Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Özet

Sıvı numunelerden ekzozomların ve hücre dışı veziküllerin etiketsiz immobilizasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntülenmesi için adım adım bir prosedür tanımlanmıştır. AFM görüntüleri çözeltideki veziküllerin boyutunu tahmin etmek ve diğer biyofiziksel özellikleri karakterize etmek için kullanılır.

Özet

Ekzozomlar ve diğer ekstrasellüler (EVs) lipid membran vezikül, membran proteinleri ve diğer moleküller tarafından yüzey dekorasyonu ve rna içeren bir ana hücreden miras farklı luminal içeriği oluşan moleküler kompleksleri, proteinler ve DNA'lar. Vezikülboyutuna ve yüzey süslemelerinden oluşan koronal tabakasının büyüklüğüne bağlı olarak EV'lerin hidrodinamik boyutlarının karakterizasyonu rutin hale gelmiştir. Exozomlar için, EVs en küçük, hidrodinamik ve vezikülboyutları arasındaki göreli fark önemlidir. Vezikül boyutlarının kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme siperasyonu, altın standart bir teknik olan, cihazın maliyeti, numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi ve sık sık görüntülerde gözlenen parçacıkların az sayıda. Yaygın olarak kullanılabilir ve erişilebilir bir alternatif atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu geometri, boyut ve ekstrahücre içi veziküllerin diğer biyofiziksel özellikleri hakkında çok yönlü veri üretebilir. Geliştirilen protokol, bu analitik aracı kullanırken kullanıcılara rehberlik eder ve AFM tarafından EVs analizi için iş akışını özetler, bu da sulu veya kurutulmuş formdaki görüntüleme E'leri için numune hazırlamasını içerir, elektrostatik immobilizasyon bir substrat, veri toplama, analizi ve yorumlanması üzerine veziküller. Temsili sonuçlar, modifiye mika yüzeyindeki EV fiksasyonunun öngörülebilir, özelleştirilebilir olduğunu ve kullanıcının çok sayıda vezikül için boyutlandırma sonuçları elde etmesini sağladığını göstermektedir. AFM verilerine dayalı vezikül boyutlandırmasının kriyo-TEM görüntüleme ile uyumlu olduğu bulunmuştur.

Giriş

Ekstrasellüler veziküller (EVs) kan, idrar, tükürük, süt ve amniyotik sıvı da dahil olmak üzere tüm vücut sıvıları mevcuttur. Ekzozomlar, endozomal biyogenez, endozomal yolun belirteçleri ve tüm EV'ler arasında en küçük boyut ile diğer EV'lerden farklılaşan bir bölge sınıfı oluştururlar. Ekzozomların büyüklüğü genellikle çalışmalar arasında önemli bir değişkenlik ile bildirilmiştir. Boyutlandırma sonuçlarının yönteme bağımlı olduğu, ev boyutlarını tahmin etmek için farklı analitik tekniklerle kullanılan fiziksel ilkeler arasındaki farkı yansıttığı bulunmuştur^1,2. Örneğin, nanopartikül izleme analizi (NTA) ― en yaygın olarak kullanılan boyut karakterizasyon tekniği ― evs'lerin boyutunu, çözeltideki EV'lerin Brownian hareketliliğine karşı direnci karakterize eden hidrodinamik çapları olarak tahmin eder. Bir vezikül daha büyük bir hidrodinamik çapı sıvı düşük hareketlilik anlamına gelir. Veziküllerin etrafındaki koronal tabaka, membran yüzeyine demirlemiş veya adsorbe edilmiş yüzey proteinlerinden ve diğer moleküllerden oluşan, hareketliliği önemli ölçüde engeller ve EVs'lerin hidrodinamik boyutunu artırır. Göreceli olarak, bu artış özellikle ekzozomlar için büyük^{tür 3}, Şekil 1'degösterildiği gibi .

Kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme, sulu hallerinde vezikül boyutları ve morfolojisini karakterize etmede belirleyici bir tekniktir. Ancak, enstrümantasyon yüksek maliyet ve doğru sulu EVs görüntü alternatif tekniklerin keşfi motive kullanmak için gerekli özel uzmanlık. Edinilmiş kriyo-TEM görüntülerinde gözlenen veya karakterize edilen nispeten az sayıda EV bu tekniğin bir diğer önemli dezavantajıdır.

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yüzeydeki parçacıkların görüntüsünü canlandırmak için substrat boyunca bir sonda tarayarak sulu veya kurutulmuş EVs^4,5,6 üç boyutlu topografya görselleştirir. EVs'i AFM ile karakterize etmek için protokolün temel adımları bu çalışmada özetlenmiştir. Sıvı vezikülleri görüntülemeden önce, bir substrat üzerinde ya işlevsel bir yüzeye tethering tarafından immobilize edilmelidir, bir filtre içinde bindirme, ya da elektrostatik çekim⁷. Pozitif yüklü bir substrat üzerindeki elektrostatik fiksasyon, negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların immobilizasyonu için özellikle uygun bir seçenektir. Ancak, yüzeydeki hücre dışı vezikülleri hareketsiz hale getiren aynı elektrostatik kuvvetler de şekillerini bozar, bu da post-görüntüleme veri analizini gerekli kılar. Bu noktayı, yüzeyde hareketsiz hale getirilen ekzozomların çarpık şekli ne kadar çarpık şekli ne kadar aparat lara dayanarak çözümdeki küresel veziküllerin boyutunu tahmin eden algoritmayı tanımlayarak ayrıntılı olarak ele alıyoruz.

Geliştirilen protokolde, veziküllerin sağlam elektrostatik immobilizasyonu için prosedür sunulur ve sulu veya kurutulmuş durumlarda atomik kuvvet görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli adımları takip eder. Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonunu etkileyen faktörler tanımlanır. Çözeltide farklı yoğunlukta EV'lere sahip numuneler için elektrostatik immobilizasyonun nasıl gerçekleştirilenekadar gerçekleştirildiği konusunda kılavuz verilir. Yeterince çok sayıda hareketsiz veziküle dayalı farklı biyofiziksel özelliklerin ampirik olasılık dağılımlarının tahmin edilmesine izin veren deneysel koşulların seçimi tartışılmıştır. AFM verilerinin post-görüntüleme analiziörnekleri verilmiştir. Özellikle, immobilize EVs AFM karakterizasyonu dayalı çözüm veziküllerin boyutunu belirlemek için bir algoritma açıklanmıştır. Temsili sonuçlar, AFM tarafından kriyo-TEM görüntüleme sonuçları ile vezikül boyutlandırmasının tutarlılığını göstermektedir.

Protokol

1. EVs bir biyosıvı dan izolasyon

1. Diferansiyel ultrasantrifüj^8,yağış veya boyut dışlama kromatografisi⁹gibi yerleşik yöntemlerden biri ile EVs izole .
2. Beklenen yüzey ve luminal biyobelirteçlerin varlığını ve preparatın çapraz kontaminasyonunu gösteren biyobelirteçlerin eksikliğini doğrulayın. Elektron mikroskobu ile izole edilmiş parçacıkların lipid çift katmanlı morfolojisini doğrulayın.
   NOT: Ekzozomları izole ederken, nanopartikül izleme analizi (NTA) veya dinamik ışık saçılımı ile ölçülen hidrodinamik boyut dağılımı beklenen aralıkta olmalıdır. EV ve ekzozom yalıtımı ayrıntıları bu protokolün kapsamı dışındadır. Seçilen yöntem deneysel sorulara ve çalışmanın amacına bağlıdır¹⁰. Aşağıdaki adımlar, ticari olarak mevcut bir yağış kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak MCF-7 meme kanseri hücrelerinin büyüme ortamı ndan yağış ile ekzozomları zenginleştirmek için prosedürün somut bir örnek sağlar.
3. Hücre kültürü genişlemeden önce, sıvı azot MCF-7 meme kanseri hücreleri saklayın. Hücreleri alt kültüre eritin.
4. Aseptik uygulamaları takiben, 150 mm plakaüzerinde hücre kaplaması yapın. Eagle'ın minimum esansiyel orta, 0.01 mg/mL insan rekombinant insülinve %10 ekzozomsuz fetal sığır serumundan oluşan büyüme ortamını kullanın.
5. Kültürü %95 hava ve %5 CO₂ ile derecelendirin ve 37 °C'dekuluçkaya yatırın.
6. Hücreler yerleştikten sonra (kaplamadan yaklaşık 24 saat sonra), ortamı değiştirin. Plakayı 1:10 oranında bölün ve her biri 20 mL ortam içeren on plakayı kültüre alın.
7. Bu plakaların 9'undan (180 mL) ~70−%80'inde hücreler büyüme aşamasındayken biraraya gelen hasat ve havuz ortamı.
8. Ortamı 60 mL ve 120 mL'ye bölün, 30 mL/tüpe bölünve 3000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
9. Her tüpten süpernatant'ı yeni bir steril 50 mL tüpe aktarın ve ekzozom izolasyonunu gerçekleştirin.
10. Yayınlanan protokollere göre ekzozomları yağışla izole edin (örneğin, referans¹¹⁾veya ticari bir izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanılıyorsaüreticinintalimatlarına uyun. İkinci durumda ilk adım olarak, 15 dk için 3.000 x g santrifüj hücre orta.
11. Çökeltme çözeltisini (1:5 hacim oranı) supernatant'a ekleyin, karıştırın ve bir gecede soğutun.
12. Oda sıcaklığında 30 dk için 1.500 x g santrifüj. Santrifüjden sonra supernatant atın.
13. Kalan ekzozom peletini 1.500 x g'da5 dk daha döndürün. Pelet rahatsız etmeden, aspirasyon ile kalan yağış çözeltisi çıkarın.
14. Peleti 100−500 μL'lik 1x fosfat tamponlu salin (PBS) tamponuna yeniden askıya alın ve aşağı akım analizi için gerektiği gibi birden fazla aliquot'a bölün.
15. AFM görüntüleme için izole ekzozomların yüzeye hemen immobilizasyonuna geçin. Gerekirse, dondurma-çözülme döngüsü sırasında numunenin zarar görmesini önlemek için önlemler alırken daha sonra kullanım için -80 °C'de aliquots dondurun.

2. Hücre dışı veziküllerin yüzey fiksasyonu

1. AFM/taramalı tünel mikroskobu (STM) manyetik paslanmaz çelik numune diskine mika diski sıkıca takmak için güçlü çift taraflı bant, epoksi veya alternatif bir yapıştırıcı kullanın.
2. Mika diskini keskin bir jilet veya yardımcı bıçak kullanarak veya üst yüzeye yapışkan bant takarak ve daha sonra bir malzeme tabakasını çıkarmak için kırparak ayırın.
   NOT: Her iki yöntem de daha önce ortama maruz kalmış ince bir mika tabakasını çıkararak bakire bir yüzey ortaya çıkarmalıdır. İşlemden sonra mikanın AFM/STM metal numune diskine bağlanması sağlam kalmalıdır.
3. Oda sıcaklığında, mikanın üst yüzeyini 10 00 000 l 100 mM NiCl₂ çözeltisi ile tedavi edin, bu da yüzey yükünü negatiften pozitife değiştirin.
4. Tüy bırakmayan silme veya lekeleme kağıdı ile Blot NiCl₂ çözeltisi. Mika yüzeyini deiyonize (DI) suyla 3 kat yıkayın ve kuru bir azot akışı ile kurulayın.
   NOT: Modifiye edilmiş yüzeyi AFM ile tarayabilmek ve kirletici maddelerden arındırılmış olduğunu doğrulamak iyi bir uygulamadır.
5. AFM numune diskini bağlı yüzeymodifiye mikaile bir petri kabına yerleştirin.
6. Çözeltinin mL başına 4,0 x 10⁹ ile 4,0 x^{10 10 10} partikülarasında bir konsantrasyon elde etmek için 1x PBS ile 1.14 adımdan ekzozom numunesini seyreltin. NTA kullanarak seyreltilmiş parçacık konsantrasyonu doğrulayın.
7. Seyreltilmiş ekzozom çözeltisinin 100 μL'sini pipetten boşaltarak mika yüzeyinde sessile bir damla oluşturun.
8. Petri kabının kapağını yerleştirin ve numune buharlaşmasını azaltmak için bir parafin filmi ile kapatın. Numuneyi 4 °C'de 12−18 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Hareketsiz ekzozomların yüzey yoğunluğu, kuluçka süresi ve sıvıdaki EV konsantrasyonu ile artacaktır. Numunede daha düşük konsantrasyonlarda ekzozomlar varsa daha uzun kuluçka süresi gerekebilir.
9. Kuluçkadan sonra, yüzeyi bozmadan numunenin %80−90'ını aspire edin. Bu noktada, ekzozomlar mika substrat üzerinde elektrostatik olarak hareketsiz hale gelecektir.
10. Sulu EV'leri görüntülemeden önce yüzeyi 1x PBS ile durula. 3x'i tekrarlayın. Durulama işlemi boyunca numunenin sulu tutulmasına özen tin.
11. Mika yüzeyini 1x PBS ile yıkadıktan sonra numuneyi kapsayacak şekilde %80−sıvının %90'ını ve pipet ~40 μL taze 1x PBS'yi çıkarın.
12. Kurutulmuş EVs görüntülerken, DI su ile substrat durulayın. 3x'i tekrarlayın.
    NOT: DI suyu ile durulama tuz kristalleri oluşumunu ve yüzeyde solutes birikimini önleyecektir substrat kurur gibi.
13. Kurutulmuş EVs görüntüleme önce, yüzeye dokunmadan mümkün olduğunca çok sıvı aspire ve kuru azot akışı ile geri kalanı kuru.

3. AFM görüntüleme

1. Kurutulmuş EVs görüntü için, dokunarak ve temassız görüntüleme modlarında havada tarama için tasarlanmış bir cantilever seçin ve sonda tutucu üzerine monte.
   NOT: Mevcut AFM enstrümantasyonuile uyumlu bir prob seçerken Malzeme Tablosu'nda listelenen bir örnek kantilinin özellikleri (123 μm uzunluk, 40 μm genişlik, 7 nm uç yarıçapı ve 37 N/m yay sabiti) kılavuz olarak kullanılabilir.
   1. AFM sahnesine 2.13. Manyetik paslanmaz çelik numune diski, numuneyi sahnede hareketsiz hale getirecektir. Hazırlık ve sahne termal olarak dengelemek için zaman bekleyin.
   2. Mika'nın yüzeyinin yeterince geniş bir alanını tmak için dokunma modunu kullanın. Örneğin, 5 x 5 μm'lik bir alan seçin, 512 satırda ~1 Hz'lik bir taramaya alın. Topografya ve numunenin yüzey özellikleri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağladıkları için hem yükseklik hem de faz görüntüleri edinin.
      NOT: Görüntülenmiş alan ve görüntüyü oluşturmak için seçilen satır sayısı ile tarama süresi artacaktır ancak saniyede taranmış satır sayısı olarak tanımlanan tarama hızı azalır. Hızlı tetkik hızları görüntü kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, rastering hızı yargı edinim süresi ve görüntü kalitesi arasındaki dengeyi dengelemelidir.
2. Sulu vezikülleri görüntülemek için yumuşak, sulu numuneleri taramak için uygun bir kantil i seçin ve kantili sıvılarda tarama için tasarlanmış bir sonda tutucuya monte edin.
   NOT: Mevcut AFM enstrümantasyonuile uyumlu bir prob seçerken, Malzeme Tablosu'nda listelenen probun özellikleri (175 μm nominal uzunlukta üçgen kantil, 22 μm genişlik, 20 nm uç yarıçapı, 0,07 N/m yay sabiti ve 4 ila 8 kHz aralığında sürücü frekansı ile görüntüleme için optimize) bir kılavuz olarak kullanılabilir.
   1. Tarama sırasında sıvıya hava kabarcıkları girme olasılığını azaltmak için kantilin ucunu 1x PBS ile ısla.
   2. AFM sahnesine 2.11.adımdan gelen hazırlığı yerleştirin. Manyetik paslanmaz çelik numune diski, yüzeyinde immobilize eVs içeren ekli mika hareketsiz hale getirecektir.
   3. Hazırlık ve AFM aşamasının termal olarak dengelemesine zaman verin.
   4. Dokunma modunda sulu mika yüzeyini görüntüleyin. Hem yükseklik hem de faz görüntülerini edinin.
      NOT: Görüntüleme kalitesi enstrümantasyon, seçili prob ve tetkik parametrelerinden etkilenir. Tarama koşulları optimize edilirken, aşağıdaki seçenekler başlangıç noktası olarak kullanılabilir: 5 x 5 μm alan ~0.8-1.0 Hz tarama hızı ve 4 ila 8 kHz arasında sürücü frekansı ile 512 satırda taranmış.

4. Görüntü analizi

NOT: Elde edilen yükseklik görüntülerine aşağıdaki veri işleme ve analiz adımları uygulanır. Benzer bir yordam faz verilerini çözümlemek için uyarlanabilir. Aşağıdaki açıklama Gwyddion^12,gnu Genel Kamu Lisansı altında kullanılabilir ücretsiz ve açık kaynak yazılım için özeldir. Benzer özellikler alternatif yazılım araçlarında mevcuttur.

1. Veri İşlemi, SPM modları, İpucu gidin ve Model İpucu (Şekil 2)seçin. Örneği tarayıp Tamam'ıtıklatın.
2. Yüzey rekonstrüksiyonu gerçekleştirerek uç erozyonu yapılarını düzeltin. Görüntüyü açın. Menüden Veri İşlemi, SPM modları, İpucu,ardından Yüzey Yeniden Yapılandırmasını seçin ve Tamam 'ı(Şekil 3)tıklatın.
3. Görüntüleme düzlemini, alt tabakadaki eğimi taraya verisinden çıkararak laboratuvar XY düzlemine uyacak şekilde hizala. Bu görevi gerçekleştirmek için Veri İşlemi, Düzey'i seçin ve Düzlem Düzeyi 'ni seçin (Şekil 4).
4. Veri İşlemi, Verileri Düzelt'i seçerek görüntünün satırlarını hizalayın ve ardından Satırları Hizala'yıseçin. Çeşitli hizalama seçenekleri mevcuttur (Şekil 5). Örneğin, Ortanca, her tbmm satırının ortalama yüksekliğini bulan ve verilerden çıkaran bir algoritmadır.
5. Veri İşlemi,Verileri Düzelt ve yara izi olarak bilinen yaygın tarama hatalarını ortadan kaldıran Scars (Şekil 6)seçeneğini belirleyin.
6. Mika yüzeyini sıfır yükseklikte hizala, Z = 0, Veri İşlemi'nden erişilebilen Seviye açılır menüsünde Düztaban Tabanı'nı seçerek(Şekil 7).
7. Tanecikler açılır menüsünde Eşik tarafından İşaretle kullanarak taranmış yüzeydeki EV'leritanımlayın (Şekil 8A). Bu algoritma, yüzeyimsiz ekzozomları, sıfır yüzey yüzeyi yüzeyinden kullanıcı tarafından seçilen eşiğin üzerindeki yüksekliğe göre çıkıntılı parçacıklar olarak tanımlar. 1 ile 3 nm arasındaki aralıkta, arka plan parazitinin çoğunu ortadan kaldıracak bir eşik seçin. Daha küçük eşikler daha temiz arka plan ile kullanılır.
   NOT: Şekil 8A'daki eşik 1.767 nm'dir. Bu eşik ile MCF-7 ekzozom tanımlamasonucu Şekil 8B'degösterilmiştir. Gwyddion otomatik eşik (Otsu yöntemi), kenar algılama ve havza algoritması da dahil olmak üzere görüntüdeki vezikülleri otomatik olarak tanımlamak için algoritma olarak eşik çeşitli alternatifler sunuyor.
   NOT: Parçacık aglomeraları, AFM görüntüde mevcutsa, maskelenebilir ve analizdışı edilebilir.
8. Tanecikler menüsünden erişilebilen kullanılabilir Dağılımalgoritmalarını kullanarak tanımlanan EVs'lerin geometrik ve boyutsal karakterizasyonunu gerçekleştirin.
   NOT: Gwyddion, scalar değerli, areal, volumetrik ve immobilize edilmiş EVs'nin diğer özelliklerinin sulu veya susuz bir durumda dağılımını değerlendirmek için araçlar sağlar. Skaler değerler özelliğinin bir örneği Şekil 9'da gösterilmiştir ve bu da tanımlanan her ekzomun ayak izi içindeki maksimum yüksekliklerin dağılımını verir.
9. Diğer hesaplama araçları ve özel bilgisayar programları tarafından özel analiz için Gwyddion'dan AFM verilerini dışa aktarın.

Sonuçlar

EVs yüzey fiksasyonu görüntüleme dizisinde kritik bir adımdır. Negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların elektrostatik yüzey immobilizasyonu mikanın substratı pozitif yüzey yüküne sahip olacak şekilde değiştirildikten sonra sağlam bir şekilde ortaya çıkar. NiCl₂ ile pozitif yüzey değişiklikleri sağlamak için tedavi olmadan, substrat üzerinde EVs immobilizasyon etkisiz olduğu bulunmuştur. Şekil 10A'dakiyükseklik görüntüsü, PBS'n...

Tartışmalar

EVs'nin biyolojik bir sıvıdan immobilizasyonu, yüzey taraması ve görüntü analizi, sıvı daki EV'lerin AFM karakterizasyonu için geliştirilen protokolün temel adımlarıdır. Görüntülenmiş yüzey alanı ve substrat üzerinde immobilize veziküllerin yüzey konsantrasyonu ile AFM görüntüleme ölçekler için uygun veziküllerin sayısı. EVs ve ekzozomlar¹⁸negatif zeta potansiyeli göz önüne alındığında, biz AFM substrat sıvı numunelerden EVs elektrostatik fiksasyon savunuc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4