le clonage ou la PCR. Cette méthode est basée sur erreurs de réplication d'un plasmide codant pour une séquence d'intérêt. En théorie, les mutations devraient être largement limités aux 100-300 pb située immédiatement en aval de l'interrupteur de l'ARN / ADN, la taille de leader brin intermédiaire produite par Pol I 2,10. Nous avons constaté que dans les conditions présentées dans le présent protocole, Pol mutations se produisent partout dans I le plasmide, bien que diminuant la fréquence comme la distance entre les augmentations Ori plasmide (figure 3). Cette constatation implique que la transition ou "switch" de Pol I Pol III pendant ColE1 réplication plasmidique est beaucoup plus progressif que celui rapporté antérieurement, au moins dans nos conditions expérimentales 2, et est d'accord avec les études antérieures suggérant une redondance fonctionnelle entre Pol I et Pol III 11.
Notre protocole original décrit mutagenèse dans des cultures liquides (4). Ce protocole donne 0,41 mutations / Ko pour d <1000, c'est à dire au sein du BP 1000 adjacent à l'ADN / ARN interrupteur (tableau 1). Hypersaturation en laissant le liquide de culture dans le shaker pendant 3 jours sans l'ajout de toute nouvelle presse soulève la fréquence de mutation à 0,70 mutations / ko mais les résultats de rendement plasmidique très pauvres (moins de 1% par rapport au jour 1; données non présentées) ( Tableau 1). Nous présentons ici un protocole simplifié basé sur la transformation directe plaquage de la cible plasmide sur gélose solide à 37 ° C (figure 1). Cette procédure produit la plus grande fréquence de mutation / cycle de mutagenèse (0,92 mutations / Ko pour d <1000) et facilite grandement l'itération. L'évolution des conditions de culture d'un milieu solide affecte également le spectre de mutation (tableau 2). Mutagenèse ensemencement direct réduit le asymétrie marquée entre les substitutions de paires de bases complémentaires vu en culture liquide (comparer C → T vs G → A et A → G → T vs C). D'autre part, l'ensemencement direct a produit plus indels (de moins de 0,5% à 4%) et diminué le nombre de mutations G → A par 3 fois, conduisant à une surreprésentation de G / C mutations (74%). Globalement, nous pensons que la plus grande simplicité et une efficacité accrue du protocole ensemencement direct présentés ici l'emporte sur les avantages de la gamme un peu plus équilibrée mutation produite par mutagenèse liquide.
Dans le plasmide cible, les mutations générées par notre méthode ne sont pas limités à la séquence cible souhaitée. Cependant, l'évolution du roman activités biochimiques devrait dépendre de mutations dans le gène cible, car elle représente une approche qualitative plutôt que d'un changement quantitatif. Ainsi, en combinant nos mutagenèse plasmide avec le dépistage de mutants sur des plaques de gradient capitalise sur les atouts de notre système (les grandes bibliothèques et de la disponibilité de la sélection) pour l'évolution des nouvelles propriétés biochimiques. D'autres applications de mutagenèse aléatoire telles que l'optimisation des activités enzymatiques existants ou randomisant des domaines spécifiques d'un gène ne nécessitent clonage suivantes mutagenèse aléatoire. Dans ce cas, disposer de la bibliothèque dans un plasmide, par opposition à un produit d'amplification PCR améliore l'efficacité du clonage, en facilitant l'amplification et la restriction.
En somme, nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutantes pour un gène cible donné qui se distingue par sa simplicité et de la diversité des bibliothèques générés. Nous montrons comment cette méthode peut être couplée avec des sélections fonctionnelles pour l'évolution efficace de nouvelles activités biochimiques. En outre, notre in vivo généré les bibliothèques peuvent être facilement clonées, permettant la mutagenèse dirigée ou optimisation des activités existantes.
Ce travail a été soutenu par K08 Prix CA116429-04 de MC et par une subvention du cancer Conquer maintenant (CONCERN) Fondation # 8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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