原子力显微镜对细胞外囊泡的成像

摘要

描述了一个分步程序，用于从液体样品中分离体和细胞外囊泡的无标签固定，并通过原子力显微镜（AFM）进行成像。AFM 图像用于估计溶液中囊泡的大小，并描述其他生物物理特性。

摘要

外体和其他细胞外囊泡 （EV） 是分子复合物，由脂质膜囊泡、其表面装饰（由膜蛋白和其他分子）和从母细胞（包括RNA）继承的多种发光含量组成，蛋白质和DNA。EV的流体动力学尺寸的表征，取决于由表面装饰形成的囊泡和其冠状层的大小，已成为常规。对于最小EV的外生体，水动力和囊泡大小之间的相对差异显著。低温透射电子显微镜（低温-TEM）成像（低温-TEM）成像对囊泡尺寸的表征仍然是一项挑战，因为仪器的成本、执行样品制备、成像和样品制备所需的专业知识数据分析，以及图像中经常观察到的少量粒子。原子力显微镜（AFM）是一个广泛提供且易于获取的替代方法，它可以生成关于细胞外囊泡的三维几何形状、尺寸和其他生物物理特性的通用数据。开发的协议指导用户使用此分析工具，并概述了 AFM 分析 EV 的工作流程，其中包括水合或干燥形式的成像 EV 的样品制备、静电固定基板上的囊泡、数据采集、分析和解释。具有代表性的结果表明，EV在修改后的云母表面的固定是可预测的、可定制的，并允许用户获得大量囊泡的尺寸调整结果。根据AFM数据进行囊泡尺寸的尺寸与低温-TEM成像一致。

引言

细胞外囊泡 （EV） 存在于所有体液中，包括血液、尿液、唾液、牛奶和羊水。外体体形成一个区域类别的EV与其他EV不同，通过内生，内生子途径的标记，和所有EV中最小的尺寸。外体体的大小经常被报告，在研究之间有很大的变异性。大小调整结果与方法相关，反映了不同分析技术用于估计EV^尺寸1，2的物理原理的差异。例如，纳米粒子跟踪分析 （NTA） 是使用最广泛的尺寸表征技术，它估计了 EV 的大小作为流体动力学直径，该直径描述了溶液中 EV 对布朗流动性的阻力。囊泡的流体动力学直径越大，意味着它在液体中的流动性较低。囊泡周围的冠状层，由表面蛋白质和其他固定在膜表面或吸附的分子组成，严重阻碍流动性，增加EV的流体动力学尺寸。相对而言，这种增加对于外体^体3来说特别大，如图1所示。

低温透射电子显微镜（低温-TEM）成像是描述囊泡大小和形态在其水合状态的明确技术。然而，仪器的高成本和使用它所需的专业知识正确地激发了对可成像水合电动汽车的替代技术的探索。在采集的低温-TEM 图像中观察到或特征的 EV 数量相对较少，是该技术的另一个显著缺点。

原子力显微镜（AFM）通过扫描基板上的探针来栅格显示表面粒子的图像，从而可视化水合或^{干燥EV4、5、6}的三维地形。本研究概述了协议对AFM的EV特征的基本步骤。在液体中成像囊泡之前，必须将其固定在基板上，通过系绳到功能化表面、困在过滤器中或静电吸引力⁷。在带正电基板上的静电固定是一种特别方便的选择，用于对已知具有负Zeta电位的外体体进行固定。然而，固定表面细胞外囊泡的同样的静电力也会扭曲其形状，这使得成像后数据分析变得至关重要。我们通过描述基于固定在表面上的外体体变形形状的AFM数据估计溶液中球状囊泡大小的算法来阐述这一点。

在已开发的协议中，介绍了囊泡强稳定处理程序，并随后介绍了在水合或干燥状态下执行原子力成像所需的步骤。确定了影响固定囊泡表面浓度的因素。指导如何对溶液中不同浓度的EV样品进行静电固定。讨论了基于足够数量的固定囊泡估计不同生物物理特性的经验概率分布的实验条件的选择。给出了AFM数据成像后分析的例子。具体来说，描述了一种算法，用于根据固定性EV的AFM特征来确定溶液中囊泡的大小。具有代表性的结果表明AFM的囊泡大小与低温-TEM成像结果的一致性。

研究方案

1. 将EV与生物流体分离

1. 通过一种既定方法隔离电动汽车，如差分超离^心8、降水或尺寸排除色谱^学9。
2. 确认是否存在预期的表面和发光生物标志物，以及没有表明制剂交叉污染的生物标志物。通过电子显微镜确认分离粒子的脂质双层形态。
   注:在隔离外生体时，由纳米粒子跟踪分析（NTA）或动态光散射测量的水动力大小分布应处于预期范围内。EV 和外体隔离的详细信息超出了此协议的范围。所选方法取决于实验问题和研究^目标10。以下步骤提供了通过从MCF-7乳腺癌细胞的生长培养基中沉淀来丰富外体的过程的具体例证，使用市售的沉淀试剂盒（材料表）。
3. 在细胞培养扩张之前，将MCF-7乳腺癌细胞储存在液氮中。将细胞解冻至亚培养。
4. 遵循无菌做法，在 150 mm 板上执行电池电镀。使用由Eagle的最小必需介质、0.01mg/mL人体重组胰岛素和10%不含外泌体胎儿牛血清组成的生长培养基。
5. 以95%的空气和5%_的CO2使培养基，并在37°C下孵育。
6. 细胞沉淀后（电镀后约24小时），更换介质。以 1:10 的比例分割板，并培养 10 个板，每个板包含 20 mL 的介质。
7. 当细胞仍处于生长阶段时，从其中9个板（180 mL）以±70~80%汇合的收集光组和池介质。
8. 将介质分成 60 mL 和 120 mL，进一步拆分为 30 mL/管，并在 3，000 x g下离心 15 分钟。
9. 将上清液从每个管转移到新的无菌 50 mL 管，并执行外体隔离。
10. 如果使用了商业隔离套件（材料表），则根据已公布的协议（例如，参见参考^{文献表 11）}通过沉淀分离外泄体，或按照制造商的说明进行分离。作为后一种情况的第一步，在3，000 x g下，离心细胞培养基为15分钟。提取上清液并丢弃细胞和细胞碎片。
11. 将沉淀溶液（1:5体积比）添加到上清液中，混合并冷藏过夜。
12. 在室温下以1，500 x g离心30分钟。离心后丢弃上清液。
13. 在1，500 x g下再旋转剩余的外兆颗粒5分钟。在不干扰颗粒的情况下，通过吸入去除剩余的沉淀溶液。
14. 将颗粒重新悬浮在 100×500 μL 的 1x 磷酸盐缓冲盐 （PBS） 缓冲液中，并根据需要分成多个等分，以便进行下游分析。
15. 立即对分离的外体体进行表面固定，进行AFM成像。如有必要，将等分在-80°C冷冻，以便日后使用，同时采取预防措施，避免在冷冻-解冻周期期间损坏样品。

2. 细胞外囊泡的表面固定

1. 使用坚固的双面胶带、环氧树脂或替代粘合剂将云母盘牢固地连接到 AFM/扫描隧道显微镜 （STM） 磁性不锈钢试样盘上。
2. 使用锋利的剃须刀或实用刀，或将胶带固定在顶部表面，然后将其剥离以去除一层材料，从而切割云母圆盘。
   注: 这两种方法都应通过去除以前暴露于环境中的薄层云母来显示原始表面。手术后，云母与 AFM/STM 金属试样盘的附件必须保持牢固。
3. 在室温下，使用 100 μL 的 10 mM NiCl₂溶液处理云母的顶面 10 s，从而将表面电荷从负数修改为正。
4. Blot NiCl₂溶液，无绒擦拭或印迹纸。用去离子 （DI） 水清洗云母表面 3x，用干氮流将其干燥。
   注:最好使用 AFM 扫描修改后的表面，以确认其无污染物。
5. 将 AFM 试样盘与附加的表面改性云母放在培养皿中。
6. 用1x PBS稀释步骤1.14中的外体样品，以获得4.0 x 10⁹和4.0 x^{10 10颗粒}之间的浓度。每mL溶液。使用 NTA 验证稀释的颗粒浓度。
7. 从移液器中排空100 μL稀释的外在体溶液，在云母表面形成顺流滴。
8. 将盖子放在培养皿上，用石蜡薄膜密封，以减少样品蒸发。在4°C下孵育样品12~18小时。
   注:固定外体的表面密度会随着孵育时间和液体中EV的浓度而增加。如果样品中存在浓度较低的外体，则可能需要更长的孵育时间。
9. 孵育后，吸出80~90%的样品，而不会干扰表面。此时，外体将静电固定在云母基板上。
10. 在成像水合性 EV 之前，使用 1x PBS 冲洗表面。重复 3 次。注意在整个击球过程中保持样品水分。
11. 用 1x PBS 清洗云母表面后，取出 80%~90% 的液体，并移液器 +40 μL 的新鲜 1x PBS 覆盖样品。
12. 对干燥EV进行成像时，用DI水冲洗基板。重复 3 次。
    注:用DI水稀释会防止盐晶体的形成和基底干燥时溶质在表面上沉积。
13. 在成像干燥 EV 之前，在不接触表面的情况下吸收尽可能多的液体，用干氮流干燥其余部分。

3. AFM成像

1. 要对干燥 EV 进行成像，请选择用于在攻丝和非接触式成像模式下在空中扫描的悬臂，并将其安装到探头支架上。
   注: 在选择与可用 AFM 仪器兼容的探头时，可作为选择与可用 AFM 仪器兼容的探头时，使用材料表中列出的悬臂示例特性（123 μm 长度、40 μm 宽度、7 nm 尖端半径和 37 N/m 弹簧常数）。
   1. 将步骤 2.13 的准备放在 AFM 阶段。磁性不锈钢试样盘将固定样品在舞台上。留出时间进行准备，让舞台以热平衡。
   2. 使用攻丝模式扫描云母表面足够大的区域。例如，选择5 x 5 μm的面积，以±1 Hz的扫描速率在512条线中栅格。 获取高度和相位图像，因为它们提供有关样品地形和表面特性的补充信息。
      注: 扫描时间会随着图像区域和选择形成图像的行数而增加，但随着扫描速率定义为每秒扫描的行数，扫描时间将减小。快速扫描速率可能会影响图像质量。因此，栅格的速度应在采集时间和图像质量之间在司法上平衡。
2. 要成像水合体囊泡，请选择适合扫描柔软、水合样品的悬臂，并将悬臂安装到用于液体扫描的探头支架上。
   注: 在选择与可用 AFM 仪器兼容的探头时，材料表中列出的探头规格（标称长度为 175 μm、宽度 22 μm、20 nm 尖端半径、0.07 N/m 弹簧常数的三角形悬臂）和优化了在 4 到 8 kHz 范围内的驱动器频率的成像，可作为指南。
   1. 用 1x PBS 将悬臂的尖端湿润，以减少在扫描过程中将气泡引入液体的可能性。
   2. 将步骤 2.11 的准备放在 AFM 阶段。磁性不锈钢试样盘将固定在其表面的装有固定 EV 的所连接的云母。
   3. 留出时间进行准备，让 AFM 级以热平衡。
   4. 在攻丝模式下对水合的云母表面进行成像。获取高度和相位图像。
      注: 成像质量受仪器、所选探头和扫描参数的影响。优化扫描条件时，以下选项可作为起点:512 条线路扫描的 5 x 5 μm 区域，扫描速率为 +0.8-1.0 Hz，驱动频率介于 4 到 8 kHz 之间。

4. 图像分析

注: 以下数据处理和分析步骤应用于采集的高度图像。可以调整类似的过程来分析相位数据。下面的描述是特定于Gwydion^12，一个根据GNU通用公共许可证提供的自由和开源软件。其他软件工具也有类似的功能。

1. 转到数据处理，SPM模式，提示并选择模型提示（图2）。选择用于扫描样本的几何体和尖端的尺寸，然后单击"确定"。
2. 通过执行曲面重建来校正尖端侵蚀伪影。打开图像。从菜单中，选择"数据处理"、"SPM模式"提示，然后选择"曲面重建"并单击"确定"（图 3）。
3. 通过从扫描数据中删除基板中的倾斜，对齐成像平面以匹配实验室 XY 平面。要完成此任务，请选择"数据处理""级别"并选择平面级别（图 4）。
4. 通过选择"数据处理""更正数据"对齐图像行，然后选择"对齐行"。有几个对齐选项可用 （图 5）。例如，Median是一种算法，用于查找每个扫描线的平均高度并从数据中减去它。
5. 转到数据处理，更正数据，然后选择"删除疤痕"（图6），这可消除常见的扫描错误，称为疤痕。
6. 通过选择从数据处理中访问的"水平"下拉菜单中的"拼合基"，在零高度 Z = 0 处对齐云母表面（图 7）。
7. 使用"按阈值在颗粒中标记"下拉菜单（图 8A）识别扫描表面上的 EV。该算法将表面固定外在体体识别为从零表面基底伸出的粒子，其高度高于用户选择的阈值。选择 1 到 3 nm 范围内的阈值，这将消除大多数背景干扰。较小的阈值用于更清洁的背景。
   注:图 8A中的阈值为 1.767 nm。具有此阈值的 MCF-7 外在体识别的结果如图8B所示。Gwydion 提供了几种阈值的替代方法，作为自动识别图像中囊泡的算法，包括自动阈值（Otsu 方法）、边缘检测和分水岭算法。
   注: 粒子聚集物（如果存在于 AFM 图像中）可能被屏蔽并从分析中排除。
8. 使用从"颗粒"菜单访问的可用分布算法，对已识别的 EV 执行几何和尺寸特征化。
   注: Gwydion 提供工具，用于评估在水合或干燥状态下固定式 EV 的标量值、areal、体积和其他特性的分布情况。如图 9所示的标量值属性示例，它给出了每个已识别的外显体足迹内的最大高度分布。
9. 从 Gwydion 导出 AFM 数据，以便其他计算工具和自定义计算机程序进行专门分析。

结果

电动汽车的表面固定是成像序列中的关键步骤。外体体静电表面固定（已知具有负齐塔电位）将在云母基板被修改为具有正表面电荷后发生。如果不使用NiCl₂进行表面正变化的处理，则发现基板上的EV固定作用无效。图10A中的高度图像，在含有2.59 x^{10 10囊}泡的MCF-7体外体样品后在空气中获得，每mL的PBS囊泡在未修改的云母表面孵育了12小时，显示在表面后...

讨论

从生物流体、表面扫描和图像分析中固定 EV 是开发中 EV 在液体中的 AFM 表征协议的基本步骤。与图像表面积和固定在基板上的囊泡的表面浓度一起，可适应AFM成像的囊泡数量。鉴于EV和外兆^体18的负zeta电位，我们提倡将EV从液体样品静态固定到AFM基板。当表面充满正电荷时，固定是有效的。在EV固定之前，可能需要向基材提供正表面电荷，如云母-一般公式KAl 2（AlSi₃O_10...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4