Method Article
Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.
Die effiziente Erzeugung der genetischen Vielfalt stellt einen unschätzbaren molekulare Werkzeug, um die DNA-Synthese-Label, um einzigartige molekulare Signaturen zu erstellen oder Proteine im Labor entwickelt werden können. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Erzeugung von großen (> 10 11) Mutantenbibliotheken für eine bestimmte Zielsequenz ermöglicht. Diese Methode basiert auf der Replikation eines ColE1 Plasmid-Kodierung der gewünschten Reihenfolge von einer low-fidelity-Variante der DNA-Polymerase I (LF-Pol I). Das Ziel Plasmid wird in eine Mutatorstamm von E. verwandelt coli und verchromt auf festen Medien, wodurch zwischen 0,2 und 1-Mutationen / kb, je nach Lage des Zielgens. Höhere Mutation Frequenzen werden durch Iteration dieses Prozesses der Mutagenese erreicht. Im Vergleich zu alternativen Methoden der Mutagenese, steht unser Protokoll durch seine Einfachheit, da keine Klonen oder PCR beteiligt sind. So ist unsere Methode ideal für Mutationsanalysen Kennzeichnung von Plasmiden oder anderen Pol I-Vorlagen oder um große Teile der Sequenz Raum für die Entwicklung der Tätigkeiten, die nicht in das ursprüngliche Ziel zu erkunden. Die enge räumliche Steuerung, die PCR oder randomisierte Oligonukleotid-basierte Methoden bieten auch durch nachfolgende Klonierung von bestimmten Abschnitten der Bibliothek erreicht werden. Hier bieten wir Protokolle zeigen, wie man einen zufälligen Mutanten-Bibliothek zu erstellen und wie Drogen-Selektionen in E. etablieren coli Mutanten ausstellenden neuen biochemischen Aktivitäten zu identifizieren.
I. Erzeugung einer Zufallszahl Mutant Bibliothek
Pol I vermittelt Einleitung ColE1 Plasmidreplikation (besprochen in (1-3). Unsere Methode der Mutagenese bei Einlegen einer Zielsequenz in einer ColE1 Plasmid neben der Herkunft oder Replikation und Vermehrung in Zellen, die Low-Fidelity DNA-Polymerase I basiert (LF-Pol I). LF-Pol I ist ein mutierter DNA-Polymerase I-Kodierung drei Mutationen, die die Treue der Replikation, nämlich I709N (in Motiv A), A759R (in Motiv B) und D424A (Inaktivierung Korrekturlesen) 4,5 Rückgang . LF-Pol I wird in einer E. coli-Stamm, JS200, dass ein Temperatur-sensitives Allel des Pol I (polA12) (6) hat zum Ausdruck gebracht, so dass LF-Pol I wird die vorherrschende Aktivität bei 37 ° C. Die Replikation der Zielsequenz in polA12 Zellen unter restriktiven Bedingungen führt zur Erzeugung eines zufälligen Mutanten-Bibliothek. Mutagenesis effizienter ist in gesättigten Kulturen 4. Aus Gründen, die noch unklar sind, Mutagenese nicht kontinuierlich, dh die Mutation Frequenz nicht linear mit der Anzahl Generationen einmal die Kultur erreicht Sättigung, auch wenn Zellen dürfen weiter ausbauen in frischen Medien. Daher eine weitere Erhöhung der Mutation Belastung der Bibliothek erfordert iterative Runden von Mutagenese und Plasmid-Rückgewinnung. Hier haben wir Protokolle für LF-Pol I Mutagenese liefern. Beachten Sie, dass die Protokolle hier vorgestellten erheblich worden im Vergleich zu unseren ursprünglichen Beschreibung 4 haben, um Iteration des Prozesses zur Erreichung der gewünschten Mutation Belastung (Abb. 1) zu erleichtern vereinfacht.
Materialien
1. Vor Mutagenese: Vorbereitung von elektro-kompetenten JS200 LF-Pol I-Zellen
2. Mutagenese: Transforming the Zielplasmid
3. Mutagenese: Plasmid Erholung
4. Iteration
5. Anzeige
II. Mutant Screen und Trait Analysis Using Gradient Growth Plates.
Um zu veranschaulichen, wie die große genetische Vielfalt in unseren Bibliotheken, um eine funktionale Auswahl gekoppelt werden kann, hier bieten wir ein Protokoll für die medikamentöse funktionale Auswahl in vivo in E. coli. Diese Methode ist auf Wachstum entlang einer Droge Gradienten auf festen Agar-Basis. Dies ermöglicht die gleichzeitige Charakterisierung von mehreren (bis zu 12) Proben über einen Bereich von Konzentrationen, einen breiteren Dynamikbereich als eine einzige medikamentöse Behandlung. Ein weiterer Vorteil ist, dass die nicht-linearen Auslesen von diesem Assay moderate Unterschiede in Lebensfähigkeit, in einem 2-fachen Bereich Puffer. Somit stellt diese Zytotoxizität-Resistenzassay eine robuste und schnelle Möglichkeit, um Mutantenbibliotheken auszuwählen und die phänotypische Profil der einzelnen Mutanten zu bestimmen. Abb.. 2 zeigt ein Beispiel für jede dieser Verwendungen: Panel A zeigt die Auswahl der einzelnen Mutanten aus einem menschlichen oxidative Demethylase ABH2 Bibliothek. Kolonien, die über dem WT Schwelle für erhöhten Schutz vor Zytotoxizität durch die Methylierungsmittel methyl Methansulfonat (MMS) 7 verursacht ausgewählt. Panel B zeigt ein Beispiel von Gradienten für einzelne Klon Charakterisierung verwendet. Die Höhe der Widerstand gegen die dritte Generation Cephalosporin-Antibiotikum Cefotaxim ist auf einem Agar-Gradienten für WT β-Lactamase und für zwei extended-spectrum-Mutanten, R164H und E104K R164S G267R 4 dargestellt. Beachten Sie, dass abhängig von der Stärke der beobachteten Effekte, mehr als eine einzelne Platte kann für eine angemessene Quantifizierung erforderlich: Während die 0.4mg/ml Gradienten ermöglicht den direkten Vergleich zur Kontrollgruppe Klone, die Beständigkeit der stärksten Mutanten können nur gegründet mit einer höheren Konzentration werdentration von Cefotaxim (4mg/mL).
Materialien
1. Der Bau des Gradienten
2. Stamp Übertragung von Bakterien
3. Imaging und Analyse von Wachstum
III. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Vergleich zwischen Flüssigkeit und direkte Beschichtung Mutagenese Protokolle. Die direkte Beschichtung Mutagenese Protokoll hier (unten) dargestellt ist schneller und benötigt weniger Schritte als unsere ursprüngliche Flüssigkeit Mutagenese-Protokoll (oben). Wenn GFP als Reporter verwendet wird, sind Variationen in der Fluoreszenz-Indikator für die genetische Vielfalt in der Bibliothek vorhanden. In der Regel einen Zyklus von Mutagenese führt zu 12-18% Kolonien mit deutlich erniedrigter Fluoreszenz.
Abbildung 2. Gradient Widerstand Assays. Panel A-Auswahl für eine erhöhte Resistenz gegenüber Methyl-Methansulfonat (MMS). Plasmid-Bibliotheken des menschlichen oxidative Demethylase ABH2 wurden für eine erhöhte Resistenz gegenüber MMS ausgewählt. Zwei solcher Bibliotheken, die zwei und vier Iterationen der Mutagenese-Protokoll sind im Vergleich zu den elterlichen Wildtyp (WT) und dem leeren Vektor (Δ) dargestellt. Die weiße Linie zeigt die Grenze, ab der einzelnen Mutantenkolonien für weitere phänotypische Analyse isoliert wurden. Panel B Cefotaxim Schutz, bezeichnend für extended-spectrum β-Lactamase-Aktivität. R164H und E104K R164H G267R, zwei Mutanten von beta-Lactamase zuvor identifizierten folgende LF- Pol I Mutagenese gekoppelt Aztreonam Auswahl 4 sind auf einem 0.4μg/mL und 4μg/mL Cefotaxim Gradienten gezeigt. Beachten Sie, dass das Wildtyp-β-Lactamase-Enzym keinen Schutz gegenüber Zellen, die einen leeren Vektor Δ verleiht. Daher stellen diese Mutanten die Entwicklung eines neuen biochemischen Aktivität 8,9.
Abbildung 3. Mutation Frequenz als Funktion des Abstandes von ori (d). Die Mutation Frequenz nach einem einzigen Zyklus der direkten Beschichtung Mutagenese ist für 100 bp Abständen in Bezug auf die RNA / DNA-Schalter des ColE1 Replikation gezeigt. Der Bereich zwischen 1600 und 2400 nicht vertreten ist, weil β-Lactamase es sich nicht um neutrale Ziel. Die Punkte über β-Lactamase repräsentieren 200 bp Abständen angesichts der insgesamt niedrigen Frequenz von Mutationen in diesem Bereich. Der Trend (binomischen Gleichung, mit R 2 = 0,41) ist als Linie dargestellt.
Ergänzende Abbildung 1. LF Pol I-haltigen Pol I-Plasmid. Eine Sequence (FASTA-Format). Sequence Informationen zur Bestimmung der geeigneten Restriktionsenzym (s) zu verwenden, wenn die Linearisierung der Pol I Plasmid entweder für Iteration (Erzeugung einer zufälligen Mutation Bibliothek Schritt 4) oder Auslesen (Schritt 5). B Allgemeine Funktionen und Restriktionskarte des Plasmids. Die Lage des pSC101 Replikationsursprung, die Chloramphenicol-Resistenz-Marker (CAT) und LF-Pol I-Gen vorgestellt werden. Die Lage der einzelnen Restriktionsstellen ist gut ausgeschildert.
Bibliothek | Direkte Plating | Flüssigkeit (1 Tag) | Flüssigkeit (3 Tage) | |
Mutationen (#) | 95 | 40 | 142 | |
Klone sequenziert | 288 | 96 | 190 | |
Insgesamt Coverage (bp) | 182.000 | 102.000 | 213.000 | |
Mutation freq (x10 3 bp) | 0,52 | 0,39 | 0,67 | |
Freq d <1000 (x10 3 bp) | 0,92 | 0,41 | 0,70 |
Tabelle 1. Mutation Frequenzen Frequenzen (ausgedrückt als Anzahl der Mutationen / bp) für d <1000, also innerhalb der 1000 bp neben dem RNA / DNA-Schalter für drei Mutagenese Protokolle:. Direkten Beschichtung, Flüssigkeitssättigung (1 Tag), und flüssige hypersaturation ( 3 Tage).
Direkte Plating | Flüssigkeit | ||
Mutationen (#) | 95 | 182 | |
Spectrum (%) | |||
A bis G | A bis G | 6,3 | 19,2 |
T zu C | 4,2 | 3,8 | |
C zu T | G bis A | 27,4 | 13,7 |
C zu T | 35,8 | 35,2 | |
A bis T | A bis T | 5,3 | 8,2 |
T zu A | 5,3 | 7,1 | |
T zu G | T zu G | 1,1 | 1,1 |
A bis C | 0,0 | 2,2 | |
G zu T | G zu T | 1,1 | 2,7 |
C nach A | 2,1 | 2,7 | |
C bis G | C bis G | 2,1 | 1,1 |
G zu C | 5,3 | 2,7 | |
Indels | Ins | 3,2 | 0,0 |
Del | 1,1 | 0,0 | |
A bis N | 11,6 | 29,7 | |
G bis N | 33,7 | 19,2 | |
T zu N | 10,5 | 12,1 | |
C zu N | 40,0 | 39,0 | |
Ts | 73,7 | 72,0 | |
Fernseher | 22,1 | 28,0 | |
Indels | 4,2 | 0 |
Tabelle 2. Metrics der Mutation für die direkte Beschichtung und flüssige Mutagenese. Die Tabelle zeigt die Anzahl der beobachteten Mutationen (in Reihe) und die Mutation Spektrum (in%) nach einem einzigen Zyklus der Mutagenese. Das Spektrum ist nach unten durch komplementäre Paare gebrochen, von Nukleotid-Änderungen und durch die Art der Mutation.
Dieser Artikel stellt eine Mutagenese-Protokoll, das die Erzeugung von großen zufälligen Mutanten-Bibliotheken ermöglicht, ohne die Notwendigkeit zum Klonen oder PCR. Diese Methode basiert auf fehleranfällige Replikation eines Plasmids kodierend für eine Sequenz von Interesse basiert. In der Theorie Mutationen weitgehend sollten von 100-300 bp unmittelbar hinter dem RNA / DNA-Schalter befindet eingeschränkt werden, produziert von der Größe des Führers Strang Intermediat durch Pol I 2,10. Wir fanden, dass unter den Bedingungen in diesem Protokoll vorgestellt, Pol I-Mutationen in der ganzen Plasmid auftreten, obwohl abnehmende Häufigkeit der Entfernung aus dem Plasmid ori erhöht (Abbildung 3). Diese Erkenntnis impliziert, dass der Übergang oder "switch" von Pol I zu Pol III während ColE1 Plasmidreplikation viel langsamer als bisher berichtet wird, zumindest unter unseren experimentellen Bedingungen 2, und stimmt mit früheren Studien, in denen eine funktionelle Redundanz zwischen Pol I und Pol III 11.
Unsere ursprüngliche Protokoll beschriebene Mutagenese in flüssigen Kulturen (4). Dieses Protokoll liefert 0,41 Mutationen / kb für d <1000, also innerhalb der 1000 bp neben dem RNA / DNA-Schalter (Tabelle 1). Hypersaturation, indem man die Flüssigkeit Kultur in den Shaker für 3 Tage ohne den Zusatz von frischen Medien stellt sich die Mutationsrate auf 0,70 Mutationen / kb aber die Ergebnisse in einem sehr schlechten Plasmidausbeute (weniger als 1% im Vergleich zu Tag 1; Daten nicht gezeigt) ( Tabelle 1). Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Protokoll direkt plating die Umwandlung der Zielplasmid auf Agar bei 37 ° C auf (Abbildung 1). Dieses Verfahren produziert die größte Häufigkeit der Mutation / Zyklus von Mutagenese (0,92 Mutationen / kb für d <1000) und erleichtert Iteration. Ändern Kulturbedingungen auf festen Medien wirkt sich auch auf die Mutation Spektrum (Tabelle 2). Direkte Beschichtung Mutagenese reduziert die deutliche Asymmetrie zwischen komplementären Basenpaar-Substitutionen in flüssiger Kultur gesehen (vgl. C → T vs G → A und A → G vs T → C). Auf der anderen Seite, produziert direkte Beschichtung mehr indels (von weniger als 0,5% bis 4%) und verringerte sich die Zahl der A → G Mutationen durch 3-fache, was zu einer Überrepräsentation von G / C-Mutationen (74%). Insgesamt glauben wir, dass der größere Einfachheit und erhöhte Effizienz der direkten Beschichtung Protokoll hier präsentierten die Vorteile der etwas ausgeglichener Mutationsspektrum mit flüssigem Mutagenese erzeugt überwiegt.
Im Rahmen des Ziels Plasmid, sind die Mutationen, die durch unsere Methode generiert nicht zu dem gewünschten Ziel-Sequenz beschränkt. Allerdings sollte die Entwicklung von neuartigen biochemischen Aktivitäten abhängig sein Mutationen innerhalb des Zielgens, da es eine eher qualitative als quantitative Veränderung darstellt. So kombinieren wir unsere Plasmid Mutagenese mit Screening von Mutanten auf Gradienten-Platten nutzt die Stärken unseres Systems (große Bibliotheken und Verfügbarkeit der Auswahl) für die Entwicklung von neuen biochemischen Eigenschaften. Weitere Anwendungen von Zufallsmutagenese wie die Optimierung der bestehenden enzymatischen Aktivitäten oder randomizing bestimmte Bereiche eines Gens erfordern Klonen folgenden Zufallsmutagenese. In diesem Fall haben die Bibliothek in ein Plasmid zu einer PCR-Amplifikation Produkt Gegensatz verbessert die Effizienz des Klonens durch die Erleichterung Verstärkung und Beschränkung.
In Summe zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für einen bestimmten Zielgens, das sich durch seine Einfachheit und für die Vielfalt der Bibliotheken generiert erstellen. Wir zeigen, wie diese Methode mit funktionellen Selektionen für die effiziente Entwicklung von neuen biochemischen Aktivitäten gekoppelt werden kann. Darüber hinaus können unsere in vivo generierten Bibliotheken werden einfach geklont, so dass ortsspezifische Mutagenese oder Optimierung der bestehenden Aktivitäten.
Diese Arbeit wurde von K08 Auszeichnung CA116429-04 bis MC und durch einen Zuschuss aus dem Conquer Cancer Now (Sorge) Stiftung # 8501 unterstützt
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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