Gut-kan bariyerini ve karaciğer metabolizması Microbiota ürünlerin değerlendirilmesi için In Vivo yöntemi

Özet

Erişimi besinler, microbiota metabolitleri ve dolaşım için ilaçlar, gut-kan bariyerini (GBB) tarafından denetlenir. Biz hangi sık kullanılan dolaylı yöntemler aksine, karaciğer ve böbrek işlevleri tarafından etkilenmez neredeyse GBB geçirgenliği vivo içindeölçmek için doğrudan bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Gut-kan bariyerini (GBB) ilaç besinler, bakteriyel metabolitleri ve oyundan pasaj intestinal lümen için kan dolaşımına denetler. GBB bütünlüğü gibi bağırsak bakteri metabolitleri, biyolojik olarak aktif bileşikler daha kolay erişim için kan neden olabilir gastrointestinal, kardiyovasküler ve metabolik hastalıklarda bozulmuştur. Böylece, GBB geçirgenliği extraintestinal ve bağırsak hastalıklarının bir işaret olabilir. Ayrıca, bakteriyel metabolitleri artan penetrasyon tüm organizmanın çalışmasını etkileyebilir.

GBB geçirgenliği türleri çalışmak için yaygın olarak kullanılan gerçekleştirilen ex vivoyöntemlerdir. GBB işleyişi bağırsak kan akımı üzerinde bağlı olduğundan bu yöntemleri doğruluğunu sınırlıdır. Bu yöntemleri üzerinde idrar değerlendirme dayalı olarak Öte yandan, yaygın olarak kullanılan in vivo Yöntemler karaciğer ve böbrek performans, önyargılı olabilir veya / ve periferik kan konsantrasyonları eksojen işaretleri. Burada, bağırsak kan akışını korur ve karaciğer ve böbrek işlev tarafından etkilenmez neredeyse GBB geçirgenliği sıçanlarda örnekleme, portal kan dayalı bir vivo içinde yöntemini kullanarak doğrudan ölçülmesi mevcut.

Poliüretan kateterler portal ven yerleştirilir ve inferior vena kava hemen üstünde hepatik izdiham damarlar. Kan temel ve seçili bir işaretleyici yönetim gastrointestinal sistem istenen bir parçası haline sonra örneklenir. Burada, yönteminin (1) iki nokta üstüste geçirgenliği TMA, gut bakteri metaboliti, TMA karaciğer Gümrükleme değerlendirmesi (2) ve (3) gut bir gut-portal kan-karaciğer-periferik kan yol değerlendirilmesi değerlendirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar mevcut kısa zincirli yağ asitleri bakteri kaynaklı. Ayrıca, protokol bağırsak emilim ve ilaçların karaciğer metabolizması izlemek için veya portal kan basıncı ölçümleri için de kullanılabilir.

Giriş

Gut-kan bariyerini (GBB), bağırsak bariyer olarak da bilinir, besin¹emilimini izin verirken zararlı bileşikler geçişini sınırlamak için kan dolaşımına bağırsak lümen ayıran karmaşık bir çok katmanlı sistemidir. Üç ana katmandan oluşur: mukus tabakası, epitel ve lamina propria.

Çok sayıda faktör GBB bütünlüğü ve fonksiyonu²etkileyebilir. GBB dahil kardiyovasküler ve metabolik hastalıklar³gut bakteri metabolitleri artan bir geçit kan dolaşımına⁴için yol açabilir, gastrointestinal ve extraintestinal hastalıklarında bozulmuştur gösterilmiştir. Gut bakteri metabolitleri artan bir penetrasyon tüm organizmanın çalışmasını etkileyebilir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda indoller, H2S, kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) ve trimethylamine N-oksit, gibi bakteriyel metabolitleri önemli bir etkisi dolaşım sistemi işlevleri^{5,6,7 göster ,8,9}. Son olarak, artan bir GBB geçirgenliği kardiyovasküler ve metabolik hastalıkların morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler bağırsak¹⁰ile ilişkili olan bir işaretleyici olarak hizmet verebilir önerilmiştir. Bu nedenle, bakteriyel metabolitleri gut-portal kan karaciğer sistemik kan yol izleme için temel ve klinik Bilimleri ilgi olabilir.

Yaygın olarak kullanılan deneysel GBB geçirgenliği değerlendirilmesi için gerçekleştirilen vitro rezeke bağırsak kesimleri, mukoza veya yapay membran^11,12parçaları kullanarak yöntemlerdir. Bu yöntemleri doğruluğunu GBB düzgün sürekli bağırsak kan akımı gerektirir Aslında tarafından güvenilir değil. Öte yandan, mevcut vivo Yöntemler idrar değerlendirilmesi veya periferik kan konsantrasyonları eksojen işaretleri¹³temel alan. Ancak, periferik kan ve idrar konsantrasyon eksojen bileşiklerin böbrek fonksiyonu, Yani, glomerular filtrasyon ve borulu atılımı yanı sıra karaciğer metabolizması tarafından etkilenir, Yani, önce metabolizma geçmem. Her iki parametre GBB işlev bağımsız olarak çalışma konuları arasında önemli ölçüde farklı olabilir.

Bu kağıt GBB geçirgenliği sıçanlarda portal kan örnekleme kullanarak doğrudan ölçümü açıklar. Vivo Buyöntem bağırsak kan akışını korur ve karaciğer ve böbrek işlev tarafından etkilenir hemen hemen değil. Açıklanan yaklaşım yaygın olarak, muhtemelen bazı yöntembilimsel zorluklar nedeniyle kullanılır. Biz ayrıntılı olarak tarif kateterizasyon portal ven ve inferior vena kava hepatik ven kesiştiği yerde hemen üstünde. Kan örnekleme portal ven ve inferior vena kava GBB geçirgenliği ve karaciğer Temizleme değerlendirilmesi yanı sıra ilgi gut bakteri metabolitleri veya ilaç gibi moleküllerin gut-portal kan karaciğer sistemik kan yolu izleme sağlar. Biz de bizim laboratuvar test edildi birkaç uygulama Yöntem mevcut. Bu iki nokta üstüste geçirgenliği TMA, gut bakteri metaboliti, TMA karaciğer Gümrükleme değerlendirilmesi ve SCFA bir gut-portal kan karaciğer sistemik kan yol değerlendirilmesi için değerlendirilmesi içerir.

Gut-kan bariyerini geçirgenliği değerlendirmek için protokolü aşağıdakileri, sırayla takip edilmelidir: 1 (intraintestinal idareler için satır ekleme), 3 (portal ven kateterizasyonu), 4 (portal ven kan örnekleme ), 6 (bağırsak geçirgenliği marker yönetim), 4.

Karaciğer temizlik ve gut-portal kan karaciğer sistemik kan yolu değerlendirmek için protokolü aşağıdakileri, sırayla takip edilmelidir: 1 (intraintestinal idareler için satır ekleme), 2 (inferior vena kava kateterizasyon), 3 (portal ven kateterizasyonu), 4 (portal ven kan örnekleme), 5 (inferior vena kava kan örnekleme), 6 (bağırsak geçirgenliği marker yönetim), 4, 5, 7 () karaciğer Temizleme hesaplanması).

Protokol

Deneyler bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması yönergesi 2010/63 AB göre erkek Wistar Kyoto fareler üzerinde gerçekleştirilen ve ben Varşova yerel Biyoetik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Intraintestinal yönetim için satır ekleme

Not: Burada bir kateter kullanarak bir işaretleyici İdaresi intracolonic teklif ediyorum. Sözlü yönetim veya sonda ile besleme sindirim sistemi Örneğin mide ve oniki parmak bağırsağı çeşitli düzeylerde tarafından değiştirilebilir. Cerrahi Önlük, başlık ve eldiven gibi tek kullanımlık cerrahi giyim kullanmak (iğne, vb) 1-6 işlemler sırasında kullanılan keskin aletler ile ilgili güvenlik önlemleri takip etmek emin olun unutmayın.

1. Gecede daha önce yordamı hızlı hayvanlar. Üretan 1.5 g/kg bw ı.p. değerlendirin uygun anesthetization enjeksiyonu ile palpebral ve kornea refleksleri eksikliği ve ayak-çimdik ve Kuyruk tutam yöntemi tarafından elde edilen yani genel anestezi sırasında tüm yordamları gerçekleştirin.
2. Pediatrik Foley kateter (10F veya 8F) kolon kateter kullanın. Kateter kolon (yaklaşık 8 cm) eklenecek bölümü göstermek için işaretleyin.
3. Anal bölge ve rektum dışkı içeriğinde kateter kolon eklemeden önce kontrol edin. Dışkı varsa, rektal alan masaj rektum boş.
4. Bir yağ (Örneğin gliserin veya petrolatum) kateter boyunca koymak. Anüs ve çevresini yağ ile nemlendirin.
5. Bir kılavuz tel yaklaşık 8 cm dış anal sfinkter aracılığıyla sondayla yerleştirin. Yavaş ileri geri ve dairesel hareketler yapmak.
   Not: kateter konumunu kateter ekleme sırasında abdominal palpasyonla tarafından kontrol tutmak.

2. inferior Vena kava kateterizasyon

1. Kasık kürk tıraş. Alternatif olarak alkol ve povidone iyot ile cilt 3 kez dezenfekte ve kasık bölgesinde cerrahi perdeler ile kaplayın.
2. Femoral arter darbe hissediyorum ve boyuna 2,0 cm darbe aşikar yerde uzunluğu için deriyi kesme deneyin.
3. Fasya ve nörovasküler demet görselleştirmek için kas incelemek.
4. Nörovasküler demet üzerinden femoral ven teşrih: ilk sinirler, sonra femoral arter ve ven.
   Not: femoral ven küçük dalları kolayca kanama üreten hasarlı, beri nörovasküler demet diseksiyon sırasında dikkatli olun.
5. İki bitişik harfler üzerinde femoral ven koymak. Henüz knot kravat mı. İğne bağı ile proksimal ip uçları yakalamak.
6. Dikkatle ip uçları yukarı doğru damarı proksimal kısmı kapatmak için sahibi ile çek. Damar kan ile dolu kadar bekleyin ve distal düğüm kravat.
7. Küçük bir kesi yapmak (ca. 1 mm) üzerinde ven düğümü atacağız ve proksimal bağ arasında mikrocerrahi makas kullanarak. Cımbız veya iğne ile eğri sonuna kullanarak kateter takın.
   Not: damar ponksiyon ve iğne kıvrık ucu kateter için bir kılavuz olarak kullanın. Proksimal bağ kateter eklerken gevşetin. 6-7,0 cm için kateter takın.
8. İki tek cerrahi knot ile femoral ven kateteri güvenli. Proksimal bağ de bağla.
9. Kateterin a_ılabilinirse şırıngayla kan girişiminde bulunarak denetleyin. Sonda heparinized serum (100 adet/mL) 0.3 mL ile yıkayın.
10. Tek dikiş iki kat ile cerrahi yara kapatın.

3. Portal ven kateterizasyonu

Resim 1 : Portal kateter. Portal kateter bir iğne OD oluşur: 0.9 mm uzunluğu yaklaşık 25.0 mm [A], Esnek poliüretan kateter OD: 0,025", uzunluğu yaklaşık 100,0 mm [B], kateter OD esnek polietilen ucu: 0.040", yaklaşık 15.0 mm uzun [C], bir eklenti [D]. ve bir bağ 3/0 100,0 mm [E] uzunluğunda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. Şekil 1göre portal kateter hazırla.
   1. İğne kesim ucunu bağlayın (OD: 9 mm) içine poliüretan kateter OD: 0,025".
   2. İğne ve kateter, bağ 3/0 bağla.
      Not: bağ daha uzun bir parçası en az 6 cm uzunluğunda olduğundan emin olun.
   3. Kateter OD sonuna yerleştirin: 0,025" içine polietilen kateter OD: 0.040".
   4. Bir metal veya plastik fiş sondayla kapatın.
2. Orta hat laparotomi
   1. Kürk karın tıraş, dönüşümlü olarak alkol ve povidone iyot ile cilt 3 kez dezenfekte ve cerrahi perdeler ile alanı kapsamaktadır.
   2. Deriden boyuna göğüs kemiği xiphoid göbek için kesti.
   3. Beyaz hattı boyunca karın duvarı kaslarının kesti.
   4. Böylece xiphoid kıkırdak iki kesim arasında kesme Y şeklinde rostrally genişletin.
3. Portal ven diseksiyon
   1. Serum fizyolojik ile cerrahi temizleme bezi nemlendirin.
   2. Çekum, artan ve enine kolon ve ince bağırsak döngü exteriorize. Bağırsak bıçaklanmasından kökünü göstermek için sol tarafa koy.
      Not: bağırsak bağırsak kurumasını korumak için bir fizyolojik serum ile ıslatılmış gazlı bezle kapak.
   3. Portal ven göstermek için dikkatli bir şekilde karaciğer lobları taraf veya yukarı doğru diyafram nemlendirilmiş temizleme bezi ile doğru taşıyın.
   4. Bıçaklanmasından (içinde karaciğer Hilus, 5 mm uzun) ile kapsanmayan portal ven parçası yerelleştirilmesine ve portal ven altında bağ 3/0 (15 cm uzunluğunda) geçirin.
      Not: bir fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile bağ dokuları bağ yerleştirerek süre zararlardan korumak için kadar ıslat!
   5. Forseps ile ip uçları kelepçe ve yavaşça gemi stabilize etmek sıkın.
4. Ekleme ve stabilization kateterin
   1. Portal kateter'ın bağ portal ven ücretsiz parçası altında daha uzun bir parçası geçmek ve böylece kateter sadece portal ven yanında bulunan çekin.
   2. Üst mezenterik ven üst mezenterik ven ve portal ven altında 3 mm iğne takın. 30 ° açıyla ve damar içine girdikten sonra iğne tutun, açı azaltmak ve iğne neredeyse yatay olarak, portal ven paralel ilerlemek.
      Not: bir süre boyunca yaklaşık 6-7 mm iğne yerleştirin. Teskin bağ-hafifçe sıkın portal ven kateteri eklerken.
   3. 1-2 damla doku yapıştırıcısı iğne yerleştirildiği yerde geçerlidir. Karaciğer kapak bezlerden kaldırın.
   4. Bağırsak karın boşluğuna koy.
   5. Bağırsak kadar ısıtılmış serum fizyolojik solüsyonu ile nemlendirin ve nemli steril gazlı bez ile kaplayın.
   6. Kateterin a_ılabilinirse kontrol ve heparinized tuz (100 adet/mL) 0.3 mL sondayla durulayın.
      Not: Venöz kan kateter içinde kendiliğinden backflows.
5. Ameliyat sonu
   1. 5 dakika sonra bağırsak ve peristaltik hareketleri rengini kontrol, uygun mezenterik kan akımı korunur emin olun.
   2. 3 dikiş ile karın boşluğu kapatmak: periton karın duvarı kasları - sürekli, absorbe dikiş; iç tabakası ile duvar kalan kasları karın duvarı - sürekli, absorbe dikiş; deri ve subkutan doku - tek, absorbe olmayan dikiş.
      Not: göbek çevresinde kateterin distal bölümü Exteriorize.

4. Portal ven kan örnekleme

1. Örnek portal ven kan zaman zaman kullanılan belirli test protokolüne göre; bkz. Tablo 1.

Kısa protokol	Uzun protokol
t0 – temel (önce intracolonic yönetim)	t0 – temel (önce intracolonic yönetim)
t1 – 5 dk sonra intracolonic yönetim	t1 – 30 dk sonra intracolonic yönetim
t2 -30 dk sonra intracolonic yönetim	t2 -60 dk sonra intracolonic yönetim

Tablo 1: Portal kan örnekleme protokolleri bağırsak geçirgenliği değerlendirmesi için.

Not: Üst üste kan örnekleme arasındaki süre esas olarak test edilmiş maddelerin bioavailability ve site yönetim (kolon, mide, vb) bağlıdır.

2. Portal kateter tak aç ve kan akımı serbestçe izin ver.
3. Kullanım şırınga (vol. 2 mL) ve iğne OD künt: 0.9 mm. den fazla 0.7 mL kan toplamak.
4. Sonda heparinized serum (100 adet/mL) 0.3 mL ile durulayın ve kateter tak kapatın.

5. inferior Vena kava kan örnekleme

1. Örnek inferior vena kava kan zaman zaman kullanılan belirli test protokolüne göre; Tablo 2' ye bakın.

Portal ven	İnferior vena kava
t0 – temel (önce intracolonic yönetim)	t0 – temel (önce intracolonic yönetim)
t1 – 30 dk sonra intracolonic yönetim	t1 – 30 dk sonra intracolonic yönetim

Tablo 2: Protokolü karaciğer Temizleme ölçüm için örnekleme ve gut-portal kan karaciğer sistemik kan yolu izleme kan.

2. İnferior vena kava kateter tak aç ve kan akımı serbestçe izin ver.
3. Fazla 0.7 mL şırınga kullanarak kan toplamak (vol. 2 mL) ve iğne OD kırık: 0.9mm.
4. Sonda 0.2-0.3 ile durulayın mL heparinized serum fizyolojik (100 adet/mL) ve kateter tak kapatın.

6. Yönetim bir bağırsak geçirgenliği Marker

1. Kılavuzu kaldır ve steril su (genellikle 1 mL ama onay gerçek balon boyutu ekleme önce) yeterli hacim kullanarak kolon kateter balon şişirmek.
   Not: Balon çapı 1 cm aşmaması gerekir.
2. Sıçan baş aşağı (iki nokta üst üste yönetilen çözümden çıkış riskini en aza indirmek için eğim yaklaşık % 15) yerleştirin.
3. Yavaş yavaş test madde yönetmek (Örneğin trimethylamine, 100 mg/kg bw) kolon kateter drenaj limanda kullanarak.
   Not: hacmi yönetilen çözümün 0.75 mL ve anüs yönetilen çözümden çıkış önlemek için 0.5 mL/dk besleme hızı fazla olamaz.
4. 10 dakika sonra kateter balonu deflate.
5. Örnek kan inferior vena kava ve portal ven kullanılan belirli test protokolüne göre; bkz: Tablo 1 ve tablo 2.
6. Hayvan onaylı yöntemi ile ötenazi.

7. karaciğer Temizleme hesaplanması

1. Karaciğer Temizleme, hepatik çıkarma portal kan konsantrasyonu ve inferior vena kava kan konsantrasyonu arasındaki fark veya inferior vena kava portal kan konsantrasyonu, (1 - (inferior vena kava toplama oranı tarafından anlaşılmış hızlı / portal ven konsantrasyon)).

8. Test madde konsantrasyonu n kan örnekleri değerlendirilmesi

1. Test madde ve test metodoloji bağlı olarak örnek uygun Laboratuvar yordamları (Santrifüjü, vb) tabi. Önerilen Protokoller'de TMA/TMAO ve sıvı kromatografi triple quadrupole kütle spektrometresi ile birleştiğinde kullanarak SCFA konsantrasyon değerlendirin. Lütfen ek malzeme yöntemi ayrıntılı bir açıklamasını bulabilirsiniz.

Sonuçlar

Başarıyla GBB geçirgenliği ve karaciğer Temizleme TMA sıçanlarda ölçülen var. Hipertansif fareler bir artan kolon geçirgenliği TMA için normotansif fareler (Şekil 2)⁴ile karşılaştırıldığında var göstermiştir. Başka bir çalışmada bulduk o yüksek Tuz tüketiminizi TMA (Şekil 3)¹⁴GBB geçirgenliği ve karaciğer geçiş izni etkilemez.

Tartışmalar

Açıklanan doğrudan, in vivo, GBB geçirgenliği ölçüm yöntemi closetophysiological koşulları (bağırsak kan akışını korur) gastrointestinal sistemde korur ve karaciğer ve böbrek işlev tarafından etkilenir hemen hemen değil.

Kritik bu tekniği portal Kateter yerleştirilmesi adımdır. Bu aynı zamanda yavaşça ve kararlı yapılmalıdır. Bir hafif, kısa kanama portal ven doğru gerçekleştirilen bir delik ortaya çıkabilir; Ancak, iğne damar eklenir durur. Sü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needle OD: 9 mm	Becton Dickinson  S.A.	301300
Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-40
Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-25
C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD	Cole-Parmer Instrument Co.	06424-59
Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F)	Sigmed	0000 80305
Surgical ligatures 3/0	Yavo Sp. Z o.o.	P48JE
Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0	KRUUSE Polska Sp. Zo.o.	152336
Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive	Loctite	1370127
Povidone iodine	EGIS Pharmaceuticals PLC	4449 11
Heparin - Heparinium WZF	WZF Polfa S.A.	02BK0417	Dilute 10 times with physiological saline
Glycerin 86%	Laboratorium Farmaceutyczne Avena	5.90999E+12	Serves as a lubricant in colon catheterization
Xylocaine 2%	AstraZenca	9941342
Urethane	Sigma-Aldrich (Merck)	U2500-500G
Trimethylamine solution 45%	Sigma-Aldrich (Merck)	92262-1L
Syringes 2 mL	B.Braun Melsungen AG	4606027V
Saline 250 mL	Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o.	15LL707WL
Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends	Braun	NS-010-115-PKM
Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 "	Braun	KN-008-140-ZMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55	Braun	PO-001-007-ZMK
Micro Scissors type Vannas,  straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm	Braun	NO-010-085-PMK
Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8"	Braun	HO-128-130-PMK
Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2	Braun	IM-927-150-PZMK
Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp	Braun	NO-052-110-PMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp	Braun	PO-022-001-PMK