JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים במאמר זה פלטפורמה חדשני מתיחה שיכול לשמש כדי לחקור את תגובות תא בודדות לעיוות מכאנית biaxial איזוטרופי מורכב ולכמת את התכונות מכאניות של רקמות ביולוגיות.

Abstract

כלים המאפשרים היישום של כוחות מכאניים לתאים ורקמות או שיכולים לכמת את התכונות מכאניות של רקמות ביולוגיות תרמו באופן משמעותי להבנה של mechanobiology הבסיסי. טכניקות אלה היו בשימוש נרחב על מנת להדגים כיצד התפרצות וההתקדמות של מחלות שונות מושפעות במידה רבה על ידי רמזים מכאניים. מאמר זה מציג פלטפורמת biaxial רב תפקודית מתיחה (BAXS) שגם יכול מכניים לעורר תאים בודדים או לכמת את הנוקשות מכאניות של רקמות. פלטפורמת BAXS מורכבת מארבעה מנועים סליל קול שניתן לשלוט באופן עצמאי. יכולים להיות מתורבת תאים בודדים על מצע גמיש שיכול להיות מחובר למנועים המאפשרים אחד כדי לחשוף את התאים לשדות זן מורכבים, דינמיים, ומרחבית שונה. לעומת זאת, על ידי שילוב של תא כוח עומס, אפשר גם לכמת את התכונות מכאניות של רקמות עיקריות כפי שהם נחשפים למחזורי עיוות.בשני המקרים, סט נכון של מלחציים חייב להיות מתוכנן ורכוב על מנועים פלטפורמת BAXS כדי להחזיק את המצע גמיש או הרקמות של עניין בתוקף. פלטפורמת BAXS יכולה להיות מותקנת על מיקרוסקופ הפוכה לבצע אור מסור בו זמנית ו / או דימות פלואורסצנטי כדי לבחון את התגובה המבנית או ביוכימי של המדגם במהלך ניסויי מתיחה. מאמר זה מספק פרטים ניסיוניים של העיצוב ושימוש בפלטפורמת BAXS ומציג תוצאות עבור תא בודד ומחקרי רקמה כולה. פלטפורמת BAXS שימשה למדידת העיוות של גרעינים בתאים והיצמדות למנגנון עכבר אחת בתגובה למצע מתח ולמדוד את הנוקשות של aortas עכבר הבודד. פלטפורמת BAXS היא כלי תכליתי שיכול להיות משולב עם microscopies האופטי השונים על מנת לספק תובנות mechanobiological רומן ברמות המשנה הסלולר, סלולארי וכל הרקמות.

Introduction

Microenvironment המכני משחק תפקיד חשוב בפונקציות רבות תא, כגון התפשטות, הגירה, ובידול, שיש לו השפעה עמוקה בפיתוח והומאוסטזיס של רקמות וגם במחלות 1-6. במהלך השנים, מספר רב של כלים ניסיוניים כבר בשימוש כדי לעורר מכאני תאים או רקמות ולמדוד תכונות מכאניות של רקמות ביולוגיות, במטרה להגביר את ההבנה של mechanobiology הבסיסי שלנו ולומד את תחילת התקדמות של מחלות 6-17. עם זאת, יש לעתים קרובות מסתמך על מספר התקני ניסויים שונים על מנת להשיג את מטרותיו של מחקר מסוים. מאמר זה מציג פלטפורמה אחת, רב תפקודית, biaxial מתיחה (BAXS) המאפשרת למחקרים הבודקים את התפקיד שתכונות מכאניות וכוחות מכאניים לשחק בביולוגיה במשנה הסלולר לסולמות אורך רקמה כולה. פלטפורמת BAXS לא רק מאפשרת לquantification של תכונות מכאניות של רקמות מבודדות, אלא גם מקל על היכולת ליישם את שדות זן פשוטים, מורכבים, ודינמיים לתאי חיים כדי להבין את התגובות שלהם למתיחה המתרחשת בגוף חי. פלטפורמת BAXS גם שומרת על היכולת לבצע מיקרוסקופיה לחיות תאים במהלך בדיקה מכאנית והפרעות בתאים וברקמות.

פלטפורמת BAXS היא מנגנון שהותקן בם ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של עיוות מצע ברמה התאית ולבצע בדיקות מתיחה ברקמות ביולוגיות (איור 1 א). דוד אלומיניום היה מפוברק כדי להכיל מנה 10 ס"מ פטרי סטנדרטי ולתחזק פתרונות פיסיולוגיים כלשהי על 37 מעלות צלזיוס באמצעות בקר טמפרטורה ותנורי Kapton (איור 1). פלטפורמת BAXS זה יכול להיות משולב על גבי לעומת שלב הפוך ו / או מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומאפשרת הדמיה בו זמנית (תרשים 1C).בקיצור, פלטפורמת BAXS מורכבת מארבעת מנועים הסליל ליניארי של אשר החלקים הנעים הם רכובים על שקופיות נושאת תנועה ליניארית כדור הזעיר בכיוון לאורך שני צירים מאונכים (1D איור). שלב מיצוב יניארי הוא רכוב לכל אחד מארבעת מנועים, כדי לאפשר תנועה אנכית של מערכת ההידוק שישמש (איור 1E). המיקום של כל מנוע מנוטר על ידי מקודד אופטי עם רזולוציה של 500 ננומטר (איור 1F). כל ארבעה מנועים באופן עצמאי נשלטים עם בקר תנועת העסקת משוב מקודד אופטי כדי לבצע פקודות תנועה (איור 1G). ממשק LabVIEW מספק שליטה מלאה על עוצמת התזוזה, מהירות ותאוצה של כל מנוע על מנת ליצור עיוות לחלוטין להתאמה אישית, סטטית ודינמית, של התאים או דגימות רקמה.

הטכניקה המשמשת כדי לגרום לעיוות בתאים מושגת על ידי פשוט allowinתאים גרם לדבוק בתקיפות למצע גמיש ושקוף ולאחר מכן מתיחות מצע זה באמצעות ארבעה מנועים של פלטפורמת BAXS. פלטפורמת BAXS מאפשרת הרכבה של כל קבוצה מותאמת במיוחד מלחציים לצרף את המצע על מנועים סליל קול. לצורך כך, עיצבנו סט של מהדק שאליו מצע גמיש ושקוף, עשוי polydimethylsiloxane (PDMS), יכול להיות מחובר (איורים 2A-C ו איור 3). כמו מלחציים יהיו חשופים לפתרונות פיסיולוגיים, כל החלקים היו במכונה מנירוסטה כדי לאפשר לעיקור. מלחציים אלה תוכננו בקפידה כדי להביא את המצע הקרוב ככל האפשר למטרת מיקרוסקופ כדי לשפר את איכות תמונה, תוך מזעור הלחץ על המצע במהלך המתיחה (איור 2 ד).

גם אותה פלטפורמת BAXS יכולה לשמש כדי לכמת את הנוקשות של דגימות רקמה קטנות, תוך שימוש בסט מתאים של מלחציים עם ADAPטד תומך לדגימות הרקמה ותא מטען כדי לפקח על כוחות. ניתן לנקוט במספר גישות להר רקמות למנועי פלטפורמת BAXS; במקרה זה סיכות minutiens החרקים הנירוסטה יכולות להתחבר דרך הפתח של רקמות כלי דם על מנת לבצע בדיקות מתיחה (איורים 4 א-B). לחלופין, לרקמות עבות ללא פתיחה טבעית, יכולים להיות שנערכו קצות רקמות בעמדה עם מלחציים מחוברים למנועי סליל קול או דבוקים לשקופיות זכוכית קטנות עם דבק ביולוגי ומחוברים למנועים עם מהדק. על מנת לבצע מתיחה בדיקות תא עומס מיניאטורי נדרש ויכול להיות משולב בקלות על מנועים פלטפורמת BAXS ומשמש למדידת הכוח הפועל על הרקמות במהלך מחזור (איור 4C) מתיחה. כפלטפורמת BAXS מורכבת מארבעה מנועים, את ההקדמה של תא עומס שני מאפשרת לבצע בדיקות מתיחים לאורך שני כיוונים מאונך. יכולת זו מאפשרת לאדם quantify הנוקשות מכאניות של רקמה אחת לאורך שני כיוונים ניצבת במהלך אותו הניסוי.

חשוב לציין, בכל התצורות, התאים או דגימות רקמה של העניין תמיד נשמרו באמבט בטמפרטורה מבוקרת, כי הוא נגיש למשתמש. יכולת זו מאפשרת להקדמה של סוכנים תרופתיים במהלך מדגם מתיחה על מנת לבחון את התגובה הזמנית של המדגם. בנוסף, כציר האופטי של המיקרוסקופ ההפוך נותר בלא הפרעה, כל הצורות של מיקרוסקופיה עדיין זמינות למשתמש. לבסוף, כמו בכל ארבעת מנועים של פלטפורמת BAXS הם בלתי תלויים זה אפשרי ליישם את שדות זן מאוד להגדרה למדגם של עניין. בvivo תאים ורקמות חשופים למורכב ואיזוטרופי מתיחה שיכולה להיות הולם יותר חיקה בפלטפורמה זו בניגוד ל7,13,15,18,19 uniaxial מסורתי מתיחת פלטפורמה. יתר על כן, מאפיינים הפיזייםשל שדה המתח ניתן לשנות על לטוס במהלך ניסוי. יכולות אלו מאפשרות למשתמש לבחון את התגובה התאית ורקמות ברמה למספר רחב של המורכב ביותר, איזוטרופי, באופן זמני, ושדות מתח מרחבית שונים. מאמר זה מתאר את היתרונות ומגבלות של פלטפורמת BAXS כמו גם העיצוב שלו, עקרונות פעולה, ואת פרטי ניסיוני לתא בודד וניסויים רקמה כולה.

figure-introduction-5097
איור 1. סקירה כללית של פלטפורמת BAXS. א) להציג לראש פלטפורמת BAXS מראה את ארבעת מנועים סליל קול. ב ') תמונה מפורטת של דוד צלחת פטרי משמש כדי לשמור על תאים ורקמות ב37 ° C. C) הפלטפורמה יכולה להיות מותקנת על מיקרוסקופ הפוכה לבצע-live הדמיה תא במהלך ניסויי מתיחה.ד) תמונה מפורטת של מנוע סליל קול; תמונת החלק הנע של הפלטפורמה. ה) מפורטת של שלב המיקום ליניארי ומאפשר תזוזה אנכית של מערכות הידוק תמונה מפורטת. F) של המקודד האופטי המספק עמדה של המנוע בזמן אמת לבקר התנועה.) תמונה מפורטת G של בקר התנועה המראה את ארבע כניסות מקודד אופטיות ותפוקות כוח לארבעה מנועים סליל קול.

figure-introduction-6006
איור 2. הידוק מערכת לניסויי תא מתיחה. תמונות א.ב.) מציגים את הפרטים של מלחציים משמשים לצרף את מצע PDMS למנועי סליל קול למתיחה. C) המצע כרוך סביב החלק הגלילי של המהדק עם featur עיגונהes יושב לתוך החריץ בחלק העליון. אז המצע הוא מאובטח באמצעות setscrews כי לדחוף את המצע / עיגון תכונות לתוך החריץ העליון. D איור) של פלטפורמת BAXS עם מלחציים מחזיקים המצע במקום. הבלעה מראה תצוגה מפורטת של המצע עם התאים קשורים אליו יושבים בדיוק מעל להחליק את מכסה ואובייקטיבי מיקרוסקופ.

figure-introduction-6759
איור 3. ביל של חומרים של מערכת ההידוק שלה הקרום ו. שרטוטים מראים את הממדים של החלקים העיקריים משולבים לפלטפורמת biaxial לבצע ניסויי תא מתיחה.

figure-introduction-7137
איור 4. אקסשפע של מערכת הידוק להערכת נוקשות של כלי קליבר קטנים תמונות מפורטות. א.ב.) של מערכת הידוק שימוש כדי לגרום לעיוות באב העורקים עכבר בקוטר 1 מ"מ. סיכות נירוסטה עוצבו בקפידה למשולשים פתוחים על מנת לאפשר את הכלי כדי להחליק על שני סיכות איור. C) של פלטפורמת BAXS עם מלחציים מחזיקים את הכלי ותא עומס המחובר בין המנוע הקבוע ומהדק את השמאל. הבלעה מראה עליונה תצוגה מפורטת של הכלי רכוב על הסיכות.

Protocol

1. עיוות מכאנית של תאים בודדים

  1. המצאה של מצע PDMS עם חרוזי ניאון מוטבעים
    לפני הייצור של המצע, זעירים מניאון במי פתרון הוא resuspended בisopropanol כדי לשפר את ערבוב חרוז בPDMS בשל האופי הידרופובי שלה.
    1. פיפטה 500 μl של microspheres ניאון לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ו צנטריפוגות ב XG 16,200 עבור 10 דקות.
    2. בטל supernatant ולהוסיף 500 μl של isopropanol אחריו עם 5 דקות של vortexing. שים את הבקבוקון בצד לילה בחושך על מנת לאפשר לכל חלקיקים גדולים אגרגטים למשקעים.
    3. למחרת בבוקר, בזהירות להסיר את supernatant לבקבוקון microcentrifuge נקי. פתרון חרוז זה יכול לשמש כדי להמציא יותר מ -5 מצעים. הערה: הפתרון חרוז ימשיך משקעים במשך 3 הימים הבאים. להיות זהיר, כדי למנוע resuspending גלולה.
    4. יוצקים 0.5 גרם סוכן הריפוי של הניתןעם ערכת PDMS בבקבוקון microcentrifuge 1.5 מיליליטר באמצעות איזון מדעי. על ידי צעדים רצופים, להוסיף סך של 90 μl של חרוזים (בשישה 15 נוספו μl), vortexing דקות 1 בין כל תוספת. מניח בצד.
    5. שוקל 10 גרם של PDMS ולערבב במשך דקות לפחות 12 עם g 0.5 סוכן הריפוי בתוספת חרוזי ניאון של.
    6. לפברק SU-8 2050 עובש בצורת צלב באמצעות טכניקות photolithography סטנדרטיות הבאות הוראות יצרן. יש העובש משמש לגובה של 320 מיקרומטר ושטח של 13.4 סנטימטר 2 (איור 3). העובש יכול להכיל 428 μl או 440 מ"ג של PDMS.
    7. יוצקים 400 מ"ג של PDMS עם חרוזים בעובש בצורת צלב בעזרת פיפטה העברה ולרפא לשעה 2 ב 80 ° C. לאחר הריפוי, לקלף את המצע מהתבנית (איור 5 א). המצע יכול להיות כל הזמן בצלחת פטרי בטמפרטורת חדר למשך 2 שבועות בלי להראות שינויים משמעותיים בתכונות מכאניות שלה.
    8. יוצקים טיפות של PDMS (ריפוי סוכן: PDMS עם יחס של 1:20) בצלחת פטרי עם גודל סופי של כ -4 מ"מ קוטר ולרפא אותם במהופך לשעה 2 ב 80 ° C (איור 5). יכולות להיות כל הזמן תכונות עיגון אלה בצלחת פטרי במשך שבועות. הערה: שמור על הצלחת הפוכה כדי למנוע טיפות מההשטחה במהלך תהליך הריפוי.
    9. פינוק אוויר פלזמה (30 שניות ב30 W) המצע ו8 תכונות עיגון. לאגד תכונות בכל קצה של המצע במרחק של 4 מ"מ מהכניסה בצורת הריבוע בהווה על המצע (איור 5 ג).
  2. ההרכבה ממברנה על אטבים
    1. לעטוף את כל קצה של המצע סביב החלק הגלילי מחורץ של מלחציים ולאבטח אותו במקום עם 2 setscrews מהחלק העליון (איור 2 ומספרים 5D-E).
    2. בורג 4 מלחציים על בעל המהדק ושופך PDMS (1:20 יחס) באמצעות t חד פעמיפיפטה ransfer בממשק שבין המצע לבין החלק הגלילי מחורץ של מהדק. מורחים את PDMS הדפוק סביב החלק הגלילי מחורץ באמצעות מפתח Hex 1.5 מ"מ.
    3. יוצקים PDMS (1:20) בחריצים עד מלא לחלוטין על ידי פעולת נימים ולרפא את ההרכבה על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 (איור 5F).
  3. זריעת תאים בממברנה
    1. פינוק אוויר פלזמה (30 שניות ב30 W) את המכלול השלם לעקר וfunctionalize המצע כדי לאפשר לציפוי קולגן.
    2. Functionalize השטח של המצע שבו תא יהיה זרע עם 1 מיליליטר של 0.02 M חומצה אצטית בתוספת 16 מיקרוגרם / מיליליטר של קולגן עכברוש זנב בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. צפיפות קולגן הסופית הרצויה היא 5 מיקרוגרם / 2 סנטימטר.
    3. יש לשטוף את המצע 3x עם חיץ פוספט ולתת לו להתייבש בטמפרטורת חדר למשך לפחות עבור 10 דקות.
    4. הוסף 40 μl של מדיום התרבות בתוספת 10% Seru שור עוברימ 'ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין המכיל 2,000 תאים בחלק המרכזי של המצע כדי לכסות על שטח של 1 סנטימטר 2 (צפיפות תאים: 20 תאים / מ"מ 2). צפיפות תאים ניתן לשנות בהתאם לדרישות ניסוי.
    5. שים את כל ההרכבה בחממה תרבות תא רגילה עם המצע פונה כלפי מעלה עם הירידה של מדיום התרבות המכיל תאים על זה. הערה: ההרכבה חייבת להישמר עם המצע פונה כלפי מעלה למשך לפחות 3 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף אותו בחוזקה. על מנת למנוע אידוי, 30 μl של מדיום תרבות החם מתווסף לירידה על פני המצע כל 45 דקות במשך 3 שעות.
    6. אחרי 3 שעות, להפוך את המכלול השלם לתוך צלחת פטרי מלא במדיום תרבות טרי להטביע את המצע ודגירת לילה כדי לאפשר לתאים להתרבות.
    7. למחרת, להכין פתרון HEPES שנאגר מלוח (HBSS; 20 מ"מ של Hepes, 120 מ"מ של NaCl, 5.3 מ"מ של KCl, 0.8 מ"מ של 4 MgSO, 1.8 מ"מ של CaCl 2, ו11.1 מ"מ של דהxtrose). התאם את ה-pH 7.4. הערה: פתרון HBSS צריך להיות מוכן מדי יום ושמר על 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים. פתרון פיסיולוגי זה משמש כדי לשמור על התאים על הבמה מיקרוסקופ על ידי חיקוי סביבת רקמה / דם הנורמלית.
    8. הר את ההגדרה על ניגוד שלב הפוך או מיקרוסקופ פלואורסצנטי הר ההרכבה מהדק-מצע על פלטפורמת BAXS ומנועים. מלא את צלחת פטרי בתוך תנור צלחת פטרי עם חיץ HEPES (איור 2 ד).

2. נוקשות מדידה של כלי קליבר הקטן

  1. הכנה
    1. פתרון פיסיולוגי קרבס: הכן פתרון של 118.1 mM NaCl, 11.1 מ"מ D-גלוקוז, 25 מ"מ NaHCO 3, 4.7 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO 4, 1.2 מ"מ KH 2 PO 4, ו2.5 מ"מ CaCl 2. התאם את ה-pH 7.4 וחמצן את הפתרון עם גז carbogen רפואי (95% O CO 2 2/5%) למשך 30 דקות. הערה: soluti קרבסבצריך להיות מוכן מדי יום ושמר על 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים. פתרון פיסיולוגי זה משמש כדי לשמור על הרקמות בחיים על ידי חיקוי סביבת רקמה / דם הנורמלית.
    2. לאסוף מכשור לנתיחה והערכה מכאנית של כלי אב העורקים: מספריים כירורגיות, פינצטה bended, מיקרו המספריים, מיקרוסקופ לנתח כירורגית, 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר פוליפרופילן, ו10 מיליליטר טפטפות סרולוגיות. ההליך כירורגי וניסוי לא דורש שום תנאים סטריליים. הר מלחציים של פלטפורמת BAXS יחד עם תא העומס מראש.
  2. בידוד רקמות וDissection
    כל הליכי הניסוי הכרוכים בחיות מעבדה צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש במשתמשים 'מוסד, העומדת בבריאות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המשתמשים' ארץ.
    1. לבצע המתת חסד עכבר עם שאיפה של 99% CO 2 (7 psi)ב( איור 6 א) תא פרספקס.
    2. בטן עכבר פתוח וחתך את אב העורקים החזי לדמם העכבר.
    3. הסר את הסרעפת, כלוב בית החזה ואונות ריאה (איור 6). הערה: כדי למזער את הסיכון לפגיעה ברקמה, לשמור על הלב מחובר לאב העורקים והימנעו מלגעת בכלי ישירות אלא לתפעל אותו באמצעות הלב.
    4. הסר את הלב, אב העורקים ושורש אב העורקים החזי על ידי חיתוך בעדינות בין הכלי ועמוד השדרה. הערה: אל תגרום להתארכות כלשהי בספינה במהלך הכריתה כדי לשמור את המבנה הפנימי של שלמות (איור 6 ג) לרקמות.
    5. מייד לטבול ולשמור על הלב ואב העורקים בפתרון קרבס.
    6. לגזור וזהירות לשטוף את אב העורקים בפתרון קרבס כדי להסיר כל קרישי דם. הסרת רקמת חיבור באמצעות מיקרו מספריים, פינצטה ומיקרוסקופ לנתח כירורגית (איור 6 ד-E). הערה: שמור את כל האונייה שהאורך ולהשתמש AOR שורש טיק כדי לקבוע את כיוון הספינה.
  3. קביעת ממד כלי והרכבה
    כדי לקבוע את הנוקשות של כלי השיט, ממדי הספינה נפרקו נדרשים וניתן לקבוע עם מיקרוסקופ מכויל.
    1. לחתוך טבעת אב העורקים של כ -2 מ"מ אורך ובדיוק למדוד את אורכה באמצעות מיקרוסקופ מכויל הגדרה (איורים 6F-G). שים מגזר זה בצד בפתרון קרבס.
    2. חותכים עוד טבעת אב העורקים קטנה ככל האפשר בין כל אחד ממגזרי 2 מ"מ (איור 6F). שים את הקטע הקטן הזה בשקופית זכוכית מיקרוסקופ עם לומן פונה כלפי מעלה ולמדוד את עובי הקיר באמצעות הגדרה מכוילת מיקרוסקופ (איור 6 שעות).
    3. מלא את צלחת פטרי על פלטפורמת BAXS עם פתרון קרבס ולהכניס את קטע טבעת אב העורקים 2 מ"מ על הפינים מושכים (הבלעה באיור 4C).

ge = "תמיד"> figure-protocol-9149
איור 5. ייצור PDMS מצע והרכבה.) לאחר הריפוי, המצע הוא קילף בזהירות את תבנית 2050 SU-8 ולשים בצד בצלחת פטרי. ב ') עיגון תכונות עשויות מPDMS ולעזור כדי לאבטח את המצע על מלחציים מצע. C) עם עיגון תכונות מוכנות להרכבה. ד ') המצע הוא רכוב על 4 מלחציים, אשר לאחר מכן הם רכובים על בעל המהדק (ראה הבלעה).) תמונה מפורטת E של המצע רכוב על 4 מלחציים. F נוהל) מילוי PDMS בחריץ שמתחת למצע. החץ מראה את PDMS ממלא את החריץ באיטיות על ידי נימיות.

"Width =" 454fig6highres.jpg 500 "/>
איור 6. הכנה ובידוד של אב העורקים החזי.) הכנת מכשירי ניתוח ואת העכבר מורדמים. ב ') דרך חתך בבטן האורכי, כלוב בית החזה והריאות lobs יוסרו. C) אב העורקים הוא הסיר בזהירות באמצעות הלב כדי לתפעל הרקמה. ד ') הלב ואב העורקים הם הכניסו בפתרון פיסיולוגי קרבס. אב העורקים הוא ניקה על ידי הסרת כל רקמות החיבור. E תמונה) מפורטת המראה את. פלח לב ואב העורקים F) אב עורקים המשמש להערכת נוקשות יחד עם מקטעים קטנים המשמשים למדידת עובי. GH) האורך המדויק (G) ועובי (H) של כל מגזרי כלי מוערכים באמצעות מיקרוסקופ הפוך ותכנית ניתוח.

תוצאות

תא מתיחה

פלטפורמת BAXS שימשה כדי לחקור את התגובה מכאנית של הגרעין בתאים והיצמדות למנגנון עכבר אחת (C2C12) נחשף לעיוות מצע של 25%. תאים והיצמדות למנגנון נמצאים ברקמת שריר ונחשפים כל הזמן למתיחה מכאנית ודחיסת in vivo. מאפייני ה...

Discussion

פלטפורמת BAXS שהוצגה כאן מאפשרת מספר רב של ניסויים בחקר mechanobiology, מחקירות של תאים בודדים לכל רקמות. בנוסף, הפלטפורמה גמישה מאוד להגדרה, ומאפשרת למספר רב של ניסויים מכאניים גירוי ובדיקת מתיחה רב צירית. הפלטפורמה מאפשרת גם התחזוקה של תאים ורקמות בתנאים פיסיולוגיים ומאפשר...

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

DT נתמכה על ידי מלגת לימודים פוסט דוקטורט מle Fonds דה משוכלל ונדיר du Québec-Nature et טכנולוגיות (FQRNT) וMITACS לרומם אסטרטגית מלגה. CMC נתמכה על ידי מלגת לימודים פוסט דוקטורט מle Fonds דה משוכלל ונדיר en סנטה du קוויבק (FRSQ) וארנסט ומענק מחקר קרדיולוגיה ניחן מרגרט פורד מאוניברסיטת אוטווה לב המכון. EOB נתמכה על ידי MOP80204 הפעלת מענקים מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וT6335 מהלב ושבץ קרן של אונטריו. CIHR ומדטרוניק לספק קולקטיבי EOB עם מחקר קתדרת ביקורת עמיתים (URC # 57,093). AEP ממומן על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר (NSERC) דיסקברי גרנט, מוסף NSERC Discovery Accelerator והכרת תודה מכיר את תמיכתם של כיסאות קנדה מחקר תכנית (CRC) ופרס חוקר מוקדם ממחוז אונטריו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PDMSEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGThe ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheresInvitrogenF8810Keep away from light.
Linear voice coilMoticontLVCM-051-051-01The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slideEdmund OpticsNT37-360Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stageEdmund Optics38-960Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoderGSI microE systemsMercury II 1600S - 0.5um resolutionreflective incremental encoder.
Motion controllerGalilDMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-204404 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cellHoneywell31 lowminiature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm)Pin Service Austerlitz Insect pinsStainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050Micro ChemSU-8 2050Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment systemGlowresearchAutoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagenInvitrogenA10483-01Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342InvitrogenR37605DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heatersomega.caKHLV-0504/(10)-P28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllersomega.caCN63200-R1-LVTemperature controller; supply 24 V.
DMEM culture mediumHycloneSH3024301Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-StreptomycinHycloneSV30010Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH3039603CKeep frozen.
Trypsin 0.05%HycloneSH30236.02Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
HepesWisent Inc330-050-ELHEPES-buffered salt solution 
NaClFisher ScientificBP358-1HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KClFisher ScientificBP366-500HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4Fisher ScientificM65-500HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2Fisher ScientificC614-500HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
DextroseFisher ScientificBP220-1HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1Krebs physiological solution
KH2PO4Fisher ScientificBP362-500Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2LindleDIN:02154749Krebs physiological solution oxygenation
NocodazoleSigmaM1404Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-DSigmaC8273Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITCSigmaF3777Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stainFluka43665Used to stain and quantify collagen content

References

  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88uniaxialbiaxialmechanobiology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved