Um método In Vivo para avaliar a barreira de sangue do intestino e metabolismo hepático da Microbiota produtos

Resumo

O acesso de nutrientes, metabólitos da microbiota e medicamentos para a circulação é controlado pela barreira sangue-intestino (GBB). Nós descrevemos um método direto para medir a GBB permeabilidade na vivo, que, em contraste com comumente usados métodos indirectos, praticamente não é afetado pelas funções de fígado e rim.

Resumo

A barreira de sangue do intestino (GBB) controla a passagem de nutrientes, metabólitos bacterianos e drogas do lúmen intestinal para a corrente sanguínea. A integridade do GBB é perturbada em doenças gastrointestinais, cardiovasculares e metabólicas, que podem resultar em facilitar o acesso de compostos biologicamente ativos, tais como metabólitos bacteriano do intestino, para a corrente sanguínea. Assim, a permeabilidade do GBB pode ser um marcador de doenças intestinais e extra-intestinais. Além disso, o aumento da penetração dos metabolitos bacterianos pode afetar o funcionamento de todo o organismo.

Métodos comumente usados para estudar a permeabilidade GBB são realizados ex vivo. A precisão desses métodos é limitada, porque o funcionamento do GBB depende do fluxo sanguíneo intestinal. Por outro lado, métodos comumente usados na vivo podem ser tendenciosa pelo fígado e rim, como esses métodos baseiam-se na avaliação da urina ou / e as concentrações no sangue periférico de marcadores exógenos. Aqui, apresentamos uma medida direta da permeabilidade GBB em ratos utilizando um método na vivo baseado no sangue portal de amostragem, que preserva o fluxo sanguíneo intestinal e praticamente não é afetada pela função hepática e renal.

Cateteres de poliuretano são inseridos a veia porta e veia cava inferior logo acima o hepático veias confluência. Sangue é amostrado na linha de base e após a administração de um marcador selecionado em uma parte desejada do tracto gastrointestinal. Aqui, apresentamos várias aplicações do método incluindo (1) avaliação da permeabilidade do cólon para TMA, um metabólito bacterianos de intestino, (2) avaliação do fígado de apuramento de TMA e (3) avaliação de um caminho de sangue de sangue-fígado-periférico de intestino-portal do intestino bactérias-derivado curta cadeia de ácidos graxos. Além disso, o protocolo também pode ser usado para controlar a absorção intestinal e o metabolismo do fígado de drogas ou para medições de pressão portal.

Introdução

A barreira de sangue do intestino (GBB), também conhecida como a barreira intestinal, é um complexo sistema de multicamadas que separa o lúmen do intestino pela corrente sanguínea a fim de limitar a passagem de compostos nocivos, permitindo a absorção de nutrientes¹. Consiste de três camadas principais: a camada de muco, epitélio e lâmina própria.

Inúmeros fatores podem afetar o GBB integridade e função². Ficou demonstrado que a GBB é perturbado em doenças gastrointestinais e extra-intestinais, incluindo doenças cardiovasculares e metabólicas³, que pode levar a uma maior passagem de metabólitos bacterianos intestino para a corrente sanguínea⁴. Um aumento da penetração de metabólitos bacterianos intestino pode afetar o funcionamento de todo o organismo. Por exemplo, estudos recentes mostram um impacto significativo de metabólitos bacterianos, tais como indóis, H2S, ácidos graxos de cadeia curta (CCPA) e trimetilamina N-óxido, no sistema circulatório funções^{5,6,7 ,8,9}. Finalmente, foi proposto que um aumento da permeabilidade GBB pode servir como um marcador de doenças cardiovasculares e metabólicas, que são associados com alterações morfológicas e funcionais no intestino¹⁰. Portanto, rastreamento via intestino-portal sangue sangue-fígado-sistêmica dos metabolitos bacterianas pode ser de interesse para as ciências básicas e clínicas.

Comumente utilizados métodos experimentais para a avaliação da permeabilidade GBB são realizados em vitro usando segmentos intestinais ressecados, fragmentos de mucosa, ou membranas artificiais^11,12. A precisão desses métodos é comprometida pelo fato de que o bom funcionamento do GBB requer fluxo sanguíneo intestinal constante. Por outro lado, os métodos disponíveis na vivo baseiam-se na avaliação de urina ou sangue periférico concentrações de marcadores exógenos¹³. No entanto, concentração periférica de sangue e urina de compostos exógenos é influenciada pela função renal, ou seja, a taxa de filtração glomerular e excreção tubular, bem como pelo metabolismo do fígado, ou seja, primeiro passar o metabolismo. Ambos os parâmetros podem diferir significativamente entre sujeitos do estudo independentemente da função GBB.

Este paper descreve uma medida direta da permeabilidade em ratos usando amostragem do sangue portal GBB. Esse método na vivo preserva o fluxo sanguíneo intestinal e praticamente não é influenciado pela função de fígado e rim. A abordagem descrita não é comumente usada, possivelmente por causa de algumas dificuldades metodológicas. Descrevemos em detalhe a cateterização da veia porta e veia cava inferior logo acima da confluência da veia hepática. Colheita de sangue da veia porta e veia cava inferior permite a avaliação da folga GBB permeabilidade e fígado, bem como acompanhamento do percurso de sangue sangue-fígado-sistêmica de intestino-portal de moléculas de interesse, tais como metabólitos bacterianos de intestino ou medicamentos. Apresentamos também várias aplicações do método que foram testadas em nosso laboratório. Estes incluem a avaliação da permeabilidade do cólon para TMA, um metabólito bacterianos de intestino, avaliação do fígado de apuramento de TMA e avaliação de um caminho de sangue sangue-fígado-sistêmica de intestino-portal de CCPA.

Para avaliar a permeabilidade da barreira hemato-intestino, devem ser seguidas as seguintes etapas de protocolo, em ordem: 1 (inserção da linha para as administrações intraintestinal), 3 (cateterização da veia porta), 4 (veia porta de amostra de sangue ), 6 (administração de um marcador de permeabilidade do intestino), 4.

Para avaliar a liberação hepática e um caminho de sangue sangue-fígado-sistêmica de intestino-portal, devem ser seguidas as seguintes etapas de protocolo, em ordem: 1 (inserção da linha para as administrações intraintestinal), 2 (veia cava inferior cateterismo), 3 (cateterização da veia porta), 4 (amostra de sangue da veia porta), 5 (amostra de sangue da veia cava inferior), 6 (administração de um marcador de permeabilidade do intestino), 4, 5, 7 ( cálculo de apuramento de fígado).

Protocolo

Os experimentos foram realizados em ratos machos Wistar Kyoto, de acordo com a Directiva 2010/63 da UE em matéria de protecção dos animais utilizados para fins científicos e foram aprovados pelo I Comitê de Bioética Local em Varsóvia.

1. inserção da linha para administração Intraintestinal

Nota: Aqui propomos intracolonic administração de um marcador usando um cateter. Pode ser modificado por administração oral ou gavagem em vários níveis do aparelho digestivo , por exemplo, estômago ou duodeno. Lembre-se de usar roupas cirúrgicas descartáveis, incluindo avental cirúrgico, capuz e luvas e certifique-se para seguir as precauções de segurança relacionadas com as ferramentas afiadas usadas em cirurgia (agulhas, etc.) durante os procedimentos de 1-6.

1. Animais rápidos durante a noite antes do procedimento. Execute todos os procedimentos durante a anestesia geral, ou seja, obtidas por injeção de uretano 1,5 g/kg bw i.p. avaliação adequada anesthetization pela falta de reflexos palpebrais e corneais e pelo método do dedo do pé-pitada e cauda-pitada.
2. Use um cateter de Foley pediátrico (10F ou 8F) como um cateter do cólon. Marca o cateter para indicar a parte que será inserida dentro do cólon (aproximadamente 8 cm).
3. Verificar o conteúdo de fezes no reto e a região anal antes de inserir o cateter para o cólon. Se houver fezes, esvazie o reto por massageando a área retal.
4. Coloca um lubrificante (por exemplo, glicerina ou vaselina) ao longo do cateter. Umedeça o ânus e seus arredores com o lubrificante.
5. Inserir o cateter com um guia fio aproximadamente 8 cm através do esfíncter anal externo. Faça movimentos lentos para diante-para trás e circulares.
   Nota: Continue verificando a localização do cateter através da palpação abdominal, ao introduzir o cateter.

2. veia Cava cateterismo

1. Raspe o pelo na virilha. Desinfectar a pele com álcool e povidona iodo 3 vezes e cobrir a área da virilha com cirúrgicos alternadamente.
2. Tente sentir o pulso na artéria femoral e cortar a pele no sentido longitudinal para o comprimento de cerca de 2,0 cm no lugar onde o pulso é palpável.
3. Disse a fáscia e os músculos para visualizar o feixe vasculonervoso.
4. Dissecar a veia femoral do feixe vasculonervoso: nervos primeiros, depois a artéria femoral e a veia.
   Nota: Tenha cuidado durante a dissecção do feixe neurovascular, desde pequenos ramos da veia femoral podem ser facilmente danificados, produzindo hemorragia.
5. Colocar duas ligaduras na veia femoral. Não amarre os nós ainda. Pega as pontas da ligadura proximal com um porta-agulha.
6. Com cuidado, puxe as extremidades de ligadura com o titular para cima para fechar a parte proximal da veia. Aguarde até que a veia está cheio de sangue e o nó distal.
7. Faça uma pequena incisão (ca. 1 mm) na veia entre o nó e ligadura proximal, usando uma tesoura microcirúrgica. Inserir o cateter utilizando uma pinça ou a agulha com a extremidade curvada.
   Nota: Punção da veia e use a ponta dobrada da agulha como um guia para o cateter. Afrouxe a ligadura proximal ao introduzir o cateter. Inserir o cateter para 6-7,0 cm.
8. Fixe o cateter na veia femoral com dois nós cirúrgicos único. Amarre a ligadura proximal também.
9. Verificar a permeabilidade do cateter por tentar tirar sangue com uma seringa. Lave o cateter com 0,3 mL de solução salina heparinizada (100 unidades/mL).
10. Feche a ferida cirúrgica com duas camadas de pontos simples.

3. a veia porta cateterismo

Figura 1 : Cateter portal. O portal cateter consiste de uma agulha OD: 0,9 mm com um comprimento de aproximadamente 25,0 mm [A], um cateter de poliuretano flexível OD: 0,025", cerca de 100,0 mm [B] de comprimento, uma ponta de polietileno flexível do cateter OD: 0.040", aproximadamente 15,0 mm de comprimento [C], um plug [D]. e uma ligadura 3/0, com um comprimento de 100,0 mm [E]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Prepare o portal cateter de acordo com a Figura 1.
   1. Insira a extremidade cortada da agulha (OD: 9 milímetros) dentro do cateter de poliuretano OD: 0,025".
   2. Amarre a ligadura 3/0, na junção da agulha e cateter.
      Nota: Certifique-se que a parte mais a ligadura é pelo menos de 6 cm de comprimento.
   3. Insira a extremidade do cateter OD: 0,025" dentro do cateter de polietileno OD: 0,040".
   4. Feche o cateter com um plug de metal ou plástico.
2. Laparotomia mediana
   1. Raspar a pele no abdômen, alternadamente desinfectar a pele com álcool e povidona iodo 3 vezes e cobrir a área com cirúrgicos.
   2. Corte a pele no sentido longitudinal do xifoide do esterno para o umbigo.
   3. Corte os músculos da parede abdominal ao longo da linha branca.
   4. Expanda o corte rostral na forma Y para que a cartilagem xifoide é entre dois cortes.
3. Dissecação de veia porta
   1. Umedeça as zaragatoas cirúrgicas com solução salina.
   2. Exteriorize o loop ceco, ascendente e cólon transverso e intestino delgado. Colocar os intestinos do lado esquerdo para expor a raiz do mesentério.
      Nota: Cobri os intestinos com gaze umedecida com um soro fisiológico para proteger os intestinos de secagem.
   3. Para expor a veia porta, cuidadosamente mova os lóbulos hepáticos para os lados ou para cima para o diafragma com os cotonetes umedecidos.
   4. Localizar a parte da veia portal, o que não é coberta com o mesentério (no hilo hepático, cerca de 5 mm de comprimento) e passar a ligadura 3/0 (cerca de 15 cm), sob a veia porta.
      Nota: Para proteger os tecidos contra danos ao colocar a ligadura, umedeça a ligadura com uma solução de soro fisiológico.
   5. Prenda as extremidades da ligadura com fórceps e aperte-o suavemente para estabilizar o navio.
4. Inserção e estabilização do cateter
   1. Passar a maior parte da ligadura do cateter portal sob a parte livre da veia portal e puxe-o para que o cateter está localizado ao lado da veia portal.
   2. Insira a agulha na veia mesentérica superior 3 mm abaixo da junção da veia mesentérica superior e a veia porta. Segure a agulha em um ângulo de 30° e, depois de entrar na veia, reduzir o ângulo e fazer avançar a agulha quase horizontalmente, em paralelo com a veia porta.
      Nota: Introduza a agulha para um comprimento de cerca de 6-7 mm. A ligadura de estabilização deve delicadamente aperte a veia porta ao introduzir o cateter.
   3. Aplique 1 a 2 gotas de cola de tecido no local onde a agulha é inserida. Remova os cotonetes que cobrem o fígado.
   4. Devolva os intestinos na cavidade abdominal.
   5. Umedeça os intestinos com uma solução salina aquecido e cubra com gaze esterilizada umedecida.
   6. Verificar a permeabilidade do cateter e lavar o cateter com 0,3 mL de solução salina heparinizada (100 unidades/mL).
      Nota: Sangue venoso espontaneamente retornos no cateter.
5. Final da cirurgia
   1. Após 5 minutos, verifique a cor dos intestinos e peristálticas movimentos, certifique-se de que o fluxo sanguíneo mesentérico adequada seja mantido.
   2. Fechar a cavidade abdominal com 3 pontos: parede peritônio com camada interna dos músculos da parede abdominal - uma sutura contínua, absorvível; restantes músculos da parede abdominal - uma sutura contínua, absorvível; pele e tecido subcutâneo - suturas não absorvíveis, único.
      Nota: Exteriorize a parte distal do cateter em torno do umbigo.

4. a veia porta amostragem de sangue

1. Sangue de veia porta amostra às vezes de acordo com o protocolo de teste específico usado; consulte a tabela 1.

Protocolo curto	Protocolo longo
t0 – linha de base (antes da administração de intracolonic)	t0 – linha de base (antes da administração de intracolonic)
t1 – 5 min após a administração de intracolonic	t1 – 30 min após a administração de intracolonic
t2 -30 min após a administração de intracolonic	t2 – 60 min após a administração de intracolonic

Tabela 1: Portal sangue amostragem os protocolos para avaliação de permeabilidade do intestino.

Nota: O tempo entre a colheita de sangue consecutivos depende principalmente a biodisponibilidade das substâncias testadas e o site de administração (cólon, estômago, etc.).

2. Abra a ficha do cateter portal e deixe o fluxo de sangue livremente.
3. Seringa de utilização (Vol. 2 mL) e blunt agulha OD: 0,9 mm. coletar não mais do que 0,7 mL de sangue.
4. Lavar o cateter com 0,3 mL de soro fisiológico heparinizado (100 unidades/mL) e fechar o plugue do cateter.

5. inferior Vena Cava sangue amostragem

1. Sangue de veia cava inferior amostra às vezes de acordo com o protocolo de teste específico usado; consulte a tabela 2.

Veia porta	Veia cava inferior
t0 – linha de base (antes da administração de intracolonic)	t0 – linha de base (antes da administração de intracolonic)
t1 – 30 min após a administração de intracolonic	t1 – 30 min após a administração de intracolonic

Tabela 2: Protocolo de sangue de amostragem para a medida de afastamento do fígado e o caminho do sangue sangue-fígado-sistêmica de intestino-portal de rastreamento.

2. Abrir o plugue de cateter da veia cava inferior e deixe o fluxo de sangue livremente.
3. Coletar não mais do que 0,7 mL de sangue com uma seringa (Vol. 2 mL) e quebrado agulha OD: 0.9mm.
4. Lavar o cateter com 0,2-0,3 mL de heparinizada (100 unidades/mL) e fechar o plugue do cateter.

6. administração de um marcador de permeabilidade do intestino

1. Retire o fio-guia e insuflar o balão do cateter do cólon, usando um volume adequado de água esterilizada (geralmente 1ml mas tamanho do balão real verificação antes da inserção).
   Nota: O diâmetro do balão não deve exceder 1 cm.
2. Coloque a cabeça de rato para baixo (inclinação de cerca de 15%) para minimizar o risco da vazão da solução administrada do cólon.
3. Lentamente, administrar a substância testada (por exemplo, trimetilamina, 100 mg/kg bw) usando uma porta de drenagem no cateter do cólon.
   Nota: Não exceda o volume de 0,75 mL da solução de administrado e a velocidade de alimentação de 0,5 mL/min para impedir a saída da solução administrada do ânus.
4. Depois de 10 min Desinsufle o balão do cateter.
5. Sangue de amostra da veia cava inferior e a veia porta de acordo com o protocolo do teste específico usado; Ver tabela 1 e tabela 2.
6. Eutanásia animal através do método aprovado.

7. cálculo de apuramento de fígado

1. Expressa autorização de fígado, entendida como extração hepática, pela diferença entre a concentração de sangue portal e concentração de sangue da veia cava inferior ou pelo quociente da veia cava inferior, a concentração de sangue portal, (1 - (concentração de veia cava inferior / concentração de veia porta)).

8. avaliação da teste substância concentração n de amostras de sangue

1. Dependendo da substância em estudo e metodologia de teste, sujeito a amostra para procedimentos laboratoriais adequados (centrifugação, etc.). Nos protocolos propostos, avaliamos TMA/TMAO e concentração de CCPA utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa triplo-quadrupolo. Por favor, encontre uma descrição detalhada do método no Material complementar.

Resultados

Medimos com êxito o GBB permeabilidade e fígado apuramento das TMA em ratos. Temos demonstrado que ratos hipertensos têm uma permeabilidade aumentada do cólon para TMA em comparação com ratos normotensos (Figura 2)⁴. Em outro estudo, encontramos que essa alta ingestão de sal não afeta o afastamento de permeabilidade e fígado GBB de TMA (Figura 3)¹⁴.

Discussão

O descrito direto, na vivo, método para medir a permeabilidade GBB mantém condições de closetophysiological no sistema gastrointestinal (preserva o fluxo sanguíneo intestinal) e praticamente não é influenciada pela função de fígado e rim.

O passo fundamental desta técnica é a inserção do cateter de portal. Isso deve ser feito delicadamente e decisivamente ao mesmo tempo. Um sangramento leve, curto pode ocorrer a partir da corretamente realizada punção da veia portal; n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needle OD: 9 mm	Becton Dickinson  S.A.	301300
Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-40
Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-25
C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD	Cole-Parmer Instrument Co.	06424-59
Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F)	Sigmed	0000 80305
Surgical ligatures 3/0	Yavo Sp. Z o.o.	P48JE
Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0	KRUUSE Polska Sp. Zo.o.	152336
Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive	Loctite	1370127
Povidone iodine	EGIS Pharmaceuticals PLC	4449 11
Heparin - Heparinium WZF	WZF Polfa S.A.	02BK0417	Dilute 10 times with physiological saline
Glycerin 86%	Laboratorium Farmaceutyczne Avena	5.90999E+12	Serves as a lubricant in colon catheterization
Xylocaine 2%	AstraZenca	9941342
Urethane	Sigma-Aldrich (Merck)	U2500-500G
Trimethylamine solution 45%	Sigma-Aldrich (Merck)	92262-1L
Syringes 2 mL	B.Braun Melsungen AG	4606027V
Saline 250 mL	Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o.	15LL707WL
Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends	Braun	NS-010-115-PKM
Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 "	Braun	KN-008-140-ZMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55	Braun	PO-001-007-ZMK
Micro Scissors type Vannas,  straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm	Braun	NO-010-085-PMK
Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8"	Braun	HO-128-130-PMK
Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2	Braun	IM-927-150-PZMK
Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp	Braun	NO-052-110-PMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp	Braun	PO-022-001-PMK