細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

要約

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。

要約

細胞や組織、またはそれに機械的な力の適用は、生体組織の機械的特性を定量化することができるためのツールは、基本的なメカノの理解に劇的に貢献してきた。これらの技術は、広く様々な疾患の発症および進行を頻繁に機械的な手がかりの影響を受けているかを示すために使用されている。この記事では、機械的に、単一の細胞を刺激するか、組織の機械的剛性を定量化するか多機能二軸延伸（BAXS）プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームは独立して制御することができる4つのボイスコイルモータで構成されている。単一細胞ひとつ、複雑な動的、および空間的に変化する歪み場に細胞を露出することを可能にモータに取り付けることができるフレキシブル基板上に培養することができる。逆に、力ロードセルを組み込むことによって、人はまた、それらが変形サイクルにさらさ​​れているように、一次組織の機械的特性を定量化することができる。両方の場合において、クランプの適切なセットを設計しなければならないし、しっかりとフレキシブル基板または目的の組織を保持するためにBAXSプラットフォームモータに取り付けられた。 BAXSプラットフォームは、延伸実験の間、試料の構造的または生化学的反応を調べるために同時の透過光および/または蛍光イメージングを実行するために倒立顕微鏡に装着することができる。この記事ではBAXSプラットフォームの設計と使用法の実験の詳細を提供し、単一の細胞や組織全体の研究の結果を提示します。 BAXSプラットフォームは、歪みを基板へと単離したマウス大動脈の剛性を測定するために応じて、単一のマウス筋芽細胞における核の変形を測定するために使用した。 BAXSプラットフォームは、細胞内、細胞および全組織レベルでの新たなmechanobiologicalな洞察を提供するために、様々な光学顕微鏡法と組み合わせることができる汎用性の高いツールです。

概要

機械的な微小環境は、組織の発生及び恒常性にし、また疾患^1-6に大きな影響を与えるような、増殖、遊走、および分化のような多くの細胞機能において重要な役割を果たしている。長年にわたって、多数の実験的なツールは、機械的に細胞または組織を刺激し、基本的なメカノの我々の理解を高め、疾患^6-17の発症および進行を研究することを目的として生体組織の機械的特性を測定するために使用されてきた。しかし、一つは、多くの場合、特定の研究の目標を達成するために、いくつかの異なる実験のデバイスに依存しなければならない。この記事では、機械的特性や機械的な力を全組織長さスケールに細胞内で生物学に果たす役割を調べる研究を可能にし、単一の、多機能、二軸延伸（BAXS）プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームはquantificatioのためにできるだけでなく単離された組織の機械的特性のn個ではなく、単純に適用する能力を容易にし、複雑で、動的歪み場すなわちインビボで起こる延伸への応答を理解するために、生きた細胞である。 BAXSプラットフォームは、細胞や組織に機械的試験と摂動中に生細胞顕微鏡を実行する能力を維持している。

BAXSプラットフォームは、細胞レベルでの基板変形の影響を調査し、生物学的組織（ 図1A）上に引張試験を行うために使用することができる特注の装置である。アルミニウムヒーターは、標準的な10cmのペトリ皿を収容し、温度制御器およびカプトンヒーター（ 図1B）を用いて、37℃で、任意の生理学的溶液を維持するように作製した。このBAXSプラットフォームは、倒立位相差顕微鏡および/ ​​または蛍光顕微鏡上に集積し、同時イメージング（ 図1C）を可能にすることができる。要するに、BAXSプラットフォームは、可動部品が直交する二軸（ 図1D）に沿って配向されたスライド軸受ミニチュア直動ボールに搭載された4本の直線状のボイスコイルモータで構成されている。線形位置決めステージ（ 図1E）に使用されるクランプシステムの垂直移動を可能にするために4つのモータのそれぞれに取り付けられている。各モータの位置は、500nmの分解能（ 図1F）を有する光学式エンコーダによって監視される。すべての4つのモータは、独立して動作コマンド（ 図1G）を実行するための光学エンコーダフィードバックを用いたモーションコントローラで制御される。 LabVIEWのインターフェースは、細胞または組織試料の、完全にカスタマイズ可能な静的および動的変形を生成するために、変位量、速度、及び各モータの加速度を完全に制御できる。

細胞における変形を誘導するために使用される技術は、単にallowinにより達成されるG細胞は、しっかりと柔軟で透明基材に付着した後、BAXSプラットフォームの4つのモータを使用して、この基板を延伸。 BAXSプラットフォームは、ボイスコイルモータ基板を取り付けるクランプのいずれかのカスタム設計されたセットの装着を可能にする。この目的のために、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）からなる可撓性透明基板は、（ 図2A-C及び図3）を結合させることができるクランプのセットを設計した。クランプは生理学的溶液に暴露されるように、すべての部品は、滅菌を可能にするために、ステンレス鋼から機械加工した。これらのクランプは慎重に（ 図2D）が延伸中に基板へのストレスを最小限に抑えつつ、画像品質を向上させるために顕微鏡対物レンズにできるだけ近接して基材をもたらすように設計されている。

同じBAXSプラットフォームは、ADAPとクランプの適切なセットを用いて、小さな組織試料の剛性を定量化するために使用することができるテッドは軍を監視するための組織サンプルとロードセルのためサポートしています。いくつかのアプローチがBAXSプラットフォームモータに組織をマウントするために撮影することができます。この場合には、ステンレス鋼昆虫minutiensピンは、引張試験（ 図4A-B）を実行するために、血管組織の開口部を通してフックできる。代替的に、自然の開口部のない厚さの組織について、組織の縁部は、いずれかのボイスコイルモータに取り付けられた、または生物学的接着剤の小さなガラススライドに接着し、クランプでモータに取り付けられたクランプを所定の位置に保持することができる。引張りを行うために、小型ロードセルが必要とされるテストし、容易にBAXSプラットフォームモータに組み込ま延伸サイクル（ 図4C）の間に組織に作用する力を測定するために使用することができる。 BAXSプラットフォームは4つのモータから構成されているように、第二のロードセルの導入は、いずれか2つの直交方向に沿って引張試験を行うことができる。この能力は、1がquantifすることができますYと同じ実験中の2つの垂直な方向に沿った単一組織の機械的剛性。

重要なことに、すべての構成で、目的の細胞または組織サンプルは、常にユーザがアクセス可能な恒温槽内に維持される。この能力は、試料の時間応答を調べるために、延伸試料中の薬理学的物質の導入を可能にする。倒立顕微鏡の光軸が遮られないままであるさらに、顕微鏡のすべての形態は、まだユーザーが使用できる。 BAXSプラットフォームのすべての4つのモータが独立しているように、最終的に、関心対象の試料に高度に構成可能な歪み場を適用することが可能である。 インビボ細胞および組織が ​​暴露された複合体とは対照的に、それはこのプラットフォームでは、より適切に模倣することができる延伸異方性伝統的な一軸延伸プラットフォーム^{7,13,15,18,19}へ。また、物理的特性歪み場の実験中にオンザフライで変更することができる。これらの能力は、ユーザが時間的に非常に複雑な、異方性の広い数、および空間的に変化する歪み場に対する細胞および組織レベルの応答を調べることを可能にする。この記事では、利点と制限BAXSプラットフォームのだけでなく、その設計、動作原理、および単一セルおよび全組織実験のための実験の詳細を説明しています。

図1。BAXSプラットフォームの概要。 37℃Cで細胞および組織を維持するために使用ペトリ皿加熱ヒータのA）は、4つのボイスコイルモータを示すBAXSプラットフォームの上面図である。B）詳細ピクチャ）プラットフォームは、ライブを実行するために倒立顕微鏡に装着することができるストレッチ実験中の細胞イメージング。D）ボイスコイルモータの詳細な絵;プラットホームの可動部分。E）クランプシステムの垂直方向の変位を可能にする線形位置決めステージの詳細な絵。F）モーションコントローラにモータの実時間位置を提供する光学式エンコーダの詳細な絵。G）詳細画像4つの音声コイルモータ、4つの光エンコーダ入力および電力出力を示すモーションコントローラ。

図2。実験を伸ばすセル用のクランプシステム。基板は、そのアンカーfeaturとクランプの円筒部に巻き付けられる。C）を延伸するためのボイスコイルモータにPDMS基板を取り付けるために使用されるクランプの詳細を示すAB）の画像ES上部の溝に座って。次いで、基板を上部溝に特徴をアンカー/基質をプッシュ止めねじを用いて固定されている。クランプが所定の位置に基板を保持するとともにBAXSプラットフォームのD）イラストレーション。挿入図は、それだけでカバースリップと顕微鏡の対物レンズの上に座っているに付着した細胞を有する基板の詳細図を示す。

図3膜及びそのクランプシステムの部品表。細胞延伸実験を行うために二軸プラットフォームに集積主要部の寸法を示す図面。

図4。例クランプシステムの小口径血管の剛性評価のためのクランプシステムの十分。AB）の詳細な写真は直径1mm、マウスの大動脈の変形を誘導するために使用。ステンレス製のピンを慎重に船が両方のピンにスライドすることができるように、オープン三角形に成形した。固定されたモータと左クランプとの間に取り付け、容器とロードセルを保持するクランプを備えたBAXSプラットフォームのC）のイラスト。挿入図は、ピンの上に取り付けられた容器の詳細な平面図を示している。

プロトコル

単一細胞の1。機械的変形

1. 組み込み蛍光ビーズとPDMS基板の作製
   基板の製造の前に、水溶液中の蛍光マイクロスフェアは、その疎水性の性質に起因PDMSにおけるビーズ混合を促進するためにイソプロパノール中に再懸濁する。
   1. ピペット10分間16200×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機への蛍光マイクロスフェアの500μL。
   2. 上澄み液を捨て、ボルテックスの5分で、その後のイソプロパノール500μlを添加する。堆積物に任意の大きな粒子の凝集を可能にするために暗闇の中で一夜放置バイアルを置きます。
   3. 翌朝、慎重にきれいな微量バイアルに上清を除去。このビーズ溶液を5つ以上の基板を製造するために使用することができる。注：ビーズ溶液は、次の3日間、沈降していきます。ペレットを再懸濁ないように注意してください。
   4. 提供硬化剤0.5グラムを注ぐ1.5mlのマイクロバイアル中のPDMSキットは、科学的なバランスを使用した。連続した工程により、各添加間の1分間ボルテックス、（6 15μlの添加で）ビーズの90μlの合計を追加します。置いておきます。
   5. PDMS 10gを秤量し、蛍光ビーズを補充した硬化剤0.5gを、少なくとも12分間混合する。
   6. 製造者の指示に従って標準的なフォトリソグラフィ技術を用いてSU-8 2050断面形状の金型を製作する。使用した金型は、320μmで13.4 cm ²で（ 図3）の領域の高さを有している。金型は428μLまたはPDMSの440ミリグラムを含むことができます。
   7. 80℃で2時間、トランスファーピペットおよび硬化を用いたクロス形状の金型内にビーズをPDMS 400mgの流動硬化後、金型（ 図5A）から基板をはがし。基板は、その機械的特性の有意な変化を示すことなく2週間室温でペトリ皿に維持することができる。
   8. 直径約4mmの最終的な大きさのペトリ皿に80℃（ 図5B）で2時間逆さにそれらを治す：PDMSの滴（1:20の比率で、PDMS硬化剤）を注ぐ。これらの機能は、アンカー週間ペトリ皿に保つことができる。注：硬化プロセス中に平坦化から落下しないように逆さまにお皿を維持します。
   9. エアープラズマトリート（30 Wで30秒）基板および8アンカー機能。基板（ 図5C）上に存在する正方形のくぼみから4ミリメートルの距離で基板の両端に機能的に結合する。
2. クランプ上に膜を取り付け
   1. クランプの溝付き円筒部の周囲の基板のそれぞれの端部を包み、上から2止めネジ（ 図2B及び図5D-E）で固定します。
   2. クランプホルダーに4クランプをねじ込み、使い捨てのTを使用して、PDMS（比率1:20）注ぐ基板とクランプの溝付き円筒部との界面での順伝達ピペット。 1.5mmの六角レンチを使用して、溝付き円筒部の周囲に、未硬化のPDMSを広げた。
   3. 完全に毛細管現象によって充填され、2時間後（ 図5F）、80℃でアセンブリを治すまで溝に、PDMS（1:20）注ぐ。
3. 膜上で細胞を播種
   1. エアープラズマトリート（30 Wで30秒）コラーゲンコーティングを可能にするために基板を殺菌し、機能化、アセンブリ全体。
   2. 細胞を、1時間室温でラット尾部コラーゲンの16μg/ mlのを補充した0.02 M酢酸1mlで播種される基板の面積を官能。所望の最終コラーゲン濃度は、5μgの/ cm ²である。
   3. リン酸緩衝液で基板3回すすぎ、それは、室温で乾燥を少なくとも10分間のためにしてみましょう。
   4. 10％ウシ胎児干せるを添加した培養培地を40μl加えmおよび1cm ^2の （セル密度：20細胞/ mm ^2）の面積を覆うように基板の中心部に2,000細胞を含有する1％ペニシリン-ストレプトマイシン。細胞密度は、実験の要件に応じて変更することができる。
   5. 基板は、その上に細胞を含む培養液滴の上にして、標準的な細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を置きます。注：アセンブリは、細胞がしっかりとそれを添付することを可能にするために、少なくとも3時間、上に向けて基板を保持する必要があります。蒸発を防ぐために、暖かい培養培地の30μlを、基板上の液滴で3時間毎に45分間に添加する。
   6. 3時間後、基板を浸して、細胞が増殖することを可能にするために一晩インキュベートし、新鮮な培養培地で満たされたペトリ皿に、アセンブリ全体を反転させる。
   7. 次の日、HEPES緩衝塩溶液（HBSSを準備し、ヘペス、NaClを120 mMの塩化カリウムの5.3mmで、 _硫酸マグネシウムの0.8 mMのCaCl _2を 1.8 mmであり、デの11.1 mMと20 mMのxtrose）。 pHを7.4に調整する。 NOTE：HBSS溶液を毎日調製し、実験の間37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって、顕微鏡ステージ上の細胞を維持するために使用される。
   8. 倒立位相差または蛍光顕微鏡マウントBAXSプラットフォームおよびモータのクランプ基板アセンブリ上のセットアップをマウントします。 HEPES緩衝液（ 図2D）でシャーレヒーター内部のペトリ皿を埋める。

小口径血管の2。剛性測定

1. 準備
   1. クレブス生理的溶液：118.1のNaCl、11.1 mMのD-グルコース、25 mMの_炭酸水素ナトリウム、4.7のKCl、1.2のMgSO _4、1.2mMのKH ₂ PO _4、および2.5mMのCaCl ₂の溶液を調製する。 pHを7.4に調整し、30分間カーボゲン医療ガス（95％O _{2/5％CO 2）}で溶液に酸素。注：クレブスsolutiには、実験中毎日調製し、37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって生きている組織を維持するために使用される。
   2. 外科はさみ、曲がったピンセット、マイクロはさみ、外科解剖顕微鏡、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管、および10ミリリットル血清学的ピペット：解剖と大動脈血管の機械的な評価のための計測機器を収集します。外科的および実験手順は、任意の無菌状態を必要としません。あらかじめロードセルとともにBAXSプラットフォームのクランプを取り付けます。
2. 組織分離と解剖
   実験動物に関連するすべての実験手順は国の利用者の実験動物の管理と使用に関する健康ガイドに準拠機関、「利用者の動物実験委員会によって承認されなければならない。
   1. 99パーセントのCO ₂の吸入（7 PSI）で、マウスの安楽死を実行するプレキシグラス室（ 図6A）内。
   2. 開いたマウスの腹部とマウスを出血する胸部大動脈を切った。
   3. 横隔膜、胸郭および肺葉（ 図6B）を取り外します。注：組織を損傷する危険性を最小限に大動脈に装着心を保ち、直接容器に触れないように、心臓を使って操作します。
   4. そっと容器と背骨の間切断することにより、心臓、大動脈根および胸部大動脈を削除します。注：完全な組織（ 図6C）の内部構造を維持するために、切除の際に容器内のいずれかの伸長を誘導しないでください。
   5. すぐに浸すとクレブス液中の心臓と大動脈を保つ。
   6. カットして慎重に血の塊を取り除くためにクレブス液中に大動脈を洗う。マイクロハサミ、ピンセット、外科解剖顕微鏡（ 図6D-E）を使用して結合組織を除去します。注：すべての血管長を保持し、AORを使用容器の向きを決定するために、TICルート。
3. 血管寸法判別の取付け
   容器の剛性を決定するために、アンロードされ、容器の寸法は必要とされ、較正された顕微鏡を用いて決定することができる。
   1. 長さ約2mmの大動脈輪を切断して、正確に（ 図6F-G）を設定するキャリブレーション顕微鏡を用いて、長さを測定します。クレブス液中にわきこのセグメントを置く。
   2. 2ミリメートルのセグメント（ 図6F）の各々の間の可能な限り小さく、他の大動脈のリングをカット。ルーメンを上にして顕微鏡スライドガラス上にこの小さなセグメントを入れて、校正された顕微鏡の設定（ 図6H）を使用して、壁の厚さを測定します。
   3. クレブス溶液でBAXSプラットフォーム上でペトリ皿を記入します（ 図4（c）に挿入図）引っ張ってピンの2ミリメートルの大動脈リングセグメントを挿入します。

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図5。PDMS基板の製造および硬化の後、A）を搭載 、基板を慎重に、SU-8 2050金型から剥離し、シャーレに脇に置くされています。） は、PDMSで作られた機能を係留し、基板を固定するのに役立つクランプ4に搭載された基板の基板は、次いで、クランプホルダに取り付けられているクランプ4、（挿入図を参照）に取り付けられている。D）を取り付けるための準備機能を有する固定クランプ。C）基質。E）詳しい画像。F基板の下の溝に、PDMSを注ぐの）手順。矢印は、ゆっくりと、毛細管現象により溝を埋めるPDMSを示しています。

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図6。準備および胸部大動脈の単離A）の縦方向の腹部切開を通して手術器具や安楽死マウス。B）を製造、胸郭および肺のLOBが削除されます。C）大動脈を慎重に操作するために心を用いて除去される組織。D）に心臓と大動脈をクレブス生理的溶液に入れられる。大動脈は、すべての結合組織を除去して洗浄される。E）心臓および大動脈を示す詳細な絵。F厚さ測定に使用される小さなセグメントに沿って剛性評価のために使用される）大動脈セグメント。GH）正確な長さ（G）及び厚さ（H）各血管セグメントは、逆顕微鏡および分析プログラムを用いて評価される。

結果

細胞体を伸ばす

BAXSプラットフォームは、25％の基板変形に露出シングルマウス筋芽細胞（C2C12）における核の機械的応答を調べるために使用した。筋芽細胞は、筋肉組織に見出され、常に生体内で機械的伸張および圧縮に曝される。細胞核の形状及び機械的特性は、遺伝子発現および転写活性^20,21の制御に、また、発達障害や、ハッチンソン-...

ディスカッション

ここで紹介するBAXSプラットフォームは、組織全体に対する単一の細胞の調査から、メカノの研究に多くの実験を容易にします。また、プラットフォームは、多数の機械的刺激実験や多軸引張試験を可能にし、非常に柔軟で設定可能です。プラットフォームはまた、生理学的条件下で細胞および組織の維持を可能にし、延伸実験の間、同時顕微鏡検査を可能にする。取り付けクランプの適切な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your
FluoSpheres fluorescent microspheres	Invitrogen	F8810	Keep away from light.
Linear voice coil	Moticont	LVCM-051-051-01	The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide	Edmund Optics	NT37-360	Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage	Edmund Optics	38-960	Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder	GSI microE systems	Mercury II 1600S - 0.5um resolution	reflective incremental encoder.
Motion controller	Galil	DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440	4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell	Honeywell	31 low	miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm)	Pin Service Austerlitz Insect pins		Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050	Micro Chem	SU-8 2050	Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system	Glowresearch		Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen	Invitrogen	A10483-01	Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342	Invitrogen	R37605	DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters	omega.ca	KHLV-0504/(10)-P	28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers	omega.ca	CN63200-R1-LV	Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium	Hyclone	SH3024301	Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin	Hyclone	SV30010	Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH3039603C	Keep frozen.
Trypsin 0.05%	Hyclone	SH30236.02	Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes	Wisent Inc	330-050-EL	HEPES-buffered salt solution
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2	Fisher Scientific	C614-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose	Fisher Scientific	BP220-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1	Krebs physiological solution
KH2PO4	Fisher Scientific	BP362-500	Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2	Lindle	DIN:02154749	Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole	Sigma	M1404	Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D	Sigma	C8273	Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC	Sigma	F3777	Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain	Fluka	43665	Used to stain and quantify collagen content