הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Summary

הליך צעד-אחר-צעד מתואר עבור השתק ללא תווית של אקסוזומים ושלפוחיות מעיים מדגימות נוזל והדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). התמונות AFM משמשות כדי להעריך את הגודל של השלפוחיות בפתרון ולאפיין מאפיינים ביופיזיים אחרים.

Abstract

אקסוזומים ושלפוחיות אחרות (EVs) הם מתחמי מולקולריים המורכב של קרום שומנים ושלפוחית, עיטור פני השטח שלה על ידי חלבונים ממברנות ומולקולות אחרות, ותוכן מגוון לומיאל בירושה מתא הורה, הכולל RNAs, חלבונים ו-DNAs. האפיון של גדלים הידרודינמיים של EVs, אשר תלוי בגודל של שלפוחית ואת השכבה הקורולית שלה נוצר על ידי קישוטי פני השטח, הפך שגרתי. עבור האקסוזומים, הקטן ביותר של EVs, ההבדל היחסי בין ההידרודינמיקה והשלפוחיות הוא משמעותי. אפיון של גדלים ושלפוחיות על-ידי מיקרוסקופ אלקטרוני שידור הקריוגני (הקפאה-TEM), טכניקת הזהב בתקן, נשאר אתגר בשל עלות המכשיר, המומחיות הנדרשת לבצע את ההכנה לדוגמה, הדמיה ו ניתוח נתונים, ומספר קטן של חלקיקים שנצפו לעתים קרובות בתמונות. חלופה רחבה ונגישה לשימוש היא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), אשר יכול לייצר נתונים מגוונים על גאומטריה תלת ממדית, גודל, ומאפיינים אחרים ביופיזיים של שלפוחיות. הפרוטוקול המפותח מדריך את המשתמשים באמצעות כלי אנליטי זה ומתווה את זרימת העבודה לניתוח של EVs על ידי AFM, הכולל את ההכנה לדוגמא לדימות EVs בצורה מהתייבשות או מיובש, השתק אלקטרוסטטי של שלפוחיות על מצע, רכישת נתונים, ניתוח ופרשנות. תוצאות הנציג להפגין כי קיבעון של EVs על משטח נציץ שונה צפוי, להתאמה אישית, ומאפשר למשתמש להשיג תוצאות לשינוי גודל עבור מספר רב של שלפוחיות. שינוי הגודל המבוסס על נתוני AFM נמצא להיות עקבי עם הדמיה הקפאה-TEM.

Introduction

שלפוחיות (EVs) קיימות בכל נוזלי הגוף, כולל דם, שתן, רוק, חלב ונוזל השפיר. אקסוזומים טופס מחלקה מחוז של EVs הבדיל מתוך EVs אחרים על ידי ביוגנזה אנדוזומבית, סמנים של השביל האנדוזומבית, ואת הגודל הקטן ביותר בין כל EVs. הגודל של האקסוזומים מדווח לעתים קרובות עם שינויים ניכרים בין הלימודים. תוצאות שינוי גודל נמצאו להיות תלויים שיטה, המשקף את ההבדל בעקרונות פיזיים המועסקים על ידי טכניקות אנליטיות שונות כדי להעריך EV גדלים^1,2. לדוגמה, ניתוח המעקב הננו-חלקיק (נ. ת. ע)-טכניקת האפיון בגודל הנפוץ ביותר-מעריך את הגודל של EVs כקטרים ההידרודינמיים שלהם, המאפיינים את ההתנגדות לניידות הבראונית של EVs בפתרון. קוטר הידרודינמי גדול יותר של שלפוחית מרמזת על הניידות הנמוכה שלה בנוזל. השכבה הקורלית סביב שלפוחיות, המורכב של חלבונים פני השטח ומולקולות אחרות מעוגן או נספחת אל פני הקרום, מאוד מעכבת את הניידות ומגבירה את הגודל ההידרודינמי של EVs. במונחים יחסיים, גידול זה גדול במיוחד עבור האקסוזומים³, כפי שמודגם באיור 1.

שידור הקריוגני (המיקרוסקופיה) הוא טכניקה מוחלטת באפיון גדלים ומורפולוגיה במדינות ההתייבשות. עם זאת, את העלות הגבוהה של המכשור ואת המומחיות המקצועית הדרושים כדי להשתמש בו נכון להמריץ את החקירה של טכניקות חלופיות שיכול לEVs נוזלים. מספר קטן יחסית של EVs שנצפו או מאופיין בתמונות הקריו-TEM הנרכשים, הוא חיסרון בולט נוסף של טכניקה זו.

מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) לדמיין את הטופוגרפיה תלת מימדי של רטוב או מיובש EVs^4,5,6 על ידי סריקת בדיקה על פני המצע כדי לסרוק את התמונה של החלקיקים על פני השטח. הצעדים החיוניים של הפרוטוקול לאפיון EVs על ידי AFM מתוארים במחקר זה. לפני הדמיה של שלפוחיות בנוזל, הם חייבים להיות מקיבוע על מצע על ידי הקשירה למשטח פונקציונליזציה, השמנה במסנן, או על ידי משיכה אלקטרוסטטית⁷. הקיבעון האלקטרוסטטי על מצע טעונה באופן חיובי הוא אופציה נוחה במיוחד עבור השתק של אקזומים הידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי. עם זאת, את אותם כוחות אלקטרוסטטית ששתק את שלפוחיות החילוץ על פני השטח גם לעוות את צורתם, מה שהופך ניתוח נתונים לאחר הדמיה חיוני. אנו להרחיב נקודה זו על ידי תיאור האלגוריתם המתאר את הגודל של כדורי שלפוחיות בפתרון מבוסס על נתוני AFM על הצורה מעוותת של האקסוזומים מקיבוע על פני השטח.

בפרוטוקול המפותח מוצג הנוהל של הטיפול הסטטי של השלפוחיות ולאחריו השלבים הדרושים לביצוע הדמיה של כוח אטומי במצבי היובש או ההתייבשות. הגורמים המשפיעים על הריכוז של פני השטח של השלפוחית הקיבוע מזוהים. ההדרכה ניתנת על איך לבצע את השתק אלקטרוסטטי עבור דגימות עם ריכוזים שונים של EVs בפתרון. הבחירה של התנאים הניסיוניים המתיר הערכה של הפצות ההסתברות האמפירית של מאפיינים ביופיזיים שונים המבוססים על מספר גדול מספיק של קיבוע ושלפוחיות הוא נדון. דוגמאות לניתוח לאחר הדמיה של נתוני AFM ניתנים. באופן ספציפי, אלגוריתם מתואר לקביעת גודל ושלפוחיות בתמיסה המבוססת על אפיון AFM של קיבוע EVs. תוצאות הנציג להראות את העקביות של שלפוחית האחיזה על ידי AFM עם התוצאות של הדמיה הקפאה-TEM.

Protocol

1. בידוד EVs מתוך ביולואיד

1. בידוד EVs על ידי אחת השיטות הוקמה, כגון ההבדלים הדיפרנציאלי⁸, משקעים, או גודל כרומטוגרפיה הדרה⁹.
2. לאשר נוכחות של משטח צפוי וביואריטים בסמנים והעדר סמנים ביואריטים המצביעים על זיהום של ההכנה. מאשרים את המבנה המיורפולוגיה של החלקיקים המבודדים באמצעות אלקטרון מיקרוסקופ.
   הערה: בעת בידוד האקסוזומים, התפלגות הגודל ההידרודינמי הנמדד על-ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ. ת. ע) או פיזור אור דינאמי צריכים להיות בטווח הצפוי. הפרטים של EV ו אקסוחלק בידוד הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה. השיטה שנבחרה תהיה תלויה בשאלות הנסיוניות ובמטרה של המחקר¹⁰. השלבים הבאים מספקים איור בטון של ההליך להעשיר את האקסוזומים על ידי משקעים מתוך המדיום צמיחה של MCF-7 סרטן השד תאים באמצעות ערכת משקעים זמינים מסחרית (טבלת חומרים).
3. לפני הרחבת תרבות התא, לאחסן MCF-7 סרטן השד תאים בחנקן נוזלי. הפשרת תאים לתת-תרבות.
4. לאחר שיטות ספיגה, לבצע ציפוי תאים על 150 מ"מ לוחות. השתמש במדיום צמיחה מורכב של הנשר's בינוני חיוני מינימלי, 0.01 Mg/mL האדם רקומביננטי אינסולין, ו 10% אקסוכמה-בחינם העובר סרום.
5. מאוורר את התרבות על ידי 95% האוויר ו 5% CO₂ ו-דגירה ב 37 °C.
6. לאחר התיישבו התאים (כ -24 שעות לאחר הציפוי), שנו את המדיה. לפצל את הצלחת ב 1:10 יחס ותרבות עשר צלחות, כל המכיל 20 מ ל של מדיה.
7. מדיית הקציר והבריכות מתשע לוחות אלה (180 mL) בשעה~ 70-80% כאשר התאים עדיין בשלב הצמיחה.
8. חלק את המדיה לתוך 60 mL ו 120 mL, לפצל עוד לתוך 30 מ"ל/tube, ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 15 דקות.
9. להעביר את supernatant מכל צינור לצינור חדש סטרילי 50 mL ולבצע את אקסוקצת בידוד.
10. בידוד אקסוזומים באמצעות משקעים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו (ראה, לדוגמה, הפניה¹¹) או פעל לפי הוראותהיצרן אםערכת בידוד מסחרית (טבלת חומרים) משמשת. כצעד הראשון במקרה האחרון, תא צנטריפוגה בינונית ב 3,000 x g עבור 15 דקות נסיגה supernatant ולהשליך תאים ופסולת תא.
11. הוסף את פתרון המשקעים (1:5 יחס הנפח) אל הסופרנטאנט, ערבב ומקרר בין לילה.
12. צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה.
13. ספין שנותר אקזום גלולה עבור אחר 5 דקות ב 1,500 x g. מבלי לפגוע בגלולה, הסר את פתרון המשקעים הנותר בשאיפה.
14. השהה מחדש את הגלולהב 100-500 μl של מאגר מתמיסת מלח באגירה של 1x פוספט (PBS) וחלק לתוך מספר מאגרים לפי הצורך בניתוח במורד הזרם.
15. המשיכו מיד אל פני השטח של האקסוזומים המבודדים עבור דימות AFM. במקרה הצורך, הקפא את הפחת ב-80 °C לשימוש מאוחר יותר בעת נקיטת אמצעי זהירות כדי למנוע נזק למדגם במהלך המחזור הקפאת ההפשרה.

2. קיבוע פני השטח של שלפוחית המים

1. השתמש בקלטת כפולה וחזקה, אפוקסי או דבק חלופי כדי לצרף בחוזקה דיסק נציץ אל מיקרוסקופ מינהור AFM/סריקה (STM) מגנטי מדגם פלדת אל-חלד.
2. קליב מיכה דיסק באמצעות תער חדה או סכין השירות, או על ידי הצמדת קלטת דבק למשטח העליון ולאחר מכן להוציא אותו כדי להסיר שכבה של חומר.
   הערה: כל אחת מהשיטות אמורה לחשוף משטח בתולי על ידי הסרת שכבה דקה של נציץ שנחשפה בעבר לסביבה. לאחר ההליך, את הקובץ המצורף של נציץ לדיסק הדגימה AFM/STM חייב להישאר יציב.
3. בטמפרטורת החדר, לטפל במשטח העליון של נציץ עבור 10 s עם 100 μL של 10 מ"מ₂ פתרון, אשר משנה את הטעינה על פני השטח משלילי לחיובי.
4. כתמים לחסום₂ פתרון עם מחיקה נטול מוך או נייר מוכתם. שטוף את משטח נציץ 3 x עם מים מוכי (DI) ויבש אותו עם זרם של חנקן יבש.
   הערה: מומלץ לסרוק את משטח השינוי באמצעות AFM כדי לוודא שהוא חופשי ממזהמים.
5. הצב את הדיסק הדגימה של AFM עם נציץ משטח מחובר בצלחת פטרי.
6. לדלל את הדגימה אקסוזום משלב 1.14 עם 1x PBS לקבל ריכוז בין 4.0 x 10⁹ ו 4.0 x 10¹⁰ חלקיקים לכל mL של הפתרון. אמת את ריכוז החלקיקים המדולל. בעזרת נ. ב. א
7. טופס ירידה sessile על פני השטח של נציץ על ידי ריקון 100 μL של פתרון אקסוחלק מדולל של פיפטה.
8. הנח את המכסה על צלחת הפטרי וחתום אותו בסרט פרפין כדי להפחית את האידוי לדוגמה. מודג את המדגםעבור 12 עד18 h ב 4 °צלזיוס.
   הערה: צפיפות פני השטח של האקסוזזומים יגדל עם זמן הדגירה והריכוז של EVs בנוזל. זמן דגירה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ אם האקסוזומים נוכחים במדגם בריכוזים נמוכים.
9. לאחר הדגירה, מאספירין80-90% של המדגם מבלי להפריע את פני השטח. בשלב זה, האקסוזומים יהיה מכוון אלקטרוסטטי על מצע נציץ.
10. לפני הדמיה EVs להתייבש, לשטוף את פני השטח עם 1x PBS. חזור על 3x. דאג לשמור את הדגימה להתייבש במהלך תהליך השטיפה.
11. לאחר שטיפת משטח נציץ עם 1x PBS, להסיר80%-90% שלנוזל, ו פיפטה ~ 40 μl של חדש 1x pbs לכסות את המדגם.
12. בעת הדמיה EVs מיובש, לשטוף את המצע עם מים DI. חזור על 3x.
    הערה: שטיפה עם מים די תמנע היווצרות גבישי מלח והפקדת מסיסות על פני השטח כמצע מתייבש.
13. לפני הדמיה EVs, מייבשים כמו נוזל הרבה ככל האפשר מבלי לגעת במשטח ולייבש את השאר עם זרם של חנקן יבש.

3. AFM הדמיה

1. כדי לצלם את EVs התייבשות, בחר מזיז שנועד לסריקת באוויר בהקשה ובמצבי דימות שאינם אנשי קשר והבהר אותו על מחזיק המקדח.
   הערה: המאפיינים של שלוחה לדוגמה המפורטים בטבלה של חומרים (123 יקרומטר אורך, 40 יקרומטר רוחב, 7 ברדיוס ננומטר, ו 37 N/m קבוע האביב) עשוי לשמש כמדריך בעת בחירת בדיקה תואם עם מכשור afm זמין.
   1. מניחים את ההכנה משלב 2.13 בשלב AFM. הדיסק המגנטי של פלדת אל-חלד. ישתק את הדגימה על הבמה אפשר זמן להכנה ולשלב למתן שיווי משקל.
   2. השתמש במצב הקשה כדי לסרוק אזור גדול מספיק של משטחהנציץ. לדוגמה, בחר אזור של 5 x 5 μm, ש512 שורות בקצב סריקה של ~ 1 Hz. לרכוש הן את התמונות בגובה והן בשלב כפי שהם מספקים מידע משלים על הטופוגרפיה ועל מאפייני פני השטח של המדגם.
      הערה: זמן הסריקה יגדל עם אזור הדימות ומספר השורות שנבחרו ליצירת התמונה אך הפחתה בקצב הסריקה שהוגדר כמספר השורות שנסרקו לשניה. שיעורי סריקה מהירה עשויים להשפיע על איכות התמונה. לפיכך, על מהירות הטיפול לאזן את העסקת החליפין בין זמן הרכישה לבין איכות התמונה.
2. לתמונה שלפוחית הנוזלים, בחר שלוחה המתאימה לסריקת דגימות רכות ומהתייבשות והר הזיז אל בעל המקדח המיועד לסריקת נוזלים.
   הערה: בעת בחירת החללית תואם עם מכשור afm זמין, את המפרט של החללית המפורטים בטבלה של חומרים (שלוחה משולשת עם 175 יקרומטר הנומינלי אורך, 22 יקרומטר רוחב, 20 הרדיוס ננומטר, 0.07 N/m קבוע האביב, ו ממוטב לדימות עם תדירות הכונן בטווח בין 4 ל-8 kHz) עשוי לשמש כמדריך.
   1. להרטיב את קצה הזיז עם 1x PBS כדי להפחית את הסבירות של החדרת בועות אוויר לתוך הנוזל במהלך סריקה.
   2. מניחים את ההכנה משלב 2.11 בשלב AFM. הדיסק מגנטי פלדת אל-חלד יהיה לשתק את נציץ המצורפת המכילה EVs על פני השטח שלה.
   3. אפשר זמן להכנה ולשלב ה-AFM למתן שיווי משקל.
   4. התמונה המשטח המים הרטוב ביותר במצב הקשה. לרכוש הן את התמונות בגובה והן בשלב.
      הערה: איכות ההדמיה מושפעת מהמכשור, הבדיקה הנבחרת ומפרמטרי הסריקה. בעת אופטימיזציה של תנאי הסריקה, האפשרויות הבאות ניתן להשתמש כנקודת התחלה: 5 x 5 יקרומטר שטח שנסרק ב 512 שורות עם ~ 0.8-1.0 שיעור סריקה הרץ ותדירות כונן בין 4 אל 8 kHz.

4. ניתוח תמונה

הערה: השלבים הבאים של עיבוד וניתוח נתונים מוחלים על תמונות הגובה הנרכש. הליך דומה עשוי להתאים לניתוח נתוני הפאזה. התיאור שלהלן הוא ספציפי לGwyddion¹², תוכנת קוד פתוח וחופשית הזמינה תחת הרישיון הציבורי הכללי של GNU. יכולות דומות זמינות בכלי תוכנה חלופיים.

1. עבור אל תהליך הנתונים, מצבי spm, עצה ובחר עצה דגם (איור 2). בחרו בגיאומטריה ובממדי העצה המשמשים לסריקת המדגם ולחצו על הלחצן ' אשר'.
2. תקן את הפריטים שחיקת הקצה על ידי ביצוע שחזור פני השטח. . פתח את התמונה מהתפריט, בחר תהליך נתונים, מצבי spm, עצה, ואז לבחור שחזור פני השטח ולחץ על אישור (איור 3).
3. יישר את מישור ההדמיה כך שיתאים למישור ה-XY של המעבדה על-ידי הסרת ההטיה במצע מנתוני הסריקה. כדי לבצע משימה זו, בחר תהליך נתונים, רמה ובחר רמת מישור (איור 4).
4. יישר שורות של התמונה על-ידי בחירת תהליך הנתונים, תקן את הנתונים ולאחר מכן בחר באפשרות ישר שורות. מספר אפשרויות יישור זמינות (איור 5). לדוגמה, חציון הוא אלגוריתם המוצא גובה ממוצע של כל קו סריקה ומסיר אותו מהנתונים.
5. עבור אל תהליך הנתונים, תקן את הנתונים ובחר הסר צלקות (איור 6), אשר מסיר שגיאות סריקה נפוצות המכונה צלקות.
6. יישר את משטח הנציץ בגובה האפס, Z = 0, על-ידי בחירה באפשרות ' שטח בסיס ברמה ' בתפריט נפתח מתהליך הנתונים (איור 7).
7. זיהוי EVs על המשטח שנסרק באמצעות ' סימון לפי סף ' בתפריט הנפתח של גרגירים (איור 8a). אלגוריתם זה מזהה אקסוזומים משטח המשטח כמו חלקיקים בולטות מהמצע אפס פני השטח בגובה מעל הסף שנבחר על-ידי המשתמש. בחר סף בטווח שבין 1 ל-3 ננומטר, דבר שיבטל את רוב ההפרעות ברקע. גדלי סף קטנים משמשים עם רקע נקי יותר.
   הערה: הסף באיור 8A הוא 1.767 ננומטר. תוצאת הזיהוי הסף של MCF-7 מופיעה באיור 8B. Gwyddion מציעה מספר חלופות לסף כאלגוריתם לזהות באופן אוטומטי שלפוחיות בתמונה, כולל סף אוטומטי (שיטת Otsu), זיהוי קצוות, ואלגוריתם פרשת הדרכים.
   הערה: כאשר מדובר בדימוי החלקיקים, אם קיים בתמונת AFM, עשוי להיות מוסווה ואינו נכלל בניתוח.
8. בצע אפיון גיאומטרי ומימדי של הEVs המזוהה באמצעות אלגוריתמי ההפצות הזמינים הנגישים מתפריט דגנים .
   הערה: Gwyddion מספק כלים כדי להעריך את ההתפלגות של התפלגות שיטתית, בעלי ערך שיטתי, נפחי, ומאפיינים אחרים של קיבוע EVs במצב רטוב או משומנים. דוגמה למאפיין של ערכים סקלריים מוצגת באיור 9, המעניקה את התפלגות הגבהים המרביים בתוך טביעת הרגל של כל אקסומזהה.
9. יצא את נתוני AFM מGwyddion לניתוח מיוחד של כלים חישוביים אחרים ותוכניות מחשב מותאמות אישית.

תוצאות

קיבוע פני השטח של EVs הוא צעד קריטי ברצף ההדמיה. משטח אלקטרוסטטי של אקסוזומים, ידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי, יהיה מכבש להתרחש לאחר המצע של נציץ הוא שונה כדי לקבל טעינה חיובית משטח. ללא הטיפול עם NiCl₂ להקנות שינויים משטח חיובי, השתק של EVs על המצע נמצאה לא יעילה. התמונה גובה באיו?...

Discussion

השתק של EVs מתוך נוזל ביולוגי, סריקת פני שטח, וניתוח תמונה הם הצעדים החיוניים של הפרוטוקול המפותח לאפיון AFM של EVs בנוזל. מספר השלפוחיות והקלה על מאזני הדמיה AFM עם שטח התמונה המשטח ואת ריכוז פני השטח של השלפוחיות על המצע. בהינתן פוטנציאל זטה שלילי של EVs ואקסוזומים¹⁸, אנו תומכים קיבעו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4