Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Резюме

Пошаговая процедура описывается для безэтикетки иммобилизации экзосом и внеклеточных пузырьков из жидких образцов и их визуализации с помощью атомной силовой микроскопии (AFM). Изображения AFM используются для оценки размера пузырьков в растворе и характеризуют другие биофизические свойства.

Аннотация

Экзосомы и другие внеклеточные пузырьки (EVs) представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из липидной мембраны везикулы, ее поверхностного украшения мембранными белками и другими молекулами, а также разнообразное содержание светила, унаследованного от родительской клетки, которая включает РНК, белков и ДНЯ. Характеристика гидродинамических размеров ЭВ, которая зависит от размера везикулы и его коронарного слоя, образованного поверхностными украшениями, стала рутинной. Для экзосомы, самой маленькой из ЭВ, относительная разница между размерами гидродинамических и пузырьков значительна. Характеристика размеров пузырьков криогенной передачей электронной микроскопии (крио-TEM) изображения, золотой стандарт техники, остается проблемой из-за стоимости инструмента, опыт, необходимый для выполнения подготовки образца, изображений и анализа данных, и небольшое количество частиц часто наблюдается в изображениях. Широко доступной и доступной альтернативой является атомная микроскопия силы (AFM), которая может производить универсальные данные о трехмерной геометрии, размерах и других биофизических свойствах внеклеточных пузырьков. Разработанный протокол направляет пользователей в использовании этого аналитического инструмента и излагает рабочий процесс для анализа EVs AFM, который включает в себя подготовку образца для визуализации EVs в гидратированной или высохлой форме, электростатическая иммобилизация пузырьки на субстрате, сбор данных, его анализ и интерпретация. Репрезентативные результаты показывают, что фиксация ЭВ на модифицированной поверхности слюды предсказуема, настраивается и позволяет пользователю получить результаты размеров для большого количества пузырьков. Было установлено, что размер везикула, основанный на данных AFM, согласуется с крио-TEM-изображением.

Введение

Внеклеточные пузырьки (Эпикулы) присутствуют во всех жидкостях организма, включая кровь, мочу, слюну, молоко и амниотическую жидкость. Экзосомы образуют районный класс EVs, отличаемый от других ЭВ эндосомальным биогенезом, маркерами эндосомного пути и наименьшим размером среди всех ЭВ. Размер экзосом часто сообщается с существенной изменчивостью между исследованиями. Результаты размеров были признаны зависимыми от метода, что отражает разницу в физических принципах, используемых различными аналитическими методами для оценки размеров EV^1,2. Например, анализ отслеживания наночастиц (NTA) - наиболее широко используемый метод характеристики размеров - оценивает размер Овв как их гидродинамические диаметры, которые характеризуют устойчивость к броуновской мобильности ЭВ в растворе. Больший гидродинамический диаметр везикулы подразумевает его низкую подвижность в жидкости. Корональный слой вокруг пузырьков, состоящий из поверхностных белков и других молекул, прикрепленных или адсорбированных на поверхность мембраны, существенно препятствует подвижности и увеличивает гидродинамический размер ЭВ. В относительном выражении это увеличение особенно велико для экзосом^3,как показано на рисунке 1.

Криогенная электронная микроскопия передачи (крио-TEM) изображение является окончательным методом в характеристике везикул размеров и морфологии в их гидратированных состояний. Тем не менее, высокая стоимость приборов и специализированные знания, необходимые для его правильного использования мотивировать изучение альтернативных методов, которые могут изображения гидратированных EVs. Еще одним заметным недостатком этой техники является относительно небольшое количество ЭВ, наблюдаемых или охарактеризованных в приобретенных крио-TEM-изображениях.

Атомная микроскопия силы (AFM) визуализирует трехмерную топографию гидратированных или высохших ЭВ^4,5,6 путем сканирования зонда по субстрату, чтобы провести изображение частиц на поверхности. Основные шаги протокола для характеристики EVs aFM изложены в этом исследовании. Перед визуализацией пузырьков в жидкости, они должны быть обездвижены на субстрате либо привязывая к функционализированной поверхности, захватвая в фильтр, или электростатического притяжения⁷. Электростатическая фиксация на положительно заряженном субстрате является особенно удобным вариантом для иммобилизации экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты. Однако те же электростатические силы, которые обездвиживают внеклеточные пузырьки на поверхности, также искажают их форму, что делает анализ данных после визуализации необходимым. Мы разрабатываем этот момент, описывая алгоритм, который оценивает размер шаровых пузырьков в решении на основе данных AFM о искаженной форме экзосомы, обездвиженных на поверхности.

В разработанном протоколе представлена процедура надежной электростатической иммобилизации пузырьков, за которой следуют шаги, необходимые для выполнения изображений атомной силы в гидратированных или высохлых состояниях. Выявлены факторы, влияющие на концентрацию обездвиженные пузырьки. Дано руководство о том, как выполнить электростатическую иммобилизацию образцов с различной концентрацией ЭВ в растворе. Обсуждается выбор экспериментальных условий, позволяющих оценить эмпирические вероятности распределения различных биофизических свойств на основе достаточно большого количества обездвиженных пузырьков. Приведены примеры пост-изображения данных AFM. В частности, описан алгоритм определения размера пузырьков в решении на основе характеристики AFM обездвиженых ЭВ. Репрезентативные результаты показывают последовательность размеров везикула aFM с результатами крио-TEM-изображения.

протокол

1. Изоляция ЭВ от биожидкости

1. Изолировать EVs одним из установленных методов, таких как дифференциальная ультрацентрифугация⁸, осадки, или размер исключения хроматографии⁹.
2. Подтвердите наличие ожидаемых поверхностных и светящихся биомаркеров и отсутствие биомаркеров, указывающих на перекрестное загрязнение препарата. Подтвердите морфологию липидного двухслойного морфологии изолированных частиц с помощью электронной микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При изоляции экзосом, распределение гидродинамических размеров измеряется анализом отслеживания наночастиц (NTA) или динамическим рассеянием света должно быть в ожидаемом диапазоне. Детали EV и экзосомной изоляции выходят за рамки данного протокола. Выбранный метод будет зависеть от экспериментальных вопросов и цели исследования¹⁰. Следующие шаги обеспечивают конкретную иллюстрацию процедуры обогащения экзосом путем осадков от среды роста MCF-7 раковых клеток молочной железы с использованием коммерчески доступного комплекта осадков (Таблица материалов).
3. Перед расширением клеточной культуры храните mcF-7 раковые клетки молочной железы в жидком азоте. Оттепель клетки для субкультуры.
4. Следуя асептической практике, выполните клеточное покрытие на 150-мм пластинах. Используйте среду роста,состоящую из минимальной незаменимой среды Орла, 0,01 мг/мл человеческого рекомбинантного инсулина и 10% безэкзосомного сыворотки крупного рогатого скота.
5. Аэратировать культуру на 95% воздуха и 5% CO₂ и инкубировать при 37 с.
6. После того как клетки установлены (приблизительно 24 h после plating), измените средства. Разделите пластину на 1:10 соотношение и культуры десять пластин, каждая из которых содержит 20 мл средств массовой информации.
7. Урожай и бассейн средств массовой информации из 9 из этих пластин (180 мл) на 70и80% слияния, когда клетки все еще находятся в фазе роста.
8. Разделите носители на 60 мл и 120 мл, далее разделите на 30 мл/трубку и центрифугия на 3000 х г в течение 15 мин.
9. Перенесите супернатант из каждой трубки в новую стерильную трубку 50 мл и выполните экзосомную изоляцию.
10. Изолировать экзосомы осадков в соответствии с опубликованными протоколами (см., например, ссылка¹¹) или следуйте инструкциямпроизводителя,если используется коммерческий комплект изоляции(Таблица материалов). В качестве первого шага в последнем случае, центрифуга клеточной среды на 3000 х г в течение 15 мин. Снять супернатант и отбросить клетки и мусор клеток.
11. Добавьте раствор осадков (коэффициент 1:5 объема) в супернатант, перемешайте и поставьте в холодильник на ночь.
12. Центрифуга при температуре 1500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта после центрифугации.
13. Спин оставшиеся экзосомы гранулы еще 5 мин на 1500 х г. Не нарушая гранулы, удалить оставшиеся раствор осадки аспирации.
14. Отстегивайте гранулы в буфере 100и500 л 1x фосфатно-буферного солимного раствора (PBS) и разделите на несколько аликвот по мере необходимости для анализа вниз по течению.
15. Немедленно приступаем к поверхности иммобилизации изолированных экзосом для визуализации AFM. При необходимости заморозьте аликвоты при -80 с для последующегоиспользования, принимая меры предосторожности, чтобы избежать повреждения образца во время цикла замораживания-оттепели.

2. Поверхностная фиксация внеклеточных пузырьков

1. Используйте сильную двусторонню ленту, эпоксидную или альтернативную клею, чтобы прочно прикрепить диск слюды к aFM/сканированию туннельного микроскопа (STM) магнитного диска из нержавеющей стали.
2. Cleave mica диск с помощью резкой бритвой или утилита нож, или путем присоединения клейкой лентой на верхней поверхности, а затем pealing его, чтобы удалить слой материала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой метод должен выявить девственную поверхность, удалив тонкий слой слюды, ранее подвергаемый воздействию окружающей среды. После процедуры присоединение слюды к металлическому диску AFM/STM должно оставаться твердым.
3. При комнатной температуре обработайте верхнюю поверхность слюды на 10 с_{раствором} NiCl 2, который изменяет поверхностный заряд от отрицательного к положительному.
4. Blot NiCl₂ раствор с без ворса протрите или промотирования бумаги. Вымойте поверхность слюды 3x с деионизированной (DI) воды и высушить его с потоком сухого азота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая практика для сканирования измененной поверхности с AFM, чтобы подтвердить, что она свободна от загрязняющих веществ.
5. Поместите диск образца AFM с прикрепленной поверхностно-модифицированной слюдой в чашку Петри.
6. Разбавить экзосомный образец со ступени 1.14 с 1x PBS, чтобы получить концентрацию между 4,0 х 10⁹ и 4,0 х 10^{10 10} частиц на мл раствора. Проверка концентрации разбавленных частиц с помощью NTA.
7. Сформируйте сессиль капли на поверхности слюды, опорожнение 100 злител разбавленного экзосомного раствора от пипетки.
8. Поместите крышку на чашку Петри и запечатать его парафинаю пленкой, чтобы уменьшить испарение образца. Инкубировать образец для 12и18 ч при 4 С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность поверхности обездвиженых экзосом будет увеличиваться с помощью инкубационного времени и концентрации ЭВ в жидкости. Более длительное время инкубации может быть необходимо, если экзосомы присутствуют в образце при более низких концентрациях.
9. После инкубации, аспир80и90% образца, не нарушая поверхность. В этот момент экзосомы будут электростатически обездвижены на субстрате слюды.
10. Перед визуализацией гидратированных ЭВ, промыть поверхность 1x PBS. Повторите 3x. Позаботьтесь о том, чтобы увлажнить образец на протяжении всего процесса промывки.
11. После мытья поверхности слюды с 1x PBS, удалить 80%и90% жидкости, и пипетка 40 л свежих 1x PBS для покрытия образца.
12. При визуализации высохших ЭВ, промойте субстрат с di воды. Повторите 3x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка с di воды предотвратит образование кристаллов соли и осаждение solutes на поверхности по мере того как субстрат высыхает.
13. Перед визуализацией высохнет ЕВ, аспирируй как можно больше жидкости, не касаясь поверхности, и высушите остальное потоком сухого азота.

3. Изображение AFM

1. Для изображения высохшие EVs, выберите кантилевер, предназначенный для сканирования в воздухе в режиме нажав и бесконтактных режимов изображения и смонтировать его на держатель зонда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики примера кантилевера, перечисленные в таблице материалов (123 мкм длина, 40 мкм ширина, радиус кончика 7 нм и 37 Н/м пружинной константы) могут быть использованы в качестве руководства при выборе зонда, совместимого с имеющимися приборами AFM.
   1. Поместите подготовку со ступени 2.13 на этапе AFM. Магнитный диск образца из нержавеющей стали обездвижит образец на сцене. Дайте время для подготовки и этапу уравновесить термически.
   2. Используйте режим касания для сканирования достаточно большойплощадиповерхности слюды. Например, выберите область 5 х 5 мкм, разбитую в 512 линиях со скоростью сканирования 1 Гц. Приобрести как высоту, так и фазовые изображения, поскольку они обеспечивают дополнительную информацию о топографии и поверхностных свойствах образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования будет увеличиваться с изображением области и количество строк, выбранных для формирования изображения, но уменьшается с скоростью сканирования определяется как количество линий, отсканированных в секунду. Скорость быстрого сканирования может повлиять на качество изображения. Таким образом, скорость rastering должны в судебном порядке сбалансировать компромисс между временем приобретения и качество изображения.
2. Для изображения гидратированных пузырьков выберите кантилевер, подходящий для сканирования мягких, увлажненным образцов, и установите кантилевер на держатель зонда, предназначенный для сканирования в жидкостях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе зонда, совместимого с имеющимися приборами AFM, спецификации зонда, перечисленные в таблице материалов (треугольный кантилевер с номинальной длиной 175 мкм, шириной 22 мкм, радиусом кончика 20 нм, 0,07 Н/м весенним постоянным, и Оптимизированный для визуализации с частотой привода в диапазоне от 4 до 8 кГц) может быть использован в качестве руководства.
   1. Влажный кончик кантилевера с 1x PBS, чтобы уменьшить вероятность введения пузырьков воздуха в жидкость во время сканирования.
   2. Поместите подготовку со ступени 2.11 на этапе AFM. Магнитный диск образца из нержавеющей стали обездвижит прикрепленную слюду, содержащую обездвиженные ЭВ на его поверхности.
   3. Дайте время для подготовки и стадии AFM уравновесить термически.
   4. Изображение гидратированной поверхности слюды в режиме касания. Приобретите изображения высоты и фазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество изображения зависит от приборов, выбранного зонда и параметров сканирования. При оптимизации условий сканирования в качестве отправной точки могут использоваться следующие варианты: область 5 х 5 мкм, отсканированная в 512 линиях с частотой сканирования 0,8-1,0 Гц и частотой привода от 4 до 8 кГц.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги обработки и анализа данных применяются к полученным изображениям высоты. Аналогичная процедура может быть адаптирована для анализа фазовых данных. Описание ниже специфично для Gwyddion¹², бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом, доступное под GNU General Public License. Аналогичные возможности доступны в альтернативных программных средствах.

1. Перейдите к процессу данных, режимы SPM, Совет и выберите Совет модели (рисунок 2). Выберите геометрию и размеры наконечника, используемого для сканирования образца, и нажмите OK.
2. Исправьте артефакты эрозии наконечника, выполняя реконструкцию поверхности. Откройте изображение. Из меню выберите процесс обработки данных, режимы SPM, Совет,затем выберите Surface Reconstruction и нажмите OK (рисунок 3).
3. Выровнять плоскость изображения в соответствии с лабораторной плоскостью XY, удалив наклон в подставке из данных сканирования. Для выполнения этой задачи выберите процесс обработки данных, уровень и выберите уровень плоскости (рисунок 4).
4. Выравнивайте строки изображения, выбирая процесс данных, корректируя данные, а затем выбирайте строки выравнивания. Доступно несколько вариантов выравнивания(рисунок 5). Например, Median — это алгоритм, который находит среднюю высоту каждой линии сканирования и вычитает ее из данных.
5. Перейдите к процессу данных, исправьте данные и выберите Удалить шрамы (рисунок 6),который удаляет распространенные ошибки сканирования, известные как шрамы.
6. Выровняйте поверхность слюды на нулевой высоте, No 0, выбрав Flatten Base в меню выпадения уровня, доступном из процесса данных (рисунок 7).
7. Определите EVs на отсканированной поверхности с помощью Отметки Порога в меню выпадения зерна (рисунок 8A). Этот алгоритм определяет поверхностно-иммобилизованные экзосомы как частицы, выступающие из субстрата нулевой поверхности высотой над выбранным пользователем порогом. Выберите порог в диапазоне от 1 до 3 нм, что устранит большую часть фоновых помех. Меньшие пороги используются с более чистым фоном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Порог на рисунке 8A составляет 1,767 нм. Результат идентификации экзосомного MCF-7 с этим пороговым значением показан на рисунке 8B. Gwyddion предлагает несколько альтернатив пороговому порогу в качестве алгоритма автоматического определения пузырьков на изображении, включая автоматическое пороговое значение (метод Otsu), обнаружение краев и алгоритм водораздела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Агломераты частиц, если они присутствуют на изображении AFM, могут быть замаскированы и исключены из анализа.
8. Выполните геометрические и размерные характеристики идентифицированных EVs с помощью доступных алгоритмов распределения, доступных из меню Grains.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Gwyddion предоставляет инструменты для оценки распределения кальярно-ценных, ареальных, объемных и других свойств обездвиженных ЭВ в гидратированном или бессилином состоянии. Пример свойства скалар-значений показан на рисунке 9, который дает распределение максимальных высот в пределах следа каждой идентифицированной экзосомы.
9. Экспорт данных AFM из Gwyddion для специализированного анализа с помощью других вычислительных инструментов и пользовательских компьютерных программ.

Результаты

Поверхностная фиксация ЭВ является критическим шагом в последовательности изображений. Электростатическая иммобилизация экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты, будет надежно происходить после того, как субстрат слюды будет модифицирован, чтобы имет?...

Обсуждение

Иммобилизация ЭВ из биологической жидкости, сканирование поверхности и анализ изображений являются основными шагами разработанного протокола для характеристики AFM ВВ в жидкости. Количество пузырьков поддается весы изображения AFM с изображением области поверхности и концентрации по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4