Method Article
Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.
La generazione efficiente della diversità genetica rappresenta un prezioso strumento molecolare che può essere utilizzato per etichettare la sintesi del DNA, per creare uniche firme molecolari, o per evolvere le proteine in laboratorio. Qui, vi presentiamo un protocollo che consente la generazione di grandi dimensioni (> 10 11) biblioteche mutante per una sequenza bersaglio determinato. Questo metodo si basa sulla replica di un plasmide codifica ColE1 sequenza desiderata da una bassa fedeltà variante della DNA polimerasi I (LF-Pol I). L'obiettivo plasmide si trasforma in un ceppo di E. mutatore coli e placcato su un supporto solido, producendo tra 0,2 e 1 mutazioni / kb, a seconda della posizione del gene bersaglio. Frequenze di mutazione superiori si ottengono iterando questo processo di mutagenesi. Rispetto a metodi alternativi di mutagenesi, il nostro protocollo si distingue per la sua semplicità, in quanto non la clonazione o PCR sono coinvolti. Così, il nostro metodo è ideale per l'etichettatura mutazionali di plasmidi o altri modelli io Pol o per esplorare ampie sezioni di sequenza spazio per l'evoluzione delle attività non presenti nel target originale. Lo stretto controllo dello spazio che la PCR o randomizzati oligonucleotide a base di offrire metodi possono anche essere ottenuto attraverso la clonazione di successive specifiche sezioni della biblioteca. Qui forniamo protocolli che mostra come creare una libreria casuale mutante e le modalità per stabilire farmaco a base di selezioni in E. coli per identificare mutanti espositrici nuove attività biochimiche.
Generazione I. di una biblioteca casuale Mutant
Pol I media di iniziazione ColE1 replica plasmide (recensione a (1-3). Il nostro metodo di mutagenesi si basa sul posizionamento di una sequenza target in un plasmide ColE1 adiacente l'origine o la replicazione e la propagazione in cellule che esprimono a bassa fedeltà DNA polimerasi I (LF-Pol I). LF-Pol I è una DNA polimerasi mutante ho codifica tre mutazioni che diminuiscono la fedeltà della replicazione, cioè I709N (motivo in A), A759R (motivo in B) e D424A (inattivando correzione di bozze) 4,5 . LF-Pol I è espresso in un ceppo di E. coli, JS200, che ha una temperatura-sensibili allele di Pol I (polA12) (6) in modo che LF-Pol I diventa l'attività predominante a 37 ° C. La replica del sequenza bersaglio in polA12 cellule in condizioni restrittive risultati nella generazione di una libreria casuale mutante. Mutagenesi è più efficiente nelle culture saturi 4. Per motivi che sono ancora poco chiare, mutagenesi non è continua, cioè la frequenza di mutazione non aumenta linearmente con il numero di generazioni, una volta che la coltura raggiunga la saturazione, anche se le cellule sono autorizzati a espandersi ulteriormente in mezzi freschi. conseguenza, aumentando ulteriormente il carico di mutazione della biblioteca richiede iterativo giri di mutagenesi e di recupero plasmide. Qui forniamo protocolli per la LF-Pol mutagenesi io. Si noti che i protocolli qui presentati sono stati notevolmente semplificati rispetto ai nostri 4 descrizione originale al fine di facilitare iterazione del processo per il raggiungimento del carico mutazione desiderata (Fig. 1).
Materiale
1. Prima di Mutagenesi: Preparazione di elettro-competenti JS200 LF-Pol cellule I
2. Mutagenesi: Trasformare l'obiettivo plasmide
3. Mutagenesi: recupero plasmidi
4. Iterazione
5. Lettura
II. Schermo mutanti e analisi Trait utilizzando piastre di crescita sfumatura.
Al fine di illustrare come la grande diversità genetica presente nelle nostre biblioteche può essere accoppiato ad una selezione funzionale, qui mettiamo a disposizione un protocollo per la selezione funzionale a base di droga in vivo in E. coli. Questo metodo si basa sulla crescita lungo un gradiente di droga su agar solido. Questo permette la caratterizzazione simultanea di più campioni (fino a 12) su una gamma di concentrazioni, fornendo una gamma dinamica più ampia rispetto a un trattamento singolo farmaco. Un altro vantaggio è che la non-lineare di lettura di questo saggio buffer differenze moderata della redditività, all'interno di una gamma di 2 volte. Così, questo citotossicità resistenza test fornisce un mezzo robusto e rapido per selezionare le biblioteche mutante e di determinare il profilo del fenotipo dei mutanti singoli. Fig. 2 mostra un esempio di ciascuno di questi usi: pannello mostra una selezione di mutanti singoli da un essere umano demetilasi ossidativo ABH2 biblioteca. Colonie in crescita al di sopra della soglia di WT sono selezionati per una maggiore protezione da citotossicità causata dalla metilazione solfonato metano metilico agente (MMS) 7. Pannello B mostra un esempio di sfumature utilizzate per la caratterizzazione clone individuali. Il livello di resistenza alla terza generazione di cefalosporine cefotaxime antibiotico è indicato su una pendenza agar per WT β-lattamasi e per due a spettro esteso mutanti, R164H e E104K R164S G267R 4. Si noti che a seconda della forza degli effetti osservati, più di un piatto unico può essere necessario per la quantificazione adeguata: mentre il gradiente 0.4mg/ml permette di confronto diretto con i cloni di controllo, il livello di resistenza dei mutanti più potenti possono solo essere stabilita utilizzando una concentrazione più altastrazione di cefotaxime (4mg/ml).
Materiale
1. Costruzione del gradiente
2. Timbro trasferimento di batteri
3. Imaging e analisi della crescita
III. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Confronto tra protocolli di placcatura liquido e diretto mutagenesi. Il protocollo di mutagenesi diretta placcatura qui presentati (in basso) è più veloce e richiede meno passaggi rispetto al nostro protocollo originale mutagenesi liquido (in alto). Quando GFP è usato come un reporter, variazioni di fluorescenza sono indicativi della diversità genetica presente in biblioteca. Tipicamente, un ciclo di risultati mutagenesi nel 12-18% colonie con livelli sensibilmente diminuito di fluorescenza.
Figura 2. Gradiente di resistenza saggi. Un pannello di selezione per una maggiore resistenza al metil-metanosolfonato (MMS). Librerie plasmidi della demetilasi ABH2 umano ossidativo sono stati selezionati per una maggiore resistenza a MMS. Due biblioteche quali rappresentano due e quattro iterazioni del protocollo di mutagenesi sono indicati rispetto al tipo parentale selvatica (WT) e il vettore vuoto (Δ). La linea bianca indica la soglia oltre la quale sono state isolate singole colonie mutanti per ulteriori analisi fenotipica. Pannello B protezione Cefotaxime, indicativo di spettro esteso β-lattamasi attività. R164H e E104K R164H G267R, due mutanti di beta-lattamasi precedentemente individuati dopo LF- Pol mutagenesi ho accoppiato alla selezione aztreonam 4, vengono visualizzati su un 0.4μg/mL e un gradiente 4μg/mL cefotaxime. Si noti che il wild-type β-lattamasi enzima conferisce alcuna protezione rispetto a cellule che esprimono un vettore vuoto, Δ. Pertanto, questi mutanti rappresentano l'evoluzione di una nuova attività biochimica 8,9.
Figura 3. Frequenza di mutazione in funzione della distanza dalla ori (d). La frequenza di mutazione a seguito di un singolo ciclo di mutagenesi placcatura diretta viene mostrato per intervalli di 100 bp rispetto al DNA / RNA interruttore della provenienza ColE1 di replica. L'area tra 1600 e 2400 non è rappresentato perché β-lattamasi non rappresenta un obiettivo neutrale. I punti al di là di β-lattamasi rappresentano intervalli di 200 bp, data la frequenza complessivo della mutazione in questo settore. La tendenza (equazione binomiale, con un R 2 = 0.41) è mostrata come una linea.
Supplementare Figura 1. Pol LF I-Pol contenenti I plasmide. Una sequenza (in formato FASTA). Informazioni di sequenza per determinare l'enzima di restrizione appropriato (s) da utilizzare durante la linearizzazione I Pol plasmide sia per iterazione (generazione di un passaggio casuale biblioteca mutazione 4) o lettura (punto 5). B Caratteristiche generali e mappa di restrizione del plasmide. Il posizione dell'origine pSC101 di replica, il marcatore di resistenza cloramfenicolo (CAT) e LF-Pol gene io sono presentati. La posizione dei singoli siti di restrizione è indicato pure.
Biblioteca | Placcatura diretta | Liquido (1 giorno) | Liquido (3 giorni) | |
Mutazioni (#) | 95 | 40 | 142 | |
Cloni sequenziati | 288 | 96 | 190 | |
Copertura totale (bp) | 182.000 | 102.000 | 213.000 | |
Freq mutazione (x10 3 bp) | 0,52 | 0,39 | 0,67 | |
Freq d <1000 (x10 3 bp) | 0,92 | 0,41 | 0,70 |
Tabella 1. Frequenze di mutazione Frequenze (espresso come # di mutazioni / bp) per d <1000, cioè entro il 1000 bp adiacente al DNA / RNA interruttore, per tre protocolli di mutagenesi:. Placcatura diretta, la saturazione del liquido (1 giorno), e hypersaturation liquido ( 3 giorni).
Placcatura diretta | Liquido | ||
Mutazioni (#) | 95 | 182 | |
Spectrum (%) | |||
A a G | A a G | 6,3 | 19,2 |
T a C | 4,2 | 3,8 | |
C a T | G ad A | 27,4 | 13,7 |
C a T | 35,8 | 35,2 | |
Dalla A alla T | Dalla A alla T | 5,3 | 8,2 |
T ad A | 5,3 | 7,1 | |
T a G | T a G | 1,1 | 1,1 |
Dalla A alla C | 0,0 | 2,2 | |
G a T | G a T | 1,1 | 2,7 |
C alla A | 2,1 | 2,7 | |
C a G | C a G | 2,1 | 1,1 |
G a C | 5,3 | 2,7 | |
Indel | Ins | 3,2 | 0,0 |
Del | 1,1 | 0,0 | |
Dalla A alla N | 11,6 | 29,7 | |
G a N | 33,7 | 19,2 | |
T per N | 10,5 | 12,1 | |
C a N | 40,0 | 39,0 | |
Ts | 73,7 | 72,0 | |
TV | 22,1 | 28,0 | |
Indel | 4,2 | 0 |
Tabella 2. Metriche di mutazione per la placcatura diretta e mutagenesi liquido. La tabella presenta il numero di mutazioni osservate (in numero) e lo spettro di mutazione (in%) a seguito di un singolo ciclo di mutagenesi. Lo spettro è suddiviso per coppie complementari, dai cambiamenti nucleotide, e dal tipo di mutazione.
Questo articolo presenta un protocollo di mutagenesi che consente la generazione di grandi librerie casuali mutante senza la necessità di clonazione o PCR. Questo metodo è basato sul soggetto a errori di replica di un plasmide codifica di una sequenza di interesse. In teoria, le mutazioni devono essere in gran parte limitato ai 100-300 pb situato immediatamente a valle del DNA / RNA interruttore, la dimensione del leader filo intermedia prodotta da Pol I 2,10. Abbiamo trovato che, nelle condizioni presentate in questo protocollo, Pol mutazioni ho verificarsi in tutto il plasmide, anche se diminuisce la frequenza come la distanza dagli aumenti plasmide ori (Figura 3). Questa scoperta implica che la transizione o "switch" da Pol I, Pol III ColE1 durante la replicazione del plasmide è molto più graduale di quanto riportato in precedenza, almeno nelle nostre condizioni sperimentali 2, e concorda con studi precedenti suggeriscono una ridondanza funzionale tra Pol I e Pol III 11.
Il nostro protocollo originale descritta mutagenesi in colture liquide (4). Questo protocollo produce mutazioni 0,41 / kb per d <1000, cioè entro il 1000 bp adiacente al DNA / RNA interruttore (Tabella 1). Hypersaturation lasciando la coltura liquida nello shaker per 3 giorni senza l'aggiunta di eventuali nuovi mezzi di comunicazione aumenta la frequenza di mutazione mutazioni a 0,70 / kb, ma si traduce in pessime resa plasmide (meno dell'1% rispetto al giorno 1; dati non riportati) ( Tabella 1). Qui vi presentiamo un protocollo semplificato basato sulla placcatura direttamente la trasformazione del target plasmide su agar solido a 37 ° C (Figura 1). Questo procedimento produce la maggior frequenza di mutazione / ciclo di mutagenesi (0,92 mutazioni / kb per d <1000) e facilita notevolmente l'iterazione. Modifica condizioni di coltura di terreni solidi colpisce anche lo spettro di mutazione (Tabella 2). Mutagenesi placcatura diretta riduce la marcata asimmetria tra sostituzioni di coppie di basi complementari visto in coltura liquida (confrontare C → T vs G → A e A → G vs T → C). D'altra parte, la placcatura diretto prodotto più indel (da meno 0,5% al 4%) e diminuito il numero di mutazioni G → A per 3 volte, portando ad una sovrarappresentazione di G / C mutazioni (74%). Nel complesso, crediamo che la maggiore semplicità e maggiore efficienza del protocollo placcatura diretta qui presentati supera i benefici dello spettro di mutazione leggermente più equilibrata prodotto da mutagenesi liquido.
All'interno dell'obiettivo plasmide, le mutazioni generate dal nostro metodo non si limitano alla sequenza target desiderato. Tuttavia, l'evoluzione del romanzo di attività biochimiche dovrebbe dipendere da mutazioni nel gene bersaglio, in quanto rappresenta una qualitativa piuttosto che un cambiamento quantitativo. Così, unendo le nostre mutagenesi plasmide con proiezione di mutanti su piastre gradiente sfrutta i punti di forza del nostro sistema (librerie di grandi dimensioni e disponibilità di selezione) per l'evoluzione di nuove proprietà biochimiche. Altre applicazioni di mutagenesi casuale come ottimizzare gli attuali attività enzimatiche o randomizing aree specifiche di un gene hanno bisogno di clonazione seguenti mutagenesi casuale. In questo caso, essendo la biblioteca in un plasmide in contrapposizione ad un prodotto di amplificazione di PCR migliora l'efficienza della clonazione, facilitando l'amplificazione e restrizione.
In sintesi, si dimostra un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante di un gene bersaglio, dato che si distingue per la sua semplicità e per la diversità delle librerie generate. Mostriamo come questo metodo può essere accoppiato con le selezioni per l'evoluzione funzionale efficiente di nuove attività biochimiche. Inoltre, il nostro in vivo generata librerie possono essere facilmente clonati, permettendo mutagenesi sito-specifica o di ottimizzazione delle attività già esistenti.
Questo lavoro è stato sostenuto da CA116429 premio K08-04 a MC e da una sovvenzione da parte del Conquer Cancer Now (preoccupazione) fondazione # 8501
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
carbenicillin | CellGro | 46100R6 | 0.1mg/ml final | |
tetracycline | Fisher | BP7640 | 0.05mg/ml final | |
chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final | |
LB Agar Miller | Fisher | BP1425 | ||
LB Broth Miller | Difco | 244620 | ||
Soft Agar | Difco | 214580 | Made in house | |
Acridine Orange | Sigma | A38401-1 | ||
Antifoam B emulsion | Sigma | A5757 | ||
Glycerol | Acros | 332030025 | ||
100x100x15mm sq dish | Fisher | 0875711A | ||
100mm rnd dish | Fisher | 0875712A | ||
Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | ||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
Electroporator 2510 | Eppendorf | |||
2mm gap tubes | MolBioproducts | 5520 | ||
Zippy mini prep kit | Zymo | D4020 |
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