Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica

Resumo

Um procedimento passo a passo é descrito para a imobilização sem rótulo de exosomas e vesículas extracelulares de amostras líquidas e sua imagem por microscopia de força atômica (AFM). As imagens de AFM são usadas para estimar o tamanho das vesículas na solução e caracterizar outras propriedades biofísicas.

Resumo

Os exosomas e outras vesículas extracelulares (EVs) são complexos moleculares constituídos por uma vesícula de membrana lipídica, sua decoração superficial por proteínas de membrana e outras moléculas, e conteúdo Luminal diverso herdado de uma célula-mãe, que inclui RNAs, proteínas e DNAs. A caracterização dos tamanhos hidrodinâmicos de EVs, que depende do tamanho da vesícula e da sua camada coronal formada por decorações superficiais, tornou-se rotineira. Para os exosomas, o menor dos EVs, a diferença relativa entre os tamanhos hidrodinâmico e vesículas é significativa. A caracterização de tamanhos de vesículas pela imagem de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (Cryo-TEM), uma técnica de padrão-ouro, continua sendo um desafio devido ao custo do instrumento, a expertise necessária para realizar a preparação da amostra, a imagem e análise de dados, e um pequeno número de partículas muitas vezes observadas em imagens. Uma alternativa amplamente disponível e acessível é a microscopia de força atômica (AFM), que pode produzir dados versáteis sobre geometria tridimensional, tamanho e outras propriedades biofísicas de vesículas extracelulares. O protocolo desenvolvido orienta os usuários na utilização desta ferramenta analítica e delineia o fluxo de trabalho para a análise de EVs pelo AFM, que inclui a preparação da amostra para exames de imagem em forma hidratada ou desictada, a imobilização eletrostática de vesículas em um substrato, aquisição de dados, sua análise e interpretação. Os resultados representativos demonstram que a fixação de EVs na superfície modificada da mica é previsível, customizável, e permite que o usuário obtenha resultados da cola para um grande número vesículas. O dimensionamento de vesículas com base nos dados de AFM foi encontrado para ser consistente com a imagem latente de Cryo-TEM.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) estão presentes em todos os fluidos corporais, incluindo sangue, urina, saliva, leite e o líquido amniótico. Os exosomas formam uma classe distrital de EVs diferenciada de outros EVs por biogênese endossômica, os marcadores da via endossômica e o menor tamanho entre todos os EVs. O tamanho dos exosomas é relatado frequentemente com variabilidade substancial entre estudos. Os resultados de dimensionamento foram encontrados como dependentes do método, refletindo a diferença nos princípios físicos empregados por diferentes técnicas analíticas para estimar os^{tamanhos de EV}1,2. Por exemplo, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ― a técnica de caracterização de tamanho mais amplamente utilizada ― estima o tamanho dos EVs como seus diâmetros hidrodinâmicos, que caracterizam a resistência à mobilidade browniana de EVs na solução. Um diâmetro hidrodinâmico maior de uma vesícula implica sua menor mobilidade em líquido. A camada coronal em torno das vesículas, consistindo de proteínas superficiais e outras moléculas ancoradas ou adsortas à superfície da membrana, impede substancialmente a mobilidade e aumenta o tamanho hidrodinâmico dos EVs. Em termos relativos, esse aumento é particularmente grande para os exosomas³, como ilustrado na Figura 1.

A imagem latente da microscopia de elétron de transmissão criogênica (Cryo-tem) é uma técnica definitiva em caracterizar tamanhos e morfologia do vesícula em seus Estados hidratados. No entanto, o alto custo da instrumentação e a expertise especializada necessária para utilizá-lo motivam corretamente a exploração de técnicas alternativas que podem ser imagens hidratadas. Um número relativamente pequeno de EVs observado ou caracterizado nas imagens adquiridas de Cryo-TEM é uma outra desvantagem notável desta técnica.

A microscopia da força atômica (AFM) visualiza a topografia tridimensional de EVS hidratados ou Desiccated^4,5,6escaneando uma ponta de^{prova através da} carcaça para rasterear a imagem das partículas na superfície. Os passos essenciais do protocolo para caracterizar os EVs por AFM estão descritos neste estudo. Antes de imagem as vesículas em líquido, eles devem ser imobilizados em um substrato, quer amarrar a uma superfície funcionalizada, aprisionamento em um filtro, ou por atração eletrostática⁷. A fixação eletrostática em um substrato positivamente carregado é uma opção particularmente conveniente para a imobilização de exosomas conhecidas por ter um potencial zeta negativo. No entanto, as mesmas forças eletrostáticas que imobilizam as vesículas extracelulares na superfície também distorcem sua forma, o que torna essencial a análise de dados pós-imagem. Elaboramos este ponto descrevendo o algoritmo que estima o tamanho das vesículas globulares na solução com base nos dados da AFM sobre a forma distorcida dos exosomas imobilizados na superfície.

No protocolo desenvolvido, o procedimento para a imobilização eletrostática robusta de vesículas é apresentado e seguido pelas etapas necessárias para a realização de imagens de força atômica nos Estados hidratados ou desictados. Os fatores que influenciam a concentração superficial das vesículas imobilizadas são identificados. A orientação é dada sobre como realizar a imobilização eletrostática para amostras com diferentes concentrações de EVs na solução. Discute-se a seleção de condições experimentais que permitam estimar as distribuições de probabilidades empíricas de diferentes propriedades biofísicas com base em um número suficientemente grande de vesículas imobilizadas. Exemplos de análise pós-imagem dos dados do AFM são fornecidos. Especificamente, um algoritmo é descrito para determinar o tamanho das vesículas na solução com base na caracterização AFM de EVs imobilizados. Os resultados representativos mostram a consistência do dimensionamento de vesículas por AFM com os resultados da imagem latente de Cryo-TEM.

Protocolo

1. isolamento de EVs de um biofluide

1. Isole EVs por um dos métodos estabelecidos, tais como a ultracentlee diferencial⁸, a precipitação, ou a cromatografia do tamanho-exclusão⁹.
2. Confirme a presença de biomarcadores de superfície e luminal esperados e a ausência de biomarcadores que indiquem a contaminação cruzada da preparação. Confirme a morfologia do BICAMADA do lipido das partículas isoladas pela microscopia de elétron.
   Nota: ao isolar os exosomas, a distribuição de tamanho hidrodinâmico medida pela análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ou dispersão de luz dinâmica deve estar no intervalo esperado. Os detalhes de EV e isolamento exossomo estão além do escopo deste protocolo. O método selecionado dependerá das questões experimentais e do objetivo do estudo¹⁰. As seguintes etapas fornecem uma ilustração concreta do procedimento para enriquecer os exossomos pela precipitação do meio de crescimento de pilhas de cancro da mama MCF-7 usando um jogo comercialmente disponível da precipitação (tabela dos materiais).
3. Antes da expansão da cultura celular, armazene as células de câncer de mama MCF-7 em nitrogênio líquido. Descongelar as células para a subcultura.
4. Após práticas assépticas, realize o chapeamento de células em placas de 150 mm. Use o meio de crescimento composto pelo meio mínimo essencialde Eagle,0, 1 mg/ml de insulina recombinante humana e 10% de soro bovino fetal livre de exosome.
5. Aerar a cultura em 95% ar e 5% CO₂ e incubar a 37 °C.
6. Depois que as células são liquidadas (aproximadamente 24 h após o chapeamento), altere a mídia. Dividir a placa em 1:10 proporção e cultura dez placas, cada uma contendo 20 mL de mídia.
7. Os meios da colheita e da Associação de 9 destas placas (180 mL) em ~ 70−80% confluência quando as pilhas estão ainda na fase do crescimento.
8. Divida a mídia em 60 mL e 120 mL, divida mais em 30 mL/tubo e Centrifugue a 3.000 x g por 15 min.
9. Transfira o sobrenadante de cada tubo para um novo tubo estéril de 50 ml e realize o isolamento de exossomo.
10. Isole os exosomas por precipitação de acordo com os protocolos publicados (ver, por exemplo, referência¹¹) ou siga as instruçõesdo fabricante sefor utilizado um kit de isolamento comercial (tabela de materiais). Como um primeiro passo no último caso, o meio de célula centrífuga em 3.000 x g por 15 min. retirar sobrenadante e descartar células e restos de células.
11. Adicione a solução da precipitação (relação do volume 1:5) ao sobrenadante, misture, e leve à geladeira durante a noite.
12. Centrifugar a 1.500 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante após a centrifugação.
13. Gire a pelota exossomo restante por mais 5 min em 1.500 x g. Sem perturbar a pelota, remova a solução restante da precipitação pela aspiração.
14. Ressuscite o pellet em 100−500 μL de tampão de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS) e divida em múltiplas alíquotas, conforme necessário para a análise a jusante.
15. Proceder imediatamente à imobilização da superfície dos exosomas isolados para a imagem latente de AFM. Se necessário, congele as alíquotas em-80 °C para uso posterior enquanto toma precauções para evitar danos na amostra durante o ciclo de congelamento-descongelação.

2. fixação superficial de vesículas extracelulares

1. Use fita dupla face forte, epóxi ou um adesivo alternativo para anexar firmemente um disco de mica a um disco de amostra de aço inoxidável magnético AFM/scanning tunneling microscópio (STM).
2. Cleave mica disco usando uma navalha afiada ou faca de utilidade, ou anexando uma fita adesiva para a superfície superior e, em seguida, pealing-lo para remover uma camada de material.
   Nota: um ou outro método deve revelar uma superfície virgem removendo uma camada fina de mica expor previamente ao ambiente. Após o procedimento, o acessório de mica para o disco de amostra de metal AFM/STM deve permanecer firme.
3. À temperatura ambiente, trate a superfície superior de mica para 10 s com 100 μL de solução de NiCl₂ de 10 mm, que modifica a carga superficial de negativa para positiva.
4. Blot NiCl₂ solução com uma limpeza sem fiapos ou papel blotting. Lave a superfície mica 3x com água deionizada (DI) e seque-a com um fluxo de azoto seco.
   Nota: é uma boa prática digitalizar a superfície modificada com AFM para confirmar que está livre de contaminantes.
5. Coloque o disco de amostra AFM com a mica modificada de superfície anexada em uma placa de Petri.
6. Diluir a amostra de exossomo do passo 1,14 com 1X PBS para obter uma concentração entre 4,0 x 10⁹ e 4,0 x 10¹⁰ partículas por ml de solução. Validar a concentração de partículas diluídas utilizando NTA.
7. Formar uma gota sésseis na superfície da mica, esvaziando 100 μl da solução de exossomo diluída de uma pipeta.
8. Coloque a tampa na placa de Petri e sele-a com uma película de parafina para reduzir a evaporação da amostra. Incubar a amostra para 12−18 h a 4 °C.
   Nota: a densidade superficial dos exosomas imobilizados aumentará com o tempo de incubação e a concentração de EVs no líquido. O tempo de incubação mais longo pode ser necessário se os exosomas estiverem presentes na amostra em concentrações mais baixas.
9. Após a incubação, aspirar 80−90% da amostra sem perturbar a superfície. Neste ponto, os exosomas serão imobilizados eletrostaticamente no substrato de mica.
10. Antes de imagens hidratadas EVs, enxague a superfície com 1X PBS. Repita 3x. Tome cuidado para manter a amostra hidratada durante todo o processo de enxaguadela.
11. Depois de lavar a superfície mica com 1X PBS, remover 80%−90% de líquido, e pipeta ~ 40 μL de fresco 1X PBS para cobrir a amostra.
12. Quando a imagem latente os EVs Desiccated, enxague o substrato com água DI. Repita 3x.
    Nota: enxágue com água DI impedirá a formação de cristais de sal e a deposição de solutos na superfície à medida que o substrato secar.
13. Antes da imagem latente EVs Desiccated, aspirar tanto quanto líquido como possível sem tocar na superfície e secar o descanso com um córrego do nitrogênio seco.

3. imagem latente de AFM

1. Para a imagem dos EVs dessecados, selecione um cantilever projetado para digitalizar no ar em modos de imagem de toque e sem contato e montá-lo no suporte da sonda.
   Nota: as características de um exemplo de cantilever listado na tabela de materiais (comprimento de 123 μm, largura de 40 μm, raio de ponta de 7 nm e 37 constante de mola N/m) podem ser usadas como um guia ao selecionar uma sonda compatível com a instrumentação AFM disponível.
   1. Coloque a preparação da etapa 2,13 no estágio AFM. O disco magnético do espécime do aço inoxidável imobilizará a amostra no estágio. Reserve tempo para a preparação e o estágio para equilibrar termicamente.
   2. Utilize o modo de toque para digitalizar uma área suficientemente grande da superfícieda mica. Por exemplo, escolha uma área de 5 x 5 μm, rastered em 512 linhas a uma taxa de digitalização de ~ 1 Hz. adquira as imagens de altura e de fase, pois elas fornecem informações complementares sobre a topografia e as propriedades superficiais da amostra.
      Nota: o tempo de digitalização aumentará com a área imaged e o número de linhas selecionadas para formar a imagem, mas diminuirá com a taxa de digitalização definida como o número de linhas digitalizadas por segundo. As taxas de digitalização rápidas podem afetar a qualidade da imagem. Portanto, a velocidade de motorizado deve equilibrar judicialmente a compensação entre o tempo de aquisição e a qualidade da imagem.
2. Para a imagem de vesículas hidratadas, selecione um cantilever apropriado para a digitalização de amostras suaves e hidratadas e monte o cantilever em um suporte de sonda projetado para a digitalização em líquidos.
   Nota: ao selecionar uma sonda compatível com a instrumentação AFM disponível, as especificações da sonda listada na tabela de materiais (cantilever triangular com 175 μm de comprimento nominal, 22 μm de largura, 20 nm ponta de raio, 0, 7 N/m mola constante, e otimizado para imagens com a frequência da unidade no intervalo entre 4 a 8 kHz) pode ser usado como um guia.
   1. Molhe a ponta do cantilever com 1X PBS para reduzir a probabilidade de introduzir bolhas de ar no líquido durante a exploração.
   2. Coloque a preparação da etapa 2,11 no estágio AFM. O disco magnético do espécime do aço inoxidável imobilizará a mica unida que contem EVs imobilizados em sua superfície.
   3. Reserve tempo para a preparação e a fase AFM para equilibrar termicamente.
   4. Imagem a superfície de mica hidratada no modo de toque. Adquira as imagens de altura e de fase.
      Nota: a qualidade de imagem é influenciada pela Instrumentação, sonda selecionada e parâmetros de digitalização. Ao otimizar as condições de digitalização, as seguintes opções podem ser usadas como ponto de partida: área de 5 x 5 μm escaneada em 512 linhas com taxa de digitalização de ~ 0,8-1,0 Hz e frequência de acionamento entre 4 a 8 kHz.

4. análise de imagem

Observação: as seguintes etapas de processamento e análise de dados são aplicadas às imagens de altura adquiridas. Um procedimento semelhante pode ser adaptado para analisar os dados da fase. A descrição abaixo é específica para Gwyddion¹², um software livre e de código aberto disponível GNU General Public License. Recursos semelhantes estão disponíveis em ferramentas de software alternativas.

1. Acesse processo de dados, modos SPM, dica e escolha dica de modelo (Figura 2). Selecione a geometria e as dimensões da dica usada para digitalizar a amostra e clique em OK.
2. Corrija os artefatos de erosão da ponta realizando a reconstrução da superfície. Abra a imagem. No menu, selecione processo de dados, modos SPM, dicae, em seguida, escolha reconstrução de superfície e clique em OK (Figura 3).
3. Alinhe o plano de imagem para coincidir com o plano XY do laboratório, removendo a inclinação do substrato dos dados de digitalização. Para realizar essa tarefa, selecione processo de dados, nível e escolha nível de plano (Figura 4).
4. Alinhe linhas da imagem selecionando processo de dados, dados corretos e escolha alinhar linhas. Várias opções de alinhamento estão disponíveis (Figura 5). Por exemplo, Median é um algoritmo que localiza uma altura média de cada linha de digitalização e o subtrai dos dados.
5. Vá para processo de dados, Corrija dados e escolha remover cicatrizes (Figura 6), que remove erros comuns de digitalização conhecidos como cicatrizes.
6. Alinhe a superfície de mica na altura zero, Z = 0, selecionando o menu suspenso nivelar base no nível acessível a partir do processo de dados (Figura 7).
7. Identifique os EVs na superfície digitalizada usando o menu suspenso marcar por limite em grãos (figura 8a). Este algoritmo identifica exosomas superfície-imobilizados como partículas salientes do substrato de superfície zero pela altura acima do limiar selecionado pelo usuário. Selecione um limite no intervalo entre 1 e 3 Nm, que eliminará a maior parte da interferência de fundo. Os limiares menores são usados com fundo mais limpo.
   Nota: o limiar na figura 8a é 1,767 nm. O resultado da identificação do exossomo MCF-7 com este limiarização é mostrado na Figura 8B. Gwyddion oferece várias alternativas para limiarização como o algoritmo para identificar automaticamente vesículas na imagem, incluindo limiarização automatizado (método de Otsu), detecção de borda, e o algoritmo de bacias hidrográficas.
   Nota: aglomerados de partículas, se presentes na imagem AFM, podem ser mascaradas e excluídas da análise.
8. Realize a caracterização geométrica e dimensional dos EVs identificados usando os algoritmos de distribuições disponíveis acessíveis a partir do menu grãos .
   Nota: gwyddion fornece ferramentas para avaliar a distribuição de propriedades escalar-valorizadas, areal, volumétrica, e outras de EVS imobilizados em um estado hidratado ou dessecadas. Um exemplo de uma propriedade de valores escalares é mostrado na Figura 9, que dá a distribuição de alturas máximas dentro da pegada de cada exosome identificado.
9. Exporte os dados do AFM da Gwyddion para análise especializada por outras ferramentas computacionais e programas de computador personalizados.

Resultados

A fixação de superfície de EVs é uma etapa crítica na seqüência da imagem latente. A imobilização de superfície eletrostática de exosomas, conhecida por ter um potencial zeta negativo, ocorrerá de forma robusta após a modificação do substrato da mica para ter uma carga superficial positiva. Sem o tratamento com NiCl₂ para transmitir mudanças de superfície positivas, a imobilização de EVS no substrato foi encontrada para ser ineficaz. A imagem de altura na Figura 10A

Discussão

A imobilização de EVs de um líquido biológico, de uma exploração de superfície, e de uma análise da imagem é as etapas essenciais do protocolo desenvolvido para a caracterização de AFM dos EVs no líquido. O número de vesículas em escalas de imagem AFM com a área de superfície imaged e a concentração superficial das vesículas imobilizadas no substrato. Dado um potencial zeta negativo de EVS e de exossomos¹⁸, nós advogamos a fixação eletrostática dos EVS das amostras líquidas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4