창 자-혈액 장벽 및 간 대사 Microbiota 제품의 평가 위한 Vivo에서 방법

요약

영양소, microbiota 대사와 순환에 의약품의 액세스 창 자-혈액 장벽 (GBB)에 의해 제어 됩니다. 우리는 GBB 침투성에서 vivo에서, 일반적으로 사용 되는 간접 방법, 달리는 거의 영향을 받지 않습니다 간 및 신장 기능을 측정 하기 위한 직접적인 방법을 설명 합니다.

초록

창 자-혈액 장벽 (GBB) 혈 류 장 루멘에서 영양분, 세균 대사 산물과 약물의 흐름을 제어합니다. GBB 무결성 혈 류 창 자 세균 대사 산물 등 생물학적 활성 화합물의 쉽게 액세스 될 수 있습니다 위, 심혈 관 및 대사 질환에 교란 된다. 따라서,는 GBB의 침투성 장 및 extraintestinal 질병의 마커를 있을 수 있습니다. 또한, 세균 대사 산물의 증가 침투 수 있습니다 전체 유기 체의 기능에 영향을.

GBB 침투성 공부에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법 수행 비보 전있습니다. 이러한 방법의 정확성은 창 자 혈액의 흐름에 따라는 GBB의 기능 때문에 제한. 다른 한편으로, 일반적으로 사용 되 비보에 방법 편 파 수 있습니다 간 및 신장 성능, 그 메서드는 소변의 평가 기반으로 또는 / 및 exogenous 마커의 주변 혈액 농도. 여기, 우리 장 혈액 흐름을 유지 하 고 간, 신장 기능 영향을 거의 받지 않습니다 메서드를 사용 하는 비보에 포털 혈액 샘플링에 따라 쥐에서 GBB 침투성의 직접 측정을 제시.

폴리우레탄 카 포털 정 맥에 삽입 하 고는 키 모 보다 열 등 한 베 나 정 맥 혈관 합류. 기준선에 및 위장의 원하는 부분에 선택한 마커의 관리 후 혈액 샘플링 됩니다. 여기, 선물이 TMA, 창 자 세균 대사 산물, TMA의 간 정리의 평가 (2) 및 (3) 평가의 직감 직감 포털 혈액-간-주변 혈액 통로의 콜론 침투성의 평가 (1)를 포함 하는 방법의 몇 가지 응용 프로그램 박테리아에서 파생 된 짧은 사슬 지방산입니다. 또한, 프로토콜 장내 흡수와 약물의 간 대사를 추적 또는 포털 혈압의 측정을 위해 사용할 수도 있습니다.

서문

창 자-혈액 장벽 (GBB)로 알려진 장 배리어 영양소¹의 흡수를 허용 하는 동안 유해한 화합물의 통행을 제한 하기 위하여 혈 류에서 창 자 루멘을 분리 하는 복잡 한 멀티 레이어 시스템입니다. 그것은 이루어져 있다 3 개 주요 레이어: 점액 레이어, 상피와 lamina propria.

수많은 요인 GBB 무결성 및 기능²영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 보였다 GBB 위장과 extraintestinal 질환, 심혈 관 및 대사 질환³, 혈 류⁴직감 세균 대사 산물의 증가 흐름으로 이어질 수 있는 포함 하 여 교란 된다. 창 자 세균 대사 산물의 증가 침투 전체 유기 체의 기능에 영향을 수 있습니다. 최근 연구 결과 순환 시스템 기능^{5,6,7 indoles, H2S, 짧은 사슬 지방산 (SCFA), trimethylamine N 산화물 등의 세균성 대사 산물의 상당한 영향을 표시 하는 예를 들어 ,89}. 마지막으로, 그것 증가 GBB 침투성 형태학 및 기능 변경 창¹⁰과 관련 된 심혈 관 및 대사 질환의 마커로 봉사 수 있습니다 제안 되었습니다. 따라서, 세균 대사 산물의 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 추적 모두 기본 및 임상 과학에 대 한 관심이 있을 수 있습니다.

GBB 침투성의 평가 대 한 일반적으로 이용한 실험 방법 수행 있다 생체 외에서 절제 장 세그먼트, 점 막, 또는 인공 막^11,12의 파편을 사용 하 여. 그 방법의 정확도 GBB의 적절 한 작동 하는 것이 지속적인 장 혈에서는 사실에 의해 손상 됩니다. 다른 한편으로, 사용할 수 있는 비보에 방법 소변의 평가 또는 외 인 마커¹³의 주변 혈액 농도에 근거한 다. 그러나, 간 대사 뿐만 아니라 신장 기능, 즉, 사 여과 속도 관 배설에 의해 외 인 화합물의 주변 혈액과 소변 농도 영향을, 즉, 물질 대사를 먼저 통과. 두 매개 변수는 GBB 함수 별도로 연구 주제 사이 크게 달라질 수 있습니다.

이 종이 포털 혈액 샘플링을 사용 하 여 쥐에서 GBB 침투성의 직접 측정을 설명 합니다. 이 비보에 메서드 장 혈액 흐름을 유지 하 고 간 및 신장 기능에 의해 영향을 거의 받지 않습니다. 설명한 방법은 사용 되지 않습니다 일반적으로, 아마도 일부 방법론 어려움 때문에. 우리는 문맥 및 간 정 맥 합류 보다 열 등 한 베 나 정 맥 도관 법 자세히 설명합니다. 문맥 및 열 등 한 베 나 정 맥에서 혈액 샘플링 GBB 침투성 및 간 허가의 평가 뿐만 아니라 분자의, 창 자 세균 대사 산물 또는 의약품 등의 용기-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로의 추적을 허용 한다. 우리는 또한 우리의 실험실에서 테스트 하는 방법의 몇 가지 응용 프로그램을 제시. TMA, 직감 세균 대사 산물, TMA의 간 정리의 평가 및 평가 SCFA의 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로의 콜론 침투성의 평가 포함 됩니다.

창 자-혈액 장벽 침투성을 평가 하려면 다음 프로토콜 단계 따라야 한다, 순서 대로: 1 (intraintestinal 행정에 대 한 라인의 삽입), 3 (포털 정 맥 도관 법), 4 (문맥 혈액 샘플링 ), 6 (창 자 침투성 표식 관리), 4.

간 통관 및 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 평가 하려면 다음 프로토콜 단계 따라야 한다, 순서 대로: 1 (intraintestinal 행정에 대 한 라인의 삽입), 2 (열 등 한 베 나 카바 도관 법), 3 (포털 정 맥 도관 법), 4 (문맥 혈액 샘플링), 5 (열 등 한 베 나 정 맥 혈액 샘플링), 6 (창 자 침투성 표식 관리), 4, 5, 7 ( 간 정리의 계산).

프로토콜

실험 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 관한 지침 2010/63 EU에 따르면 남성 Wistar 교토 쥐에 수행 하 고 난 바르샤바에서 로컬 Bioethical 위원회에 의해 승인 했다.

1. 삽입 Intraintestinal 관리에 대 한 라인의

참고: 여기 카 테 터를 사용 하 여 마커의 intracolonic 관리를 제안 한다. 그것은 구강 관리 또는 gavage 소화 관 예 위 또는 십이지의 다양 한 수준에서 수정할 수 있습니다. 일회용 수술 복, 수술 가운, 후드와 장갑를 포함 하 여 사용 하 고 절차 1-6 동안 수술 (바늘, 등)에 사용 된 날카로운 도구에 관련 된 안전 조치에 따라 확인을 기억 하십시오.

1. 빠른 동물 수술 전에 하룻밤. 일반 마 취, 즉, 우 레 탄 1.5 g/kg bw i.p. 평가 적절 한 anesthetization의 주입에 의해 취득 하는 종 및 각 막 반사의 부족에 의해 고 발가락-핀치 및 꼬리 핀치 메서드에서 동안 모든 절차를 수행 합니다.
2. 소아 폴 리 카 테 터 10 층 (8 층)를 사용 하 여 저 승 카 테 터로. 콜론 (약 8 cm)에 삽입 될 부분을 나타내기 위해 카 테 터를 표시 합니다.
3. 콜론으로 카 테 터를 삽입 하기 전에 항문 지역 및 직장에서의 자 콘텐츠를 확인 합니다. 자 있으면 직장 영역을 마사지 하 여 항문을 빈.
4. 카 테 터를 따라 윤활제 (예: 글 리세 린 또는 바 셀 린)를 넣어. 항문 및 윤 활 유에와 함께 그 주변을 축 축 하 게.
5. 외부 항문 괄약근을 통해 가이드 와이어 약 8 cm와 카 테 터를 삽입 합니다. 천천히 앞으로 뒤로 및 원형 움직임을 확인 합니다.
   참고: 카 테 터를 삽입 하는 동안 복 부 촉진 하 여 카 테 터의 위치 확인에 유지 합니다.

2. 열 등 한 베 나 정 맥 도관 법

1. 사 타 구니에 모피를 면도. 또는 3 번 알코올과 povidone 요오드와 함께 피부를 소독 하 고 외과 커튼으로 사 타 구니 영역을 커버 합니다.
2. 대 퇴 동맥에서 맥 박을 느낄 하 고 맥 박을 만져 서 장소에 약 2.0 c m의 길이 대 한 경도 피부를 잘라 하려고 합니다.
3. 근 막과 근육 혈관 번들 시각화를 해 부.
4. 대 퇴 정 맥 혈관 번들에서 해 부: 첫 번째 신경, 후 대 퇴 동맥 그리고 정 맥.
   참고: 대 퇴 정 맥의 작은 가지 쉽게 손상 될 수 있습니다, 출혈 생산 이후 neurovascular 뭉치의 해 부 기간 동안 주의 해야 합니다.
5. 대 퇴 정 맥에 2 개의 합자를 넣어. 매듭을 아직 연결 하지 않습니다. 바늘 홀더를 가진 인접 합자의 끝을 잡아.
6. 정 맥의 근 위 부분을 위쪽으로 보유자와 합자 끝 조심 스럽게 빼냅니다. 정 맥은 혈액으로 가득 될 때까지 기다려야 하 고 원심 매듭.
7. 작은 절 개를 만들기 (ca. 1 m m) 매듭 및 인접 합자 사이 정 맥에 microsurgical가 위를 사용 하 여. 끝이 굽은 핀셋 이나 바늘을 사용 하 여 카 테 터를 삽입 합니다.
   참고: 정 맥 펑크 고 테에 대 한 가이드로 바늘의 구부려 진 끝을 사용 합니다. 카 테 터를 삽입 하는 동안 인접 합자를 풉니다. 6-7.0 cm에 대 한 카 테 터를 삽입 합니다.
8. 두 개의 단일 수술 매듭을 가진 대 퇴 정 맥에 카 테 터를 보호 합니다. 뿐만 아니라 인접 합자 넥타이.
9. 주사기로 피를 뽑아서 하 여 카 테 터의 patency를 확인 하십시오. Heparinized 염 분 (100 단위/mL)의 0.3 mL와 함께 테 린스.
10. 하나의 바늘의 2 개의 층으로 수술 상처를 닫습니다.

3. 포털 정 맥 도관 법

그림 1 : 포털 테. 포털 카 테 테 르 바늘 OD의 구성: 약 25.0 m m [A], 유연한 폴리우레탄 테 OD의 길이가 0.9 m m: 0.025", 길이 약 100.0 m m [B], 테 OD의 유연한 폴 리 에틸렌 팁: 0.040", 약 15.0 m m 긴 [C], 플러그 [D 그리고 길이 100.0 m m [E]의 합자 3/0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1. 그림 1에 따라 포털 카 테 터를 준비 합니다.
   1. 바늘의 컷 끝 (OD: 9 m m) OD 폴리우레탄 테로: 0.025".
   2. 합자 3/0 바늘 및 카 테 터의 교차점에 넥타이.
      참고: 합자의 긴 부분 길이 6 m 이상 인지 확인 합니다.
   3. 카 테 테 르 세의 끝: 0.025"폴 리 에틸렌 테 세로: 0.040".
   4. 금속 또는 플라스틱 플러그와 카 테 터를 닫습니다.
2. 중간 개복 술
   1. 복 부에 모피를 면도, 또는 3 번, 알코올과 povidone 요오드와 함께 피부를 소독 하 고 외과 커튼으로 지역을 커버 합니다.
   2. 배꼽에는 흉 골의 칼에서 경도 피부를 잘라.
   3. 흰색 라인을 따라 복 부 벽의 근육을 잘라.
   4. xiphoid 연골 두 컷 사이 Y 형태로 rostrally 컷을 확장 합니다.
3. 포털 정 맥 절 개
   1. 식 염 수로 수술 면봉 축
   2. 맹, 오름차순 가로 결 장 및 작은 창 자 루프 exteriorize 창 자는 mesentery의 루트를 노출 하는 왼쪽 위에.
      참고: 건조에서 내장을 보호 하기 위해 생리 식 염 수를 적신 거 즈로 내장을 커버.
   3. 포털 정 맥 노출, 양쪽 또는 위쪽 moistened 면봉으로 횡 경 막 쪽으로 신중 하 게 간장 돌출부를 이동 합니다.
   4. (간장 hilum, 길이가 약 5 mm)에서 mesentery로 처리 되지 않는 포털 정 맥의 일부를 지역화 하 고 포털 정 맥에서 합자 3/0 (15 ㎝ 길이)를 전달 합니다.
      참고: 합자를 배치 하면서 조직 손상 으로부터 보호, 축 축 하 게 생리 염 분 해결책으로 합자.
   5. 집게와 합자의 끝을 클램프 하 고 배를 안정 시키기 위해 부드럽게 그것을 조이십시오.
4. 삽입 및 카 테 터의 안정화
   1. 포털 정 맥의 무료 부분 아래 포털 테의 합자의 긴 부분을 통과 하 고 테 포털 정 맥 바로 옆에 위치 하 고 그렇게 그것을 당겨.
   2. 위 mesenteric 정 맥 위 mesenteric 정 맥 및 포털 정 맥의 교차점 아래 3 m m로 바늘을 삽입 합니다. 30 ° 각도로 하 고, 정 맥으로 입력 한 후 바늘을 잡고, 각도 줄일 고 포털 정 맥을 동시에 거의 수평으로 바늘을 사전.
      주: 약 6-7 m m의 길이 대 한 바늘을 삽입. 안정화 합자 부드럽게 카 테 터를 삽입 하는 동안 포털 정 맥을 강화 한다.
   3. 바늘이 삽입 하는 곳에 조직 접착제의 1-2 방울을 적용 합니다. 간 커버 면봉을 제거 합니다.
   4. 복 부 구멍으로 내장을 다시 넣어.
   5. 데워 염으로 내장을 축 축 하 고 moistened 멸 균 거 즈로 그것을 커버.
   6. 카 테 터의 patency 확인 하 고 린스 heparinized 염 분 (100 단위/mL)의 0.3 mL와 테.
      참고: 정 맥 혈액 테에서 자발적으로 backflows.
5. 수술의 결말
   1. 5 분 후, 내장 및 연동 운동 색상 검사, 적절 한 mesenteric 혈액 흐름 유지 됩니다 있는지 확인 하십시오.
   2. 3 바늘으로 복 부 캐비티를 닫습니다: 연속, 흡수 되기 쉬운 봉합 사;-복 벽 근육의 내부 층으로 복 벽 복 부 벽-연속, 흡수 되기 쉬운 봉합 사;의 나머지 근육 피부와 피하 조직-단일, 비 흡수 봉합.
      참고: 배꼽 주변 카 테 터의 원심 부분을 Exteriorize.

4. 문맥 혈액 샘플링

1. 때때로 사용; 특정 테스트 프로토콜에 따라 샘플 포털 정 맥 혈액 표 1을 참조 하십시오.

짧은 프로토콜	긴 프로토콜
t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리)	t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리)
t1 -intracolonic 관리 후 5 분	t1 -intracolonic 관리 후 30 분
t2 -intracolonic 관리 후 30 분	t2 -intracolonic 관리 후 60 분

표 1: 포털 혈액 샘플링 프로토콜 창 자 침투성 평가 대 한.

참고: 연속 혈액 샘플링 사이의 시간 주로 시험된 물질의 생체 이용률과 관리 (결 장, 위, 등)의 사이트에 따라 달라 집니다.

2. 포털 카 테 터 플러그를 열고 혈액의 흐름을 자유롭게 하자.
3. 사용 주사기 (vol. 2 mL) 및 무딘 바늘 OD: 0.9 m m. 더 이상 0.7 mL 혈액의 수집.
4. Heparinized 염 (100 단위/mL)의 0.3 mL와 함께 테 린스 하 고 카 테 터 플러그를 닫습니다.

5. 열 등 한 베 나 정 맥 혈액 샘플링

1. 때때로 사용; 특정 테스트 프로토콜에 따라 샘플 열 등 한 베 나 정 맥 혈액 표 2를 참조 하십시오.

문맥	열 등 한 베 나 카바
t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리)	t0 -기준선 (전에 intracolonic 관리)
t1 -intracolonic 관리 후 30 분	t1 -intracolonic 관리 후 30 분

표 2: 프로토콜 간 허가 측정을 위한 샘플링 및 창 자-포털 간 조직의 혈액 혈액 통로 추적 하는 혈액의.

2. 열 등 한 베 나 정 맥 카 테 터 플러그를 열고 혈액의 흐름을 자유롭게 하자.
3. 더 이상 0.7 mL 주사기를 사용 하 여 혈액의 수집 (vol. 2 mL) 깨진 바늘 OD: 0.9 m m.
4. 0.2-0.3와 테 린스의 mL heparinized 염 분 (100 단위/mL)와 카 테 터 플러그를 닫습니다.

6입니다. 창 자 침투성 표식 관리

1. 가이드 와이어를 제거 하 고 살 균 물 (보통 1 mL 하지만 삽입 하기 전에 체크 실제 풍선 크기)의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 저 승 카 테 테 르 풍선 팽창.
   참고: 풍선 직경 1 cm 넘지 말아야 한다.
2. (약 15% 경사) 콜론에서 관리 솔루션의 유출의 위험을 최소화 하기 위해 아래 쥐 머리를 놓습니다.
3. 천천히 테스트 물질을 관리 (예: trimethylamine, 100 mg/kg bw) 저 승 카 테 터에 배수 장치 포트를 사용 하 여.
   참고: 볼륨 관리 솔루션의 0.75 mL의 항문에서 관리 솔루션의 유출을 방지 하기 위해 0.5 mL/min의 이송 속도 초과 하지 마십시오.
4. 10 분 후 풍선을 카 테 터를 빼 다.
5. 열 등 한 베 나 카바와 사용; 특정 테스트 프로토콜에 따라 문맥에서 샘플 혈액 표 1과 표 2를참조 하십시오.
6. 승인 된 방법을 통해 동물 안락사

7입니다. 간 정리의 계산

1. 익스프레스 간 통관, 포털 혈액 농도 열 등 한 베 나 정 맥 혈액 농도 차이 의해 또는 포털 혈액 농도 (1-(열 등 한 베 나 정 맥 농도에 열 등 한 베 나 정 맥의 비율에 의해 간장 추출으로 이해 / 포털 정 맥 농도)).

8. 시험 물질 농도 n 혈액 샘플의 평가

1. 테스트 물질 테스트 방법론에 따라, 적절 한 실험실 절차 (원심, 등등)에 샘플을 적용. 제안 된 프로토콜에서 우리 평가 TMA/TMAO SCFA 농도 트리플 4 극 자 질량 분석으로 결합 하는 액체 크로마토그래피를 사용 하 여. 보충 자료에는 방법에 대 한 자세한 설명을 찾아 주시기 바랍니다.

결과

우리는 성공적으로 GBB 침투성 및 간 허가 TMA의 쥐에서 측정 됩니다. 우리는 고혈압 쥐 normotensive 쥐 (그림 2)⁴에 비해 TMA 증가 콜론 침투성을 증명 하고있다. 또 다른 연구에서 우리는 높은 소금 섭취가 TMA (그림 3)¹⁴의 GBB 침투성 및 간 허가 영향을 주지 않습니다 발견.

토론

설명 직접 vivo에서, GBB 침투성 측정 방법을 유지 closetophysiological 조건 위장 시스템 (장 혈액의 흐름을 유지), 그리고 간, 신장 기능 영향을 거의 받지 않습니다.

이 기술의 중요 한 단계는 포털 카 테 터의 삽입 이다. 이 수행 되어야 합니다 부드럽게 하 고 결정적으로 같은 시간에. 온화 하 고, 짧은 출혈이 문맥;의 올바르게 수행된 펑크에서 발생할 수 있습니다. 그러나, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needle OD: 9 mm	Becton Dickinson  S.A.	301300
Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-40
Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-25
C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD	Cole-Parmer Instrument Co.	06424-59
Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F)	Sigmed	0000 80305
Surgical ligatures 3/0	Yavo Sp. Z o.o.	P48JE
Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0	KRUUSE Polska Sp. Zo.o.	152336
Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive	Loctite	1370127
Povidone iodine	EGIS Pharmaceuticals PLC	4449 11
Heparin - Heparinium WZF	WZF Polfa S.A.	02BK0417	Dilute 10 times with physiological saline
Glycerin 86%	Laboratorium Farmaceutyczne Avena	5.90999E+12	Serves as a lubricant in colon catheterization
Xylocaine 2%	AstraZenca	9941342
Urethane	Sigma-Aldrich (Merck)	U2500-500G
Trimethylamine solution 45%	Sigma-Aldrich (Merck)	92262-1L
Syringes 2 mL	B.Braun Melsungen AG	4606027V
Saline 250 mL	Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o.	15LL707WL
Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends	Braun	NS-010-115-PKM
Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 "	Braun	KN-008-140-ZMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55	Braun	PO-001-007-ZMK
Micro Scissors type Vannas,  straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm	Braun	NO-010-085-PMK
Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8"	Braun	HO-128-130-PMK
Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2	Braun	IM-927-150-PZMK
Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp	Braun	NO-052-110-PMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp	Braun	PO-022-001-PMK