Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Özet

Bu makalede kompleks anizotropik çift eksenli mekanik deformasyona karşı tek bir hücre yanıtları araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilen yeni bir germe platformu sunmak.

Özet

Hücre ve dokulara mekanik kuvvetlerin uygulama veya buna izin Araçları biyolojik dokuların mekanik özellikleri temel mekanobiyolojisinin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur ölçmek olabilir. Bu teknikler yaygın olarak çeşitli hastalıkların başlangıcı ve ilerlemesi ağır mekanik ipuçları tarafından nasıl etkilendiğini göstermek için kullanılır olmuştur. Bu makalede, bir mekanik olarak hücreleri uyarmak ya da dokuların mekanik sertliğini ölçmek ya çok fonksiyonlu bir çift eksenli germe (BAXS) platformu sunmaktadır. BAXS platformu bağımsız olarak kontrol edilebilir, dört ses bobini motorundan oluşur. Tek hücre, bir karmaşık, dinamik ve mekansal olarak değişen gerilme alanları hücreleri ortaya çıkarmak için izin motorlara bağlı esnek bir alt-tabaka üzerinde kültürlenebilir. Tersine, bir güç yük hücresi dahil edilmesi ile, aynı zamanda, bir deformasyon döngüsüne maruz olduğu gibi primer dokularının mekanik özelliklerini ölçmek olabilir.Her iki durumda da, flanş uygun bir dizi tasarlanmış olması gerekir ve sıkı bir şekilde esnek substrat veya ilgilenilen doku tutmak için BAXS platformu motorlara monte edilmiştir. BAXS Platform germe deney sırasında numunenin yapısal veya biyokimyasal tepki incelemek için aynı anda iletilen ışık ve / veya flüoresan görüntüleme gerçekleştirmek için bir ters mikroskop üzerine monte edilebilir. Bu makalede, BAXS platformun tasarım ve kullanım deneysel ayrıntıları temin etmekte ve tek hücre ve bütün doku çalışmaları için sonuçlar sunulmaktadır. BAXS platformu gerginlik alt tabakaya ve izole edilmiş fare aorta sertliğini ölçmek için yanıt olarak tek bir fare miyoblast hücrelerinin çekirdeklerin içinde deformasyonunu ölçmek için kullanılmıştır. BAXS platformu alt-hücre, hücre ve doku bütün seviyelerde yeni mechanobiological anlayış sağlamak için çeşitli optik mikroskop ile kombine edilebilir çok yönlü bir araçtır.

Giriş

Mekanik mikro çevre dokuların gelişimi ve homeostazında ve ayrıca hastalık ^1-6 derin bir etkiye sahip çoğalma, göç ve farklılaşma gibi birçok hücre fonksiyonları, önemli bir rol oynar. Yıllar geçtikçe, deneysel araçları çok sayıda mekanik hücreleri veya dokuları uyarmak ve temel mechanobiology anlayışımızı artırarak ve hastalıkların ^6-17 başlamasını ve ilerlemesini okuyan amacı ile biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılır olmuştur. Ancak, sık sık belirli bir çalışmanın hedeflerine ulaşmak için birçok farklı deneysel cihazlarda güvenmek gerekir. Bu makale, mekanik özellikleri ve mekanik kuvvetler bütün doku uzunluk ölçekleri ile alt hücresel biyoloji oynadığı rolü araştırmak çalışmalar için izin veren bir tek, çok fonksiyonlu, iki eksenli germe (BAXS) platformu sunuyor. BAXS platformu quantificatio sağlar sadeceAyrıca, izole edilmiş dokular, mekanik özellikleri, ancak bu n in vivo meydana gelen germe yanıtlarını anlamak için canlı hücreler için, basit, karmaşık ve dinamik gerilme alanları uygulama yeteneğini kolaylaştırmaktadır. BAXS platform aynı zamanda hücre ve dokulara mekanik test ve tedirginlikler sırasında canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için kapasitesini korur.

BAXS platformu hücresel seviyede deformasyon alt-tabaka etkisini araştırmak ve biyolojik dokularda (Şekil 1A) üzerinde gerilme testleri yapmak için kullanılabilir, özel olarak yapılmış bir cihaz. Alüminyum bir ısıtıcı, bir standart 10-cm Petri için uygun ve bir sıcaklık kontrol ve kapton ısıtıcılar (Şekil 1 B) kullanarak, 37 ° C'de herhangi bir fizyolojik çözüm sağlamak için imal edilmiştir. Bu BAXS platformu, bir ters faz kontrast ve / veya floresan mikroskop üzerine entegre ve eş zamanlı olarak görüntüleme (Şekil 1C) sağlar edilebilir.Kısaca, BAXS platformu hareketli parçalar birbirine dik iki eksen (Şekil 1D) boyunca yönlendirilmiş olan minyatür doğrusal hareket rulman slaytlar üzerine monte edilir ki, dört ses bobini lineer motorlar oluşur. Doğrusal bir konumlandırma aşamasında (Şekil 1E) kullanılacak olan bir sıkma sistemi, dikey hareketine izin vermek üzere dört motorlar her birine monte edilir. Her bir motorun konumu 500 nm 'lik bir çözünürlüğe (Şekil 1F) sahip bir optik kodlayıcı tarafından izlenir. Dört motorları bağımsız hareket komutlarını (Şekil 1G) yürütmek için optik enkoder geri bildirim kullanan bir hareket kontrolörü ile kontrol edilir. A LabVIEW arabirimi hücre veya doku numunelerinin, tamamen özelleştirilebilir statik ve dinamik deformasyon üretmek için yer değiştirme büyüklüğü, hız ve her motorun hızlandırılması üzerinde tam kontrol sağlar.

Hücrelerde bir deformasyona neden için kullanılan teknik sadece allowin ile elde edilmektedirg kadar hücre sıkı bir şekilde, esnek ve şeffaf bir alt-tabakaya bağlı ve daha sonra BAXS platformun dört motorlar kullanılarak bu alt-tabakanın germe. BAXS platformu ses bobini motorlarda tabakayı takmak için kelepçeleri herhangi bir özel tasarlanmış set montaj sağlar. Bu amaçla, polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir esnek ve saydam alt-tabaka, (Şekil 2A-C ve Şekil 3) bağlı olabilir için kelepçeler bir dizi tasarlanmıştır. Kelepçeler fizyolojik çözeltiler maruz gibi, tüm parçaları sterilizasyon sağlamak için paslanmaz çelikten işlendi. Bu kelepçeler, dikkatli bir şekilde (Şekil 2B) germe esnasında alt-tabaka üzerindeki stresi en aza indirirken, resim kalitesini arttırmak için mikroskop amacı mümkün olduğu kadar yakın bir alt-tabakanın getirmek için tasarlanmıştır.

Aynı BAXS platform da ADAp ile kelepçeler arasında uygun bir dizi ile, küçük doku örneklerinin sertliğini ölçmek için kullanılabilirted doku örnekleri ve kuvvetleri izlemek için bir yük hücresi için destekler. Çeşitli yaklaşımlar BAXS platformu motorlar için bir doku monte alınabilir; bu durumda, paslanmaz çelik böcek minutiens pim çekme testleri (Şekil 4A-B) gerçekleştirmek için vasküler dokuların açıklıktan kanca. Seçenek olarak ise, bir doğal açılmaksızın kalın dokuların doku kenarları ya da ses bobini motorlara bağlı ya da biyolojik yapıştırıcı ile küçük cam slaytlar yapıştırılmış ve kelepçeli motorlara bağlı kelepçeli konumda tutulabilir. Gerilme gerçekleştirmek için minyatür yük hücresi gereklidir test ve kolayca BAXS platformu motorların üzerine kurulmuştur ve bir germe döngüsü (Şekil 4C) sırasında doku üzerine etki eden kuvveti ölçmek için kullanılabilir. BAXS platformu dört motor oluşur gibi, ikinci bir yük hücresinin giriş bir iki dik doğrultuları boyunca çekme testi gerçekleştirmek için olanak sağlar. Bu özellik, bir quantif sağlar:y, aynı deney sırasında iki dikey yönde boyunca tek bir doku mekanik sertliği.

Önemli olarak, tüm yapılandırmalarında, hücreler ya da ilgi doku numuneleri her zaman kullanıcı tarafından erişilebilen bir sıcaklık kontrollü banyosu içinde muhafaza edilmiştir. Bu yetenek, numunenin zamansal tepkisini incelemek amacıyla germe sırasında örnek farmakolojik maddelerin katılmasına olanak sağlamaktadır. Ters mikroskop optik eksen engelsiz kalır Ayrıca, mikroskopi bütün biçimlerinin hala kullanıcı için kullanılabilir. BAXS platformun dört motorlar bağımsız Son olarak, ilgi alanındaki örnek için çok yapılandırılabilir gerilme alanları uygulamak mümkündür. In vivo hücre ve dokuları maruz kompleks ve farklı olarak bu platformda daha uygun bir şekilde taklit olabilir germe anizotropik Geleneksel tek eksenli germe platformu ^{7,13,15,18,19} için. Ayrıca, fiziksel özelliklerigerilme alanının bir deney sırasında anında değiştirilebilir. Bu yetenekleri kullanıcı bir zamansal son derece karmaşık, anizotropik çok sayıda, ve mekansal olarak değişen gerilme alanları hücresel ve doku düzeyinde yanıt incelemek için izin verir. Bu makalede, avantajları ve sınırlamaları BAXS platformun yanı sıra tasarımı, çalışma prensiplerini ve tek bir hücre ve doku bütün deneyler için, deney detaylarını açıklar.

BAXS platformun Şekil 1.. Bakış. Dört ses bobini motorlar platformu gerçekleştirmek için canlı ters bir mikroskop üzerine monte edilebilir) 37 ° C C'de hücre ve dokuları korumak için kullanılan Petri ısıtıcının. B) Ayrıntılı resim gösteren BAXS platformu A) Üst görünüm germe deneyler sırasında hücre görüntüleme.D) ses bobini motorun detaylı resmini; bağlama sistemlerinin hareket kontrol. G) Detaylı resim için motorun gerçek zamanlı konumunu sağlayan optik encoder. F) Ayrıntılı resim dikey değiştirmesine izin lineer konumlandırma aşamasında platformunun hareketli parçası. e) Ayrıntılı resim Dört ses bobini motorlar dört optik enkoder girişleri ve güç çıkışları gösteren hareket denetleyicisi.

Şekil 2,. Hücre germe deneyler için bağlama sistemi. Substrat olarak tutma İKLER ile kelepçenin silindirik kısmı etrafında sarılır. ° C) germe için ses bobini motorlara PDMS tabakayı bağlamak için kullanılan kelepçelerin ayrıntılarını gösteren, AB) Resimlerdees üstündeki oluğa oturan. Sonra tabaka üst oluğa özelliklerini demirleme / tabakayı itin vidalarını kullanılarak sabitlenir. Kelepçeler yerinde tabakayı tutan BAXS platformu D) İllüstrasyon. Ilave ona bağlı hücreler sadece bir kapak ve kayma mikroskop objektif üzerinde oturan substratın ayrıntılı bir görünüşünü gösterir.

Şekil 3. Membran ve bağlama sisteminin malzemelerin Bill. Asıl parçaların boyutlarını gösteren resimler hücre germe deneyler gerçekleştirmek için çift eksenli platforma entegre.

Şekil 4,. ExKüçük kalibreli damarların sertliği değerlendirilmesi, 1 mm çaplı fare aort deformasyona neden için kullanılan bir sıkma sistemi. AB) Detaylı resim için bir sıkıştırma sistemi geniş. Paslanmaz çelik pimler dikkatle damar hem de iğneler üzerinde kelepçeler gemi ve sabit motor ve sol kelepçe arasında bağlı bir yük hücresi tutan BAXS platformun. C) gösteren örnek kaymasına izin vermek için açık bir üçgen halinde şekillendirilir edilmiştir. Ilave pimler üzerine monte teknenin ayrıntılı bir üst görünüşünü gösterir.

Protokol

Tek Hücrelerinin 1.. Mekanik Deformasyon

1. Gömülü Floresan Boncuk ile bir PDMS Yüzey Fabrikasyon
   Önce, alt-tabakanın imalatı için, su çözeltisi içerisinde flüoresan mikro hidrofobik doğası nedeniyle PDMS boncuk karıştırmayı artırmak için izopropanol içinde yeniden süspanse edilir.
   1. 10 dakika boyunca 16.200 x g'de bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj flüoresan mikro pipetle 500 ul.
   2. Süpernatantı atın ve eklemek izopropanolün 500 ul vortekslen 5 dakika ile izledi. Herhangi bir büyük partiküllerin çökelmesi için agrega sağlamak için karanlıkta gece boyunca bir kenara şişeyi koyun.
   3. Ertesi sabah, dikkatli bir şekilde temiz bir mikrosantrfuj şişeye süpernatantı. Bu çözelti, daha fazla boncuk 5 tabakaları imal etmek için kullanılabilir. NOT: boncuk çözeltisi bir sonraki 3 gün boyunca tortu devam edecektir. Pelet resuspending önlemek için dikkatli olun.
   4. Resim sertleştirme ajanının 0.5 g dökünbilimsel bir tartıyı kullanarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj şişede PDMS kiti ile. Birbirini takip eden adımlar ile, her bir ilave arasında 1 dakika boyunca karıştırın, (altı 15 ul ilave olarak) boncuk 90 ul bir toplam ekleyin. Kenara koyun.
   5. PDMS, 10 g tartılır ve flüoresan boncuklar ile desteklenmiş sertleştirme maddesinin 0.5 g, en azından 12 dakika boyunca karıştırın.
   6. Üreticinin talimatlarına göre standart teknikler kullanılarak bir fotolitografi SU-8 2.050 çapraz şeklinde kalıp imal. Kullanılan kalıp 320 um'lik bir yüksekliğe ve 13.4 ^cm2 bir alan (Şekil 3) sahiptir. Kalıp 428 ul veya PDMS 440 mg içerebilir.
   7. Bir transfer pipeti kullanarak, çapraz-şekilli kalıpta boncuklar ile PDMS 400 mg dökün ve 80 ° C'de 2 saat boyunca kür Sertleştirme sonrası, kalıbın (Şekil 5A) arasındaki alt-tabakanın soyulabilir. Alt-tabaka, mekanik özelliklerinde önemli değişiklikler göstermeden 2 hafta boyunca oda sıcaklığında bir Petri kabındaki tutulabilir.
   8. Çap olarak yaklaşık 4 mm lik bir son boyutuna sahip bir Petri kabındaki (01:20 oranı ile bir PDMS sertleştirme maddesi) ve 80 ° C'de (Şekil 5B), 2 saat boyunca baş aşağı tedavi PDMS damlacıkları dökün. Bu ankraj özellikler hafta içinde bir Petri kabındaki tutulabilir. NOT: sertleştirme işlemi sırasında düzleşme gelen düşüşlerini önlemek için ters çanak koruyun.
   9. Hava plazma tedavi (30 W 30 sn) yüzey ve 8 ankraj özellikleri. Alt-tabakanın (Şekil 5C) üzerinde bulunan kare şeklindeki girintisi 4 mm bir mesafede alt-tabakanın her iki ucundaki özellikleri bağlayın.
2. Üzerinde Kelepçe Membran Montaj
   1. Kelepçelerin oluklu silindirik kısmı çevresinde alt-tabakanın her iki ucunda sarın ve üstten 2 ayar vidaları (Şekil 2B ve Şekil 5D-E) ile yerine sabitleyin.
   2. Kelepçe tutucuya 4 kelepçeler vida ve bir tek t kullanarak PDMS (oran 1:20) dökmekalt-tabaka ve kelepçeler yivli silindir kısmı arasındaki ara yüzde ransfer pipet. 1.5 mm altıgen anahtarı kullanarak yivli silindirik parçası etrafında sertleşmemiş PDMS yayıldı.
   3. Tamamen kılcal hareket ile doldurulmuş ve 2 saat (Şekil 5F), 80 ° C de montaj tedavi kadar oluklarından PDMS (1:20) dökün.
3. Membran Hücreler tohumlama
   1. Hava plazma muamele (30 W 30 saniye) kolajen kaplamaya izin vermek için alt-tabaka ve sterilize işlevselleştirilmesi bütün düzeneği.
   2. Hücreler, 1 saat boyunca oda sıcaklığında fare kuyruk kolajeni ve 16 ug / ml ile takviye edilmiş, 0.02 M asetik asit içinde, 1 ml ile tohumlanmış edilecek alt-tabakanın alanı işlevselleştirilmesi. Istenen son kollajenizasyon 5 ug / cm ^{2 'dir.}
   3. Fosfat tampon maddesi ile alt-tabaka 3 kez yıkayın ve bu, oda sıcaklığında kuru, en az 10 dakika boyunca için sağlar.
   4. % 10 fetal sığır tenan ile takviyeli kültür ortamında 40 ul eklem ve 1 ^cm2'lik bir alanı kapsayacak şekilde, substratın orta kısmında 2000 hücreleri ihtiva eden,% 1 penisilin-streptomisin (hücre yoğunluğu: 20 hücre / mm ^2). Hücre yoğunluğu deneysel ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
   5. Alt-tabaka üzerinde hücreleri ihtiva eden kültür ortamı içinde damla ile yukarı bakacak şekilde, standart hücre kültür inkübatörü içinde bütün montaj koyun. NOT: montaj tabaka hücreleri sıkıca takmak için izin en az 3 saat boyunca yukarı bakacak şekilde tutulmalıdır. Buharlaşmayı önlemek için, sıcak bir kültür ortamının 30 ul alt tabaka üzerindeki damla 3 saat için her 45 dakika içinde ilave edilir.
   6. 3 saat sonra, alt-tabakanın daldırın ve hücreler çoğalmaya izin vermek için bir gece boyunca inkübasyona taze kültür ortamı ile doldurulmuş bir Petri çanağı içine bütün montaj çevirin.
   7. Ertesi gün, HEPES-tamponlu tuz çözeltisi (HBSS hazırlanması, Hepes, NaCl 120 mM, KCl 5.3 mM, MgSO _4, 0.8 mM, _CaCI2 1.8 mM, ve DE 11.1 mM ile 20 mMxtrose). PH'ı 7.4 'e ayarlayın. NOT: HBSS çözeltisi günlük olarak hazırlandı ve deney esnasında 37 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir. Bu fizyolojik çözelti, normal doku / kan ortamı taklit ile mikroskop sahnede hücreleri korumak için kullanılır.
   8. Ters faz kontrast veya floresan mikroskop Dağı BAXS platformu ve motor üzerinde kelepçe-tabaka montaj on set-up monte edin. HEPES tamponu (Şekil 2B) olan Petri çanağı içine ısıtıcı Petri kabı doldurun.

Küçük Kalibre Gemiler 2. Sertlik Ölçüm

1. Hazırlık
   1. Krebs fizyolojik çözelti: 118.1 mM NaCI, 11.1 mM D-glikoz, 25 mM NaHCO _3, 4.7 mM KCI, 1.2 mM MgSO _4, 1.2 mM KH ₂ PO ₄ ve 2.5 mM _CaCl2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. PH'ı 7.4 'e ayarlayın ve 30 dakika karbojen tıbbi gaz (% 95 O _{2/5% CO2)} ile çözüm oksijen. NOT: Krebs solutigünlük hazırlanır ve deney esnasında 37 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir. Bu fizyolojik çözelti, normal doku / kan ortamı taklit ederek canlı dokuları korumak için kullanılır.
   2. Cerrahi makas, bükülmüş cımbız, mikro-makas, cerrahi diseksiyon mikroskop, 50 ml polipropilen santrifüj tüpleri, ve 10 ml serolojik pipet: diseksiyonu ve aort damarlarının mekanik değerlendirilmesi için enstrümantasyon toplayın. Cerrahi ve deney prosedürü herhangi bir steril koşullar gerekmez. Önceden yük hücresi ile birlikte BAXS platformun kelepçeler monte edin.
2. Doku İzolasyon ve Diseksiyon
   Laboratuvar hayvanları içeren tüm deneysel prosedürleri ülke 'kullanıcıların Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi ile uyumludur kurum,' kullanıcı Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış olması gerekir.
   1. % 99 CO ₂ inhalasyon ile fare ötenazi gerçekleştirin (7 psi)Bir pleksiglas odası (Şekil 6A) içinde.
   2. Açık fare karın ve fareyi kanamaya aorta kesti.
   3. Diyafram, göğüs kafesi ve akciğer lobları (Şekil 6B) sökün. NOT: dokuya zarar riskini en aza indirmek aorta bağlı kalp tutmak ve doğrudan damar dokunmaktan kaçının ama kalbi kullanarak işlemek için.
   4. Nazikçe gemi ve omurga arasındaki kesim tarafından kalp, aort kökü ve aorta çıkarın. NOT: doku bozulmamış (Şekil 6C) iç yapısını korumak için eksizyonu sırasında geminin herhangi bir uzama kusturmayın.
   5. Hemen batırmak ve Krebs çözeltisi içinde kalp ve aort tutun.
   6. Kes ve dikkatle herhangi bir kan pıhtıları uzaklaştırmak için Krebs çözeltisi içinde aorta yıkayın. Mikro-makas, cımbız ve cerrahi mikroskop (Şekil 6D-E) kullanılarak bağ dokusu kaldırmak. NOT: Tüm damar uzunluğu tutun ve AOR kullanındamar yönünü belirlemek için tik kök.
3. Gemi Boyut Belirlenmesi ve Montaj
   Kabın sertliğini belirlemek için, boş kap boyutları gerekmektedir ve kalibre edilmiş bir mikroskopla saptanabilir.
   1. Uzunluğu yaklaşık 2 mm arasında bir aort halkası kesin ve hassas bir şekilde (Şekil 6F-G) ayar kalibre edilmiş bir mikroskop kullanarak uzunluğunu ölçer. Krebs çözeltisi içinde kenara bu segmenti koydu.
   2. 2 mm kesimleri (Şekil 6F) her biri arasında, mümkün olduğu kadar küçük bir aortik halka kesin. Lümen yukarı bakacak şekilde bir mikroskop cam slayt üzerinde bu küçük kesimi koyun ve bir kalibre mikroskop ayarı (Şekil 6H) kullanarak duvar kalınlığı ölçmek.
   3. Krebs çözeltisi ile BAXS platformu üzerinde Petri kabı doldurup (Şekil 4C'de ek), çekme iğneler üzerinde 2 mm aort halka segmenti yerleştirin.

ge = "always">
Kür sonra Şekil 5. PDMS substrat imalat ve montaj. A), alt tabaka dikkatlice SU-8 2050 kalıp soyulmuş ve. B) PDMS'nin yapılmış özelliklerini Sabitleştirilmesi Petri kabındaki bir kenara koymak ve üzerindeki tabakayı korumak için yardımcı olduğunu 4 kelepçeler üzerine monte alt tabakanın alt tabaka daha sonra kelepçe tutucu üzerine monte edilmiş 4 kelepçeler, (inset bakınız) üzerine monte edilir. D) montaj için hazır özellikleri ankraj ile kelepçeleri. C) Yüzey. E) Ayrıntılı resim. F alt-tabaka altında oluk PDMS dökme) Prosedür. Ok, yavaş yavaş kılcallık ile oluğu dolduran PDMS gösterir.

454fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 6. Hazırlanması ve torakal aort izolasyon. A) uzunlamasına bir insizyon sayesinde cerrahi aletler ve ötenazi fare. B) hazırlanması, toraks ve akciğer lobs kaldırılır. C) aort dikkatle işlemek için kalp kullanılarak kaldırılır doku. D) kalp ve aort Krebs fizyolojik çözelti konur. Aort, tüm bağ dokuları kaldırarak temizlenir. Kalınlığı ölçümü için kullanılan küçük kesimleri ile birlikte sertlik değerlendirmesi için kullanılan kalp ve aort. F) Aort segmenti. GH) kesin uzunluğu (G) ve kalınlığını gösteren E) Detay resim (H) Her damar kesimleri ters bir mikroskop ve analiz programı kullanılarak değerlendirilmiştir.

Sonuçlar

Esneme Hücre

BAXS platformu tek bir fare miyoblast hücrelerinde çekirdeğin mekanik yanıtını (C2C12)% 25 bir alt-tabaka deformasyona maruz araştırmak için kullanıldı. Miyoblast hücreleri, kas dokusunda bulunan ve sürekli olarak, in vivo olarak, mekanik gerilme ve sıkıştırma maruz kalmaktadır. , Hücre çekirdeğinin şekli ve mekanik özellikleri gen ifadesi ve transkripsiyon aktivitesi ^20,21 düzenlenmesinde ve gelişimsel bozukluklar v...

Tartışmalar

Burada sunulan BAXS platformu tek hücre incelemelerden bütün dokulara, mechanobiology çalışmada çeşitli deneyler kolaylaştırır. Buna ek olarak, çok sayıda platformu, mekanik uyarma deneyleri ve çok eksenli gerilme testi için izin veren, son derece esnek ve yapılandırılabilir. Platform ayrıca, fizyolojik koşullar hücre ve dokuların bakımı sağlayan ve germe deneyler sırasında aynı anda mikroskopi için izin verir. Montaj kelepçeleri uygun bir dizi kullanırken, önceki bölümlerde açıklanan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your
FluoSpheres fluorescent microspheres	Invitrogen	F8810	Keep away from light.
Linear voice coil	Moticont	LVCM-051-051-01	The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide	Edmund Optics	NT37-360	Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage	Edmund Optics	38-960	Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder	GSI microE systems	Mercury II 1600S - 0.5um resolution	reflective incremental encoder.
Motion controller	Galil	DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440	4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell	Honeywell	31 low	miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm)	Pin Service Austerlitz Insect pins		Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050	Micro Chem	SU-8 2050	Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system	Glowresearch		Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen	Invitrogen	A10483-01	Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342	Invitrogen	R37605	DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters	omega.ca	KHLV-0504/(10)-P	28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers	omega.ca	CN63200-R1-LV	Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium	Hyclone	SH3024301	Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin	Hyclone	SV30010	Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH3039603C	Keep frozen.
Trypsin 0.05%	Hyclone	SH30236.02	Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes	Wisent Inc	330-050-EL	HEPES-buffered salt solution
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2	Fisher Scientific	C614-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose	Fisher Scientific	BP220-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1	Krebs physiological solution
KH2PO4	Fisher Scientific	BP362-500	Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2	Lindle	DIN:02154749	Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole	Sigma	M1404	Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D	Sigma	C8273	Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC	Sigma	F3777	Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain	Fluka	43665	Used to stain and quantify collagen content