שיטת In Vivo להערכת את מחסום הדם-הבטן ואת חילוף החומרים בכבד של מוצרים Microbiota

Summary

הגישה של חומרים מזינים, microbiota מטבוליטים ותרופות אל מחזור הדם נשלטת על ידי למכשול בטן-דם (GBB). אנו מתארים שיטה ישירה למדידת ה GBB חדירות ויוו, אשר, בניגוד נפוץ שיטות עקיפות, כמעט אינה מושפעת פונקציות כבד וכליות.

Abstract

למכשול בטן-דם (GBB) שולט המעבר של חומרים מזינים, חיידקי מטבוליטים וסמים של לומן מעיים למחזור הדם. שלמות GBB מופר מחלות מערכת העיכול, לב וכלי דם, חילוף החומרים, והתוצאה עשויה להיות גישה קלה יותר של חומרים פעילים ביולוגית, כגון מטבוליטים חיידקי המעיים, למחזור הדם. לפיכך, החדירות של GBB עשויות להיות סמן של מחלות מעיים והן extraintestinal. יתר על כן, החדירה מוגברת של מטבוליטים חיידקי עלולה להשפיע על תפקודו של האורגניזם כולו.

שיטות נפוצות ללמוד את החדירות GBB הן בביצוע ex-vivo. הדיוק של שיטות אלה הוא מוגבל, כי תפקוד GBB תלוי זרימת הדם במעיים. מצד שני, השיטות הנפוצות ויוו עלול להיות מוטה על ידי הכבד וביצועים הכליה, כמו שיטות אלה מבוססות על הערכה של שתן או / וריכוזי הדם ההיקפיים של סמנים אקסוגני. כאן, אנו מציגים מדידה ישירה של חדירות GBB בחולדות באמצעות ויוו שיטה המבוססת על פורטל דם הדגימה, אשר שומר על זרימת דם במעיים, כמעט אינה מושפעת על-ידי הפונקציה כבד וכליות.

קטטרים פוליאוריתן מוכנסים לתוך וריד שער הכבד, הכלילי מעל ולשננו הוורידים הנהרות. דם נדגמים ב בסיסית ואחרי הניהול של סמן שנבחרו לתוך חלק מערכת העיכול הרצוי. כאן, אנו מציגים מספר יישומים של השיטה כולל (1) הערכה של חדירות המעי הגס TMA, מטבוליט חיידקי המעיים, (2) הערכת הכבד סיקול TMA, ו (3) הערכת שביל דם דם-הכבד-ציוד היקפי בטן-פורטל של הבטן חיידקים-derived קצר-שרשרת חומצות שומן. יתר על כן, הפרוטוקול עשוי לשמש גם עבור מעקב אחר הספיגה במעיים מטבוליזם בכבד של סמים או מדידות לחץ דם הפורטל.

Introduction

מחסום הדם-בטן (GBB), הידוע גם בשם המכשול במעיים, היא מערכת מרובת שכבות מורכבות שמפריד לומן מעיים מזרם הדם על מנת להגביל את המעבר של תרכובות מזיקות תוך מתן אפשרות ספיגת חומרים מזינים¹. הוא מורכב שלושה רבדים מרכזיים: שכבת ריר, אפיתל פרופריה. מוסקולריס.

גורמים רבים עשוי להשפיע על GBB תקינות ותפקוד². הוכח כי GBB מופר מחלות במערכת העיכול והן extraintestinal, כולל מחלות לב וכלי דם וחילוף³, דבר שעלול להוביל מעבר מוגבר של מטבוליטים חיידקי המעיים עד למחזור הדם⁴. חדירה מוגברת של מטבוליטים חיידקי המעיים עלול להשפיע על תפקודו של האורגניזם כולו. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו השפעה משמעותית של מטבוליטים חיידקים, כגון indoles, H2S, קצר-שרשרת חומצות שומן (SCFA) ו- trimethylamine N-תחמוצת, על מערכת הדם פונקציות^{5,6,7 ,8,9}. בסופו של דבר, שהוא הוצע כי חדירות GBB מוגברת עשוי לשמש סמן של מחלות לב וכלי דם וחילוף אשר משויכים שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים המעיים¹⁰. לכן, מעקב אחר מסלול בטן-פורטל דם דם-הכבד-מערכתית של מטבוליטים חיידקי יכול להיות מעניין עבור מדעי בסיסי וקליני.

בדרך כלל שימוש בשיטות אקספרימנטליות על ההערכה של חדירות GBB הן בביצוע במבחנה באמצעות מקטעים מעיים resected, שברי רירית או פקיעת קרומים מלאכותית^11,12. הדיוק של שיטות אלה נפרצת על ידי העובדה כי התפקוד התקין של GBB דורש זרימת הדם במעיים מתמדת. מצד שני, השיטות הזמינות ויוו מבוססים על הערכת שתן או דם היקפיים ריכוזים של סמנים אקסוגני¹³. אולם, ריכוז הדם והשתן היקפיים של תרכובות אקסוגני מושפעת על ידי תפקוד הכליות, קרי, סינון glomerular קצב הפרשת צינורי, כמו גם על ידי מטבוליזם בכבד, קרי, קודם לעבור מטבוליזם. שני הפרמטרים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין נושאי הלימוד ללא תלות הפונקציה GBB.

מאמר זה מתאר מדידה ישירה של החדירות GBB בחולדות באמצעות לקיחת דמים הפורטל. בשיטה זו אין ויוו משמרת את זרימת הדם במעיים של כמעט לא מושפע על ידי תפקוד כבד וכליות. הגישה המתוארת לא נפוץ, ואולי בגלל קשיים מתודולוגיים. נתאר בפירוט את צנתור של וריד שער הכבד, הכלילי מעל המפגש וריד הכבד. לקיחת דמים וריד שער הכבד, הכלילי מאפשרת הערכה של סיקול חדירות והכבד GBB וכן מעקב של דם דם-הכבד-מערכתית בטן-פורטל מסלול של מולקולות של עניין, כגון מטבוליטים חיידקי המעיים או תרופות. אנו מציגים גם מספר יישומים של השיטה שנבדקו במעבדה שלנו. אלה כוללים הערכת חדירות המעי הגס כדי TMA, מטבוליט חיידקי המעיים, הערכה של הכבד סיקול TMA וכן הערכה של שביל דם דם-הכבד-מערכתית של פורטל הבטן של SCFA.

כדי להעריך את מחסום הדם-בטן חדירות, בשלבים הבאים פרוטוקול צריכה להיות מלווה, סדר: 1 (ההכנסה של הקו עבור מינהל intraintestinal), 3 (צנתור וריד שער), 4 (וריד שער לקיחת דמים ), 6 (מינהלה של סמן חדירות מעיים), 4.

כדי להעריך את סיווג בכבד, שביל דם דם-הכבד-מערכתית בטן-פורטל, בשלבים הבאים פרוטוקול צריכה להיות מלווה, סדר: 1 (ההכנסה של הקו עבור מינהל intraintestinal), 2 (הכלילי צנתור), 3 (צנתור וריד שער), 4 (לקיחת דמים וריד שער), 5 (דיגום הדם הכלילי), 6 (מינהלה של סמן חדירות מעיים), 4, 5, 7 ( החישוב של סיווג בכבד).

Protocol

הניסויים נערכו על עכברים קיוטו Wistar זכר על פי הוראה 2010/63 האיחוד האירופי בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות ואושרו על-ידי ועד מקומי Bioethical בוורשה I.

1. ההכנסה של הקו עבור ניהול Intraintestinal

הערה: כאן אנו מציעים ניהול intracolonic של סמן באמצעות קטטר. ניתן לשנות אותה על-ידי המינהל אוראלי או gavage ברמות שונות של מערכת העיכול כגון בקיבה או בתריסריון. זכור להשתמש בגדים כירורגי חד פעמיות, כולל שמלת כירורגי, מכסה המנוע, כפפות, ולהבטיח לעקוב את אמצעי זהירות הקשורות בכלים חדים המשמש בניתוח (מחטים, וכו ') במהלך הליכי 1-6.

1. חיות מהירות בין לילה לפני ההליך. לבצע את כל ההליכים במהלך הרדמה כללית, קרי, מתקבל על ידי הזרקה של urethane 1.5 g/kg bw i.p. להעריך נכונה ההרדמה היעדרה של רפלקסים palpebral של הקרנית, ועל ידי שיטה הבוהן-קורט, זנב-קמצוץ.
2. להשתמש צנתר פולי רפואת ילדים (10F או 8F) צנתר שטיפה. סמן את הצנתר כדי לציין את החלק שיתווספו לתוך המעי הגס (כ- 8 ס"מ).
3. בדוק את אזור פי הטבעת לבין תוכן צואה בחלחולת לפני החדרת הקטטר לתוך המעי הגס. אם הצואה, רוקן החלחולת על ידי מעסה את אזור פי הטבעת.
4. לשים סיכה (למשל גליצרין או וזלין) לאורך הצנתר. להרטיב את פי הטבעת וסביבתו עם הסיכה.
5. הכנס את הקטטר עם ס מ חוט כ 8 מדריך דרך הסוגר האנלי חיצוניים. להפוך קדימה-אחורה איטי ותנועות מעגליות.
   הערה: לשמור על בדיקת המיקום של הצנתר על ידי מישוש הבטן תוך כדי החדרת הקטטר.

2. הכלילי צנתור

1. לגלח פרווה במפשעה. לסירוגין לחטא את העור עם אלכוהול, povidone יוד 3 פעמים, לכסות את האזור המפשעה וילונות כירורגי.
2. נסה להרגיש את הדופק על עורק הירך לחתוך את העור longitudinally לאורך של 2.0 ס מ במקום איפה הדופק מוחשי.
3. לנתח את fascia ואת השרירים כדי להמחיש את הצרור נוירו-וסקולריים.
4. לנתח את וריד הירך מ הצרור נוירו-וסקולריים: העצבים הראשון, ולאחר מכן עורק הירך, ולאחר מכן את הווריד.
   הערה: להיות זהירים בזמן של הקיבוץ נוירו-וסקולריים, מאז זעירים ענפי וריד הירך בקלות פגום, בהפקת דימום.
5. לשים שני ליגטורות על הווריד של הירך. לא לקשור את הקשרים עדיין. לתפוס את קצוות קשירה צינתור עם בעל מחט.
6. משוך בזהירות את הקצוות קשירה עם המחזיק כלפי מעלה כדי לסגור חלק הווריד הפרוקסימלית. המתן עד הווריד מלאה דם, אותה יקדש דיסטלי.
7. עושים חתך קטן (ca. 1 מ מ) על הווריד של בין קשר קשירה צינתור, באמצעות מספריים השתלה. הכנס את הצנתר באמצעות פינצטה או את המחט עם הסוף מעוקל.
   הערה: לנקב את הווריד ולהשתמש קצה המחט גהר כמדריך עבור הצנתר. שחרר את הקשירה proximal תוך החדרת הקטטר. הכנס את הצנתר עבור 6-7.0 ס מ.
8. אבטח את הקטטר. את תקחי את הירך עם שני קשרים כירורגי יחיד. לקשור את הקשירה מקורב גם כן.
9. בדוק patency של הצנתר על ידי ניסיון להוציא דם עם מזרק. יש לשטוף את הקטטר עם mL 0.3 של מלוחים heparinized (100 יחידות/mL).
10. לסגור את הפצע כירורגית עם שתי שכבות של תפרים יחיד.

3. וריד שער צנתור

איור 1 : פורטל קטטר. הקטטר פורטל מורכב מחט OD: 0.9 מ מ באורך של 25.0 מ"מ [A], OD קטטר פוליאוריתן גמיש: 0.025", אורך כ- 100.0 מ מ [B], טיפ פוליאתילן גמיש של הקטטר OD: 0.040 ", כ 15.0 מ מ ארוך [C], פקק [D]. , ואת קשירה 3/0 עם אורך של 100.0 מ"מ [E]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. הכינו את הצנתר הפורטל על פי איור 1.
   1. להוסיף בסוף לחתוך המחט (OD: 9 מ מ) לתוך הצנתר פוליאוריתן OD: 0.025".
   2. לקשור את קשירה 3/0 בצומת של המחט, קטטר.
      הערה: ודא כי החלק הארוך יותר של קשירה לפחות באורך 6 ס מ.
   3. להוסיף בסוף הצנתר OD: 0.025" לתוך הצנתר פוליאתילן OD: 0.040".
   4. סגור את הקטטר עם פקק מתכת או פלסטיק.
2. קו האמצע פתיחת בטן
   1. לגלח פרווה בבטן לסירוגין לחטא את העור עם אלכוהול, povidone יוד 3 פעמים, לכסות את האזור עם וילונות כירורגי.
   2. חותכים את העור longitudinally מן מצאתי של עצם החזה על הטבור.
   3. חותכים את שרירי לקיר הבטן לאורך הקו הלבן.
   4. להרחיב את החתך rostrally בצורת Y כך הסחוס xiphoid היא בין שני חתכים.
3. וריד שער הכבד לנתיחה
   1. להרטיב הושארו כירורגית עם תמיסת מלח.
   2. Exteriorize את לולאת המעי האטום, בסדר עולה של המעי הגס, והמעי הדק. לשים את המעיים בצד שמאל כדי לחשוף את שורש מצע המעי.
      הערה: לכסות את המעיים עם גזה סוידיש של תמיסת מלח פיזיולוגית על המעיים מפני התייבשות.
   3. לחשוף את וריד שער הכבד, בזהירות להזיז את אונות הכבד לצדדים או כלפי מעלה כלפי הסרעפת עם הושארו בטעימת.
   4. להתאים את החלק של וריד שער הכבד שאינה מכוסה עם מצע המעי (ב hilum הכבד, ארוכה כ- 5 מ"מ) ולהעביר את קשירה 3/0 (אורכו 15 ס מ) תחת וריד שער הכבד.
      הערה: כדי להגן על רקמות מפני נזק תוך הצבת את הקשירה, להרטיב את הקשירה עם פתרון תמיסת מלח פיזיולוגית.
   5. הצמד את קצות קשירה עם מלקחיים והדק את זה בעדינות כדי לייצב את כלי הקיבול.
4. הכניסה וייצוב של הקטטר
   1. להעביר את החלק הארוך יותר של הקשירה של הקטטר פורטל תחת החלק חינם של וריד שער הכבד, ומשוך אותו כך הקטטר הינו ממוקם ממש ליד וריד שער הכבד.
   2. הכנס את המחט לתוך וריד מצע המעי העליון העליון 3 מ מ מתחת לצומת של וריד מצע המעי העליון העליון, וריד שער הכבד. . תחזיקי את המחט בזווית של 30 מעלות, לאחר הזנת לווריד, להקטין את הזווית ולקדם את המחט כמעט אופקית, במקביל וריד שער הכבד.
      הערה: את המחט על אורך של 6-7 מ מ. קשירה המייצבת צריך בעדינות להדק את וריד שער הכבד תוך החדרת הקטטר.
   3. 1-2 טיפות של רקמות דבק במקום איפה המחט מוחדרת להחיל. הסר הושארו שמכסים את הכבד.
   4. לשים את המעיים בחזרה לתוך חלל הבטן.
   5. להרטיב את המעיים עם תמיסת ומחוממת למעלה ומכסים אותו עם בטעימת גזה סטרילית.
   6. בדוק patency של הקטטר ולשטוף את הקטטר עם mL 0.3 של מלוחים heparinized (100 יחידות/mL).
      הערה: דם ורידי באופן ספונטני backflows הקטטר.
5. הסוף של הניתוח
   1. לאחר 5 דקות, לבדוק את הצבע של תנועות ממברנות והמעיים, ודא זרימת הדם מצע המעי העליון הנכונה תישמר.
   2. לסגור את חלל הבטן עם תפרים 3: קיר צפק עם השכבה הפנימית של שרירי דופן הבטן - בתפר מתמשך, שנספג; שרירי הנותרים לקיר הבטן - בתפר מתמשך, שנספג; לעור ולרקמה התת-עורית - יחיד, נספגים התפרים.
      הערה: Exteriorize החלק הדיסטלי של הקטטר סביב הטבור.

4. וריד שער דם הדגימה

1. דגימת דם וריד שער בזמנים לפי הפרוטוקול בדיקות ספציפיות להשתמש; ראה טבלה 1.

פרוטוקול קצר	פרוטוקול ארוך
t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה)	t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה)
t1 – 5 דקות לאחר intracolonic ניהול	t1 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול
t2 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול	t2 – 60 דקות לאחר intracolonic ניהול

טבלה 1: פורטל דם הדגימה פרוטוקולים להערכת חדירות מעיים.

הערה: הזמן בין לקיחת דמים רציפים תלויה בעיקר הביולוגית של החומרים שנבדקו, באתר של המינהל (המעי הגס, קיבה, וכו ').

2. פתח את הפקק קטטר פורטל, תנו לדמם לזרום בחופשיות.
3. שימוש במזרק (כרך 2 מ"ל), להקהות את המחט OD: 0.9 מ"מ. לאסוף יותר מ 0.7 מ של דם.
4. לשטוף את הצנתר 0.3 מ ל תמיסת heparinized (100 יחידות/mL) וסגור את התקע קטטר.

5. נחות Vena Cava דם הדגימה

1. דגימת הדם הכלילי בזמנים לפי הפרוטוקול בדיקות ספציפיות להשתמש; עיין בטבלה 2.

וריד שער	הכלילי
t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה)	t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה)
t1 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול	t1 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול

טבלה 2: פרוטוקול של דם הדגימה למדידה סיווג כבד ומעקב אחר השביל בטן-פורטל דם דם-הכבד-מערכתית.

2. פתח את הפקק קטטר הכלילי, תנו לדמם לזרום בחופשיות.
3. לאסוף יותר מ 0.7 מ של דם באמצעות מזרק (כרך 2 מ"ל) ושבר המחט OD: מ מ.
4. לשטוף את הקטטר עם 0.2-0.3 מ ל heparinized מלוחים (100 יחידות/mL) ולסגור את הפקק קטטר.

6. ניהול של סמן חדירות מעיים

1. הסר את החוט, לנפח את הבלון צנתר שטיפה, באמצעות אחסון נאותים של מים סטריליים (בדרך כלל 1 מ"ל, אך בדיקת גודל בלון בפועל לפני ההוספה).
   הערה: הקוטר בלון לא יעלה על 1 ס מ.
2. מניחים את ראש עכברוש (הנטייה כ 15%) כדי למזער את הסיכון של זרימה יוצאת של הפתרון המנוהל של המעי הגס.
3. לאט לאט לנהל את החומר שנבדקו (למשל trimethylamine, 100 מ"ג/ק"ג bw) באמצעות יציאת ניקוז ב צנתר שטיפה.
   הערה: לא יעלה על היקף 0.75 מ של הפתרון המנוהל ומהירות האכלה של 0.5 mL/min כדי למנוע זרימה יוצאת של הפתרון המנוהל מפי-הטבעת.
4. לאחר 10 דקות השטחת קצה הבלון קטטר.
5. דגימת הדם הכלילי התחתון, וריד שער הכבד לפי הפרוטוקול בדיקות ספציפיות להשתמש; ראה טבלה 1 בטבלה 2.
6. המתת חסד חיה באמצעות שיטת שאושרו.

7. חישוב של סיווג כבד

1. אקספרס אישור בכבד, להבנה כמו חילוץ הכבד, ההבדל בין ריכוז הדם פורטל ריכוז הדם הכלילי או על ידי היחס של הכלילי כדי ריכוז הדם הפורטל, (1 - (ריכוז הכלילי / ריכוז וריד שער)).

8. הערכה של הדגימות דם n מבחן ריכוז חומר

1. בהתאם לחומר הבחינה מתודולוגיית הבדיקה, נושא את הדגימה נהלי המעבדה המתאימה (צנטריפוגה, וכו '). ב הפרוטוקולים המוצע, נוכל להעריך TMA/TMAO וריכוז SCFA באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם טריפל-פאול ספקטרומטר מסה. בבקשה למצוא תיאור מפורט של השיטה בחומר משלימה.

תוצאות

בהצלחה מדדנו את GBB חדירות והכבד הסיווג של TMA בחולדות. הראו שיש חולדות עם יתר לחץ דם חדירות המעי הגס מוגברת כדי TMA בהשוואה חולדות normotensive (איור 2)⁴. במחקר אחר מצאנו את צריכת המלח גבוהה אינה משפיעה על סיווג חדירות ולכבד את GBB TMA (איור 3)...

Discussion

ה תיאר ישירה, ויוו, שיטת מדידה את החדירות GBB שומרת closetophysiological תנאים במערכת העיכול (משמר את זרימת הדם מעיים), ואני כמעט לא מושפע על ידי תפקוד כבד וכליות.

השלב הקריטי של טכניקה זו היא החדרת הקטטר הפורטל. זה חייב להעשות בעדינות ובהחלטיות באותו זמן. קל, קצר הדימום עלול להתרחש מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needle OD: 9 mm	Becton Dickinson  S.A.	301300
Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-40
Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-25
C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD	Cole-Parmer Instrument Co.	06424-59
Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F)	Sigmed	0000 80305
Surgical ligatures 3/0	Yavo Sp. Z o.o.	P48JE
Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0	KRUUSE Polska Sp. Zo.o.	152336
Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive	Loctite	1370127
Povidone iodine	EGIS Pharmaceuticals PLC	4449 11
Heparin - Heparinium WZF	WZF Polfa S.A.	02BK0417	Dilute 10 times with physiological saline
Glycerin 86%	Laboratorium Farmaceutyczne Avena	5.90999E+12	Serves as a lubricant in colon catheterization
Xylocaine 2%	AstraZenca	9941342
Urethane	Sigma-Aldrich (Merck)	U2500-500G
Trimethylamine solution 45%	Sigma-Aldrich (Merck)	92262-1L
Syringes 2 mL	B.Braun Melsungen AG	4606027V
Saline 250 mL	Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o.	15LL707WL
Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends	Braun	NS-010-115-PKM
Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 "	Braun	KN-008-140-ZMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55	Braun	PO-001-007-ZMK
Micro Scissors type Vannas,  straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm	Braun	NO-010-085-PMK
Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8"	Braun	HO-128-130-PMK
Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2	Braun	IM-927-150-PZMK
Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp	Braun	NO-052-110-PMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp	Braun	PO-022-001-PMK