Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Se describe un procedimiento paso a paso para la inmovilización sin etiquetas de exosomas y vesículas extracelulares a partir de muestras líquidas y sus imágenes mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes AFM se utilizan para estimar el tamaño de las vesículas en la solución y caracterizar otras propiedades biofísicas.

Resumen

Los exosomas y otras vesículas extracelulares (EV) son complejos moleculares que consisten en una vesícula de membrana lipídica, su decoración superficial por proteínas de membrana y otras moléculas, y diverso contenido luminal heredado de una célula madre, que incluye ARN, proteínas y los ANN. La caracterización de los tamaños hidrodinámicos de los vehículos eléctricos, que depende del tamaño de la vesícula y su capa coronal formada por decoraciones superficiales, se ha convertido en rutina. Para los exosomas, el más pequeño de los vehículos eléctricos, la diferencia relativa entre los tamaños hidrodinámico y vesícula es significativa. La caracterización de los tamaños de las vesículas mediante la imagen de microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM), una técnica estándar de oro, sigue siendo un desafío debido al costo del instrumento, la experiencia necesaria para realizar la preparación de la muestra, la toma de imágenes y análisis de datos, y un pequeño número de partículas a menudo observadas en las imágenes. Una alternativa ampliamente disponible y accesible es la microscopía de fuerza atómica (AFM), que puede producir datos versátiles sobre geometría tridimensional, tamaño y otras propiedades biofísicas de las vesículas extracelulares. El protocolo desarrollado guía a los usuarios en la utilización de esta herramienta analítica y describe el flujo de trabajo para el análisis de vehículos eléctricos por el AFM, que incluye la preparación de muestras para la toma de imágenes de vehículos eléctricos en forma hidratada o desecada, la inmovilización electrostática de vesículas en un sustrato, adquisición de datos, su análisis e interpretación. Los resultados representativos demuestran que la fijación de los vehículos eléctricos en la superficie de mica modificada es predecible, personalizable y permite al usuario obtener resultados de tamaño para un gran número de vesículas. Se encontró que el tamaño de la vesícula basada en los datos de AFM era consistente con las imágenes crio-TEM.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) están presentes en todos los fluidos corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, leche y el líquido amniótico. Los exosomas forman una clase de distrito de vehículos eléctricos diferenciados de otros vehículos eléctricos por biogénesis endosomal, los marcadores de la vía endosomal y el tamaño más pequeño entre todos los vehículos eléctricos. El tamaño de los exosomas a menudo se notifica con una variabilidad sustancial entre los estudios. Se encontró que los resultados del tamaño dependían del método, lo que refleja la diferencia en los principios físicos empleados por diferentes técnicas analíticas para estimar los tamaños de EV^1,2. Por ejemplo, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, por sus que la técnica de caracterización de tamaño más utilizada- estima el tamaño de los vehículos eléctricos como sus diámetros hidrodinámicos, que caracterizan la resistencia a la movilidad Browniana de los vehículos eléctricos en la solución. Un mayor diámetro hidrodinámico de una vesícula implica su menor movilidad en líquido. La capa coronal alrededor de las vesículas, que consiste en proteínas superficiales y otras moléculas ancladas o adsorbidas a la superficie de la membrana, impide sustancialmente la movilidad y aumenta el tamaño hidrodinámico de los vehículos eléctricos. En términos relativos, este aumento es particularmente grande para los exosomas³, como se ilustra en la Figura 1.

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) es una técnica definitiva para caracterizar tamaños de vesículas y morfología en sus estados hidratados. Sin embargo, el alto costo de la instrumentación y la experiencia especializada necesaria para utilizarla motivan correctamente la exploración de técnicas alternativas que pueden crear imágenes de vehículos eléctricos hidratados. Un número relativamente pequeño de vehículos eléctricos observados o caracterizados en las imágenes crio-TEM adquiridas es otra desventaja notable de esta técnica.

La microscopía de fuerza atómica (AFM) visualiza la topografía tridimensional de los vehículos eléctricos hidratados o desecados^4,5,6 mediante el escaneo de una sonda a través del sustrato para rasterar la imagen de las partículas en la superficie. En este estudio se describen los pasos esenciales del protocolo para caracterizar los vehículos eléctricos de AFM. Antes de tomar imágenes de las vesículas en líquido, deben ser inmovilizadas sobre un sustrato, ya sea amarre a una superficie funcionalizada, atrapando en un filtro, o por atracción electrostática⁷. La fijación electrostática en un sustrato cargado positivamente es una opción particularmente conveniente para la inmovilización de exosomas conocidos por tener un potencial zeta negativo. Sin embargo, las mismas fuerzas electrostáticas que inmovilizan las vesículas extracelulares en la superficie también distorsionan su forma, lo que hace que el análisis de datos post-imágenes sea esencial. Elaboramos este punto describiendo el algoritmo que estima el tamaño de las vesículas globulares en la solución basada en los datos de AFM sobre la forma distorsionada de los exosomas inmovilizados en la superficie.

En el protocolo desarrollado, se presenta el procedimiento para la robusta inmovilización electrostática de vesículas y seguido de los pasos necesarios para realizar imágenes de fuerza atómica en los estados hidratados o desecados. Se identifican los factores que influyen en la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas. La guía se da sobre cómo realizar la inmovilización electrostática para muestras con diferentes concentraciones de vehículos eléctricos en la solución. Se discute la selección de condiciones experimentales que permiten la estimación de distribuciones de probabilidad empírica de diferentes propiedades biofísicas basadas en un número suficientemente grande de vesículas inmovilizadas. Se proporcionan ejemplos de análisis post-imagen de los datos de AFM. Específicamente, se describe un algoritmo para determinar el tamaño de las vesículas en la solución basada en la caracterización AFM de los vehículos eléctricos inmovilizados. Los resultados representativos muestran la consistencia del tamaño de la vesícula por AFM con los resultados de la imagen crio-TEM.

Protocolo

1. Aislamiento de los vehículos eléctricos de un biofluido

1. Aísle los vehículos eléctricos mediante uno de los métodos establecidos, como la ultracentrifugación diferencial⁸, la precipitación o la cromatografía de exclusión de tamaño^9.
2. Confirmar la presencia de biomarcadores superficiales y luminales esperados y la ausencia de biomarcadores que indiquen la contaminación cruzada del preparado. Confirmar la morfología bicapa lipídica de las partículas aisladas mediante microscopía electrónica.
   NOTA: Al aislar los exosomas, la distribución del tamaño hidrodinámico medida por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) o la dispersión dinámica de la luz debe estar en el rango esperado. Los detalles del EV y el aislamiento exososa están fuera del alcance de este protocolo. El método seleccionado dependerá de las preguntas experimentales y del objetivo del estudio¹⁰. Los siguientes pasos proporcionan una ilustración concreta del procedimiento para enriquecer los exosomas por precipitación desde el medio de crecimiento de las células de cáncer de mama MCF-7 utilizando un kit de precipitación disponible comercialmente(Tabla de materiales).
3. Antes de la expansión del cultivo celular, almacene las células de cáncer de mama MCF-7 en nitrógeno líquido. Descongelar las células de la subcultura.
4. Siguiendo prácticas asépticas, realice el revestimiento celular en placas de 150 mm. Utilice el medio de crecimiento compuesto por el medio esencial mínimo deláguila,0,01 mg/ml de insulina recombinante humana y suero bovino fetal 10% libre de exosomas.
5. Airear el cultivo en un 95% de aire y 5% de CO₂ e incubar a 37oC.
6. Después de que las celdas se aplanen (aproximadamente 24 h después del revestimiento), cambie el medio. Divida la placa en proporción 1:10 y el cultivo diez placas, cada una con 20 ml de medios.
7. Medios de cosecha y piscina de 9 de estas placas (180 ml) a un 70oun 80 % de confluencia cuando las células aún están en fase de crecimiento.
8. Divida el medio en 60 ml y 120 ml, se divida aún más en 30 ml/tubo y centrífuga a 3.000 x g durante 15 min.
9. Transfiera el sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo estéril de 50 ml y realice el aislamiento exosoma.
10. Aísle los exosomas por precipitación de acuerdo con los protocolos publicados (véase, por ejemplo, la referencia¹¹⁾o siga las instruccionesdelfabricante si se utiliza un kit de aislamiento comercial(Tabla de materiales). Como primer paso en este último caso, el medio celular centrífugo a 3.000 x g durante 15 minutos.
11. Agregue la solución de precipitación (relación de volumen 1:5) al sobrenadante, mezcle y refrigere durante la noche.
12. Centrífuga a 1.500 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
13. Gire el pellet de exosoma restante durante otros 5 min a 1.500 x g. Sin perturbar el pellet, eliminar la solución de precipitación restante por aspiración.
14. Resuspenda el pellet en 100a500 ml de 1 tampón de solución salina con fosfato (PBS) y divídalo en múltiples alícuotas según sea necesario para el análisis posterior.
15. Proceder inmediatamente a la inmovilización superficial de los exosomas aislados para la toma de imágenes AFM. Si es necesario, congele las alícuotas a -80oCpara su uso posterior mientras toma precauciones para evitar daños a la muestra durante el ciclo de congelación-descongelación.

2. Fijación superficial de vesículas extracelulares

1. Utilice cinta fuerte de doble cara, epoxi o un adhesivo alternativo para conectar firmemente un disco de mica a un disco de muestra de acero inoxidable magnético (STM) de un microscopio de túnel AFM/escaneo.
2. Corte el disco de mica con una maquinilla de afeitar afilada o un cuchillo utilitario, o colocando una cinta adhesiva en la superficie superior y luego pealing hacia fuera para eliminar una capa de material.
   NOTA: Cualquier método debe revelar una superficie virgen eliminando una capa delgada de mica previamente expuesta al entorno. Después del procedimiento, la unión de mica al disco de muestra de metal AFM/STM debe permanecer firme.
3. A temperatura ambiente, tratar la superficie superior de la mica durante 10 s con 100 s de solución de 10 mM NiCl_2, que modifica la carga de la superficie de negativa a positiva.
4. Blot NiCl₂ solución con una toallita o papel hinchado sin pelusas. Lavar la superficie de mica 3x con agua desionizada (DI) y secarla con una corriente de nitrógeno seco.
   NOTA: Es una buena práctica escanear la superficie modificada con AFM para confirmar que está libre de contaminantes.
5. Coloque el disco de muestra AFM con la mica modificada en superficie conectada en una placa de petri.
6. Diluir la muestra de exosomas del paso 1.14 con 1x PBS para obtener una concentración entre 4,0 x 10⁹ y 4,0 x 10¹⁰ partículas por ml de solución. Valide la concentración de partículas diluidas utilizando NTA.
7. Forme una gota sésil en la superficie de la mica vaciando 100 sl de la solución de exososoma diluido de una pipeta.
8. Coloque la tapa en la placa de petri y séllela con una película de parafina para reducir la evaporación de la muestra. Incubar la muestra durante 12x18 h a 4oC.
   NOTA: La densidad superficial de los exosomas inmovilizados aumentará con el tiempo de incubación y la concentración de vehículos eléctricos en el líquido. Puede ser necesario un tiempo de incubación más largo si hay exosomas presentes en la muestra a concentraciones más bajas.
9. Después de la incubación, aspirar 80a90% de la muestra sin perturbar la superficie. En este punto, los exosomas serán electrostáticamente inmovilizados en el sustrato de mica.
10. Antes de tomar imágenes de vehículos eléctricos hidratados, enjuague la superficie con 1 PBS. Repita 3x. Tenga cuidado de mantener la muestra hidratada durante todo el proceso de acuñación.
11. Después de lavar la superficie de la mica con 1pbS, retire 80%a90% de líquido, y pipeta de 40 ol de PBS fresco 1x para cubrir la muestra.
12. Cuando tome imágenes de los vehículos eléctricos desecados, enjuague el sustrato con agua DI. Repita 3x.
    NOTA: El enrredado con agua DI evitará la formación de cristales de sal y la deposición de solutos en la superficie a medida que el sustrato se seca.
13. Antes de tomar imágenes desecados los vehículos eléctricos, aspirar tanto líquido como sea posible sin tocar la superficie y secar el resto con una corriente de nitrógeno seco.

3. Imágenes AFM

1. Para crear una imagen de los vehículos eléctricos desecados, seleccione un voladizo diseñado para escanear en el aire en los modos de toma de imágenes de roscado y sin contacto y móntelo en el soporte de la sonda.
   NOTA: Las características de un voladizo de ejemplo enumeradas en la Tabla de materiales (123 m de longitud, 40 m de ancho, radio de punta de 7 nm y constante de resorte de 37 N/m) se pueden utilizar como guía al seleccionar una sonda compatible con la instrumentación AFM disponible.
   1. Coloque la preparación del paso 2.13 en la etapa AFM. El disco magnético de la muestra de acero inoxidable inmovilizará la muestra en el escenario. Deje tiempo para la preparación y la etapa para equilibrar térmicamente.
   2. Utilice el modo de roscado para escanear un área suficientemente grande de la superficiedela mica. Por ejemplo, elija un área de 5 x 5 m, rasterizada en 512 líneas a una velocidad de escaneo de 1 Hz. Adquiera las imágenes de altura y fase, ya que proporcionan información complementaria sobre la topografía y las propiedades de superficie de la muestra.
      NOTA: El tiempo de escaneo aumentará con el área de imagen y el número de líneas seleccionadas para formar la imagen, pero disminuirá con la velocidad de escaneo definida como el número de líneas escaneadas por segundo. Las velocidades de escaneo rápido pueden afectar la calidad de la imagen. Por lo tanto, la velocidad de la rastering debe equilibrar judicialmente el equilibrio entre el tiempo de adquisición y la calidad de la imagen.
2. Para obtener imágenes de vesículas hidratadas, seleccione un voladizo adecuado para escanear muestras blandas e hidratadas y monte el voladizo en un soporte de sonda diseñado para escanear en líquidos.
   NOTA: Al seleccionar una sonda compatible con la instrumentación AFM disponible, las especificaciones de la sonda enumeradas en la Tabla de Materiales (voladizo triangular con longitud nominal de 175 m, ancho de 22 m, radio de punta de 20 nm, constante de resorte de 0,07 N/m y optimizado para imágenes con la frecuencia de accionamiento en el rango entre 4 y 8 kHz) puede utilizarse como guía.
   1. Humedezca la punta del voladizo con 1pbS para reducir la probabilidad de introducir burbujas de aire en el líquido durante el escaneo.
   2. Coloque la preparación del paso 2.11 en la etapa AFM. El disco magnético de la muestra de acero inoxidable inmovilizará la mica conectada que contiene vehículos eléctricos inmovilizados en su superficie.
   3. Deje tiempo para la preparación y la etapa AFM para equilibrar térmicamente.
   4. Imagen de la superficie de mica hidratada en el modo de roscado. Adquiere las imágenes de altura y fase.
      NOTA: La calidad de la imagen se ve influenciada por la instrumentación, la sonda seleccionada y los parámetros de escaneado. Al optimizar las condiciones de escaneado, se pueden utilizar las siguientes opciones como punto de partida: 5 x 5 ám de área escaneada en 512 líneas con velocidad de escaneo de 0,8 a 1,0 Hz y frecuencia de accionamiento entre 4 y 8 kHz.

4. Análisis de imágenes

NOTA: Los siguientes pasos de procesamiento y análisis de datos se aplican a las imágenes de altura adquiridas. Un procedimiento similar puede adaptarse para analizar los datos de fase. La descripción a continuación es específica de Gwyddion^12,un software libre y de código abierto disponible bajo GNU General Public License. Capacidades similares están disponibles en herramientas de software alternativas.

1. Vaya a Procesode datos , Modos SPM, Consejo y elija Consejo del modelo (Figura 2). Seleccione la geometría y las dimensiones de la punta utilizada para escanear la muestra y haga clic en Aceptar.
2. Corrija los artefactos de erosión de la punta realizando la reconstrucción de la superficie. Abra la imagen. En el menú, seleccione Procesosde datos , Modos SPM, Consejoy, a continuación, elija Reconstrucción de superficie y haga clic en Aceptar (figura 3).
3. Alinee el plano de imagen para que coincida con el plano XY de laboratorio eliminando la inclinación en el sustrato de los datos de escaneado. Para realizar esta tarea, seleccione Proceso de datos, Nivel y elija Nivel de plano (figura 4).
4. Alinee las filas de la imagen seleccionando Proceso de datos, Corregir datos y, a continuación, elija Alinear filas. Hay varias opciones de alineación disponibles (Figura 5). Por ejemplo, Mediana es un algoritmo que encuentra una altura media de cada línea de exploración y la resta de los datos.
5. Vaya a Procesode datos , Corregir datos y elija Eliminar cicatrices (Figura 6), que elimina los errores de análisis comunes conocidos como cicatrices.
6. Alinee la superficie de mica a la altura cero, Z a 0, seleccionando Aplanar base en el menú desplegable Nivel accesible desde Proceso de datos (Figura 7).
7. Identifique los vehículos eléctricos en la superficie escaneada mediante el menú desplegable Marcar por umbral en granos (figura 8A). Este algoritmo identifica los exosomas inmovilizados en superficie como partículas que sobresalen del sustrato de superficie cero por la altura por encima del umbral seleccionado por el usuario. Seleccione un umbral en el rango entre 1 y 3 nm, lo que eliminará la mayor parte de la interferencia de fondo. Los umbrales más pequeños se utilizan con un fondo más limpio.
   NOTA: El umbral en la Figura 8A es 1.767 nm. El resultado de la identificación de exosomas MCF-7 con este umbral se muestra en la Figura 8B. Gwyddion ofrece varias alternativas al umbral como algoritmo para identificar automáticamente las vesículas en la imagen, incluido el umbral automatizado (método de Otsu), la detección de bordes y el algoritmo de cuenca hidrográfica.
   NOTA: Los aglomerados de partículas, si están presentes en la imagen AFM, pueden enmascararse y excluirse del análisis.
8. Realice la caracterización geométrica y dimensional de los vehículos eléctricos identificados utilizando los algoritmos distributorios disponibles accesibles desde el menú Granos.
   NOTA: Gwyddion proporciona herramientas para evaluar la distribución de las propiedades escalares, areales, volumétricas y otras propiedades de los vehículos eléctricos inmovilizados en estado hidratado o dessilado. Un ejemplo de una propiedad de valores escalares se muestra en la Figura 9, que proporciona la distribución de alturas máximas dentro de la huella de cada exosoma identificado.
9. Exporte los datos AFM de Gwyddion para su análisis especializado por otras herramientas computacionales y programas informáticos personalizados.

Resultados

La fijación superficial de los vehículos eléctricos es un paso crítico en la secuencia de imágenes. La inmovilización electrostática de la superficie de los exosomas, que se sabe que tiene un potencial zeta negativo, se producirá de forma robusta después de que el sustrato de la mica se modifique para tener una carga superficial positiva. Sin el tratamiento con NiCl₂ para impartir cambios positivos en la superficie, se encontró que la inmovilización de los vehículos eléctricos en el sustrato era i...

Discusión

La inmovilización de los vehículos eléctricos de un fluido biológico, el escaneo de superficies y el análisis de imágenes son los pasos esenciales del protocolo desarrollado para la caracterización AFM de los vehículos eléctricos en líquido. El número de vesículas susceptibles a las escalas de imágenes AFM con el área de superficie de la imagen y la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas en el sustrato. Dado un potencial zeta negativo de vehículos eléctricos y exosomas

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4