Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

Résumé

Une procédure étape par étape est décrite pour l'immobilisation sans étiquette des exosomes et des vésicules extracellulaires à partir d'échantillons liquides et leur imagerie par microscopie de force atomique (AFM). Les images de l'AFM sont utilisées pour estimer la taille des vésicules de la solution et caractériser d'autres propriétés biophysiques.

Résumé

Les exosomes et autres vésicules extracellulaires (VEV) sont des complexes moléculaires constitués d'une vésicule de membrane lipidique, de sa décoration de surface par des protéines membranaires et d'autres molécules, et d'un contenu luminaire diversifié hérité d'une cellule parente, qui comprend des ARN, protéines et les ANN. La caractérisation des tailles hydrodynamiques des véhicules électriques, qui dépend de la taille de la vésicule et de sa couche coronale formée par des décorations de surface, est devenue routinière. Pour les exosomes, le plus petit des véhicules électriques, la différence relative entre les tailles hydrodynamiques et vésicules est significative. La caractérisation de la taille des vésicules par l'imagerie par électron de transmission cryogénique (cryo-TEM), une technique d'étalon-or, demeure un défi en raison du coût de l'instrument, de l'expertise requise pour effectuer la préparation de l'échantillon, l'imagerie et data, et un petit nombre de particules souvent observées dans les images. Une alternative largement disponible et accessible est la microscopie de force atomique (AFM), qui peut produire des données polyvalentes sur la géométrie tridimensionnelle, la taille, et d'autres propriétés biophysiques des vésicules extracellulaires. Le protocole développé guide les utilisateurs dans l'utilisation de cet outil d'analyse et décrit le flux de travail pour l'analyse des véhicules électriques par l'AFM, qui comprend la préparation de l'échantillon pour l'imagerie des véhicules électriques sous forme hydratée ou desséchée, l'immobilisation électrostatique de vésicules sur un substrat, l'acquisition de données, son analyse et son interprétation. Les résultats représentatifs démontrent que la fixation des véhicules électriques sur la surface modifiée du mica est prévisible, personnalisable et permet à l'utilisateur d'obtenir des résultats de dimensionnement pour un grand nombre de vésicules. Le dimensionnement de la vésicule basé sur les données de l'AFM s'est avéré compatible avec l'imagerie cryo-TEM.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont présentes dans tous les liquides organiques, y compris le sang, l'urine, la salive, le lait et le liquide amniotique. Les exosomes forment une classe de district d'EV différenciés des autres véhicules électriques par la biogenèse endosomale, les marqueurs de la voie endosomal, et la plus petite taille parmi tous les véhicules électriques. La taille des exosomes est souvent rapportée avec une variabilité substantielle entre les études. Les résultats de dimensionnement ont été jugés dépendants de la méthode, reflétant la différence dans les principes physiques utilisés par différentes techniques analytiques pour estimer les tailles EV^1,2. Par exemple, l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA), la technique de caractérisation de la taille la plus utilisée, estime la taille des véhicules électriques comme leurs diamètres hydrodynamiques, qui caractérisent la résistance à la mobilité Brownienne des véhicules électriques dans la solution. Un diamètre hydrodynamique plus grand d'une vésicule implique sa mobilité plus faible en liquide. La couche coronale autour des vésicules, composée de protéines de surface et d'autres molécules ancrées ou adsorbées à la surface de la membrane, entrave considérablement la mobilité et augmente la taille hydrodynamique des véhicules électriques. En termes relatifs, cette augmentation est particulièrement importante pour les exosomes³, comme l'illustre la figure 1.

L'imagerie par électron de transmission cryogénique (cryo-TEM) est une technique définitive pour caractériser la taille et la morphologie des vésicules dans leurs états hydratés. Cependant, le coût élevé de l'instrumentation et l'expertise spécialisée nécessaire pour l'utiliser correctement motivent l'exploration de techniques alternatives qui peuvent image hydratée EV. Un nombre relativement faible d'EV observés ou caractérisés dans les images cryo-TEM acquises est un autre inconvénient notable de cette technique.

La microscopie par force atomique (AFM) visualise la topographie tridimensionnelle des véhicules électriques hydratés ou desséchés^4,5,6 en scannant une sonde à travers le substrat pour raster l'image des particules à la surface. Les étapes essentielles du protocole pour caractériser les véhicules électriques par l'AFM sont décrites dans cette étude. Avant d'imagerie des vésicules en liquide, ils doivent être immobilisés sur un substrat soit en s'attachant à une surface fonctionnalisée, en piégeant dans un filtre, ou par attraction électrostatique⁷. La fixation électrostatique sur un substrat chargé positivement est une option particulièrement pratique pour l'immobilisation des exosomes connus pour avoir un potentiel zeta négatif. Cependant, les mêmes forces électrostatiques qui immobilisent les vésicules extracellulaires à la surface déforment également leur forme, ce qui rend l'analyse des données post-imagerie essentielle. Nous élaborons ce point en décrivant l'algorithme qui estime la taille des vésicules globulaires dans la solution en fonction des données de l'AFM sur la forme déformée des exosomes immobilisés à la surface.

Dans le protocole développé, la procédure pour l'immobilisation électrostatique robuste des vésicules est présentée et suivie par les étapes nécessaires pour effectuer l'imagerie de force atomique dans les états hydratés ou desséchés. Les facteurs qui influencent la concentration de surface des vésicules immobilisées sont identifiés. Les conseils sont donnés sur la façon d'effectuer l'immobilisation électrostatique pour les échantillons avec différentes concentrations de véhicules électriques dans la solution. La sélection de conditions expérimentales permettant l'estimation des distributions empiriques de probabilité de différentes propriétés biophysiques basées sur un nombre suffisamment élevé de vésicules immobilisées est discutée. Des exemples d'analyse post-imagerie des données de l'AFM sont donnés. Plus précisément, un algorithme est décrit pour déterminer la taille des vésicules dans la solution basée sur la caractérisation AFM des véhicules électriques immobilisés. Les résultats représentatifs montrent la cohérence du dimensionnement de la vésicule par l'AFM avec les résultats de l'imagerie cryo-TEM.

Protocole

1. Isolement des véhicules électriques d'un biofluide

1. Isoler les véhicules électriques par l'une des méthodes établies, telles que l'ultracentrifugation différentielle⁸, précipitations, ou chromatographie de taille-exclusion⁹.
2. Confirmer la présence de biomarqueurs de surface et de lumière attendus et l'absence de biomarqueurs indiquant une contamination croisée de la préparation. Confirmer la morphologie bicouche lipidique des particules isolées par microscopie électronique.
   REMARQUE : Lors de l'isoler des exosomes, la distribution de la taille hydrodynamique mesurée par l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA) ou la diffusion dynamique de la lumière devrait se situer dans la plage prévue. Les détails de l'isolement EV et exosome sont au-delà de la portée de ce protocole. La méthode choisie dépendra de questions expérimentales et de l'objectif de l'étude¹⁰. Les étapes suivantes fournissent une illustration concrète de la procédure visant à enrichir les exosomes par les précipitations du milieu de croissance des cellules cancéreuses du sein MCF-7 à l'aide d'une trousse de précipitations disponible dans le commerce (Tableau des matériaux).
3. Avant l'expansion de la culture cellulaire, entreposez les cellules cancéreuses du sein MCF-7 dans de l'azote liquide. Décongeler les cellules à la sous-culture.
4. Après des pratiques aseptiques, effectuer le placage cellulaire sur des plaques de 150 mm. Utilisez le milieu decroissance composé du milieu essentiel minimum de l'Aigle, de l'insuline recombinante humaine de 0,01 mg/mL et du sérum bovin fœtal sans exosome.
5. Aérer la culture de 95% d'air et 5% de CO₂ et incuber à 37 oC.
6. Après que les cellules sont réglées (environ 24 h après le placage), changer le support. Divisez la plaque à 1:10 ratio et la culture dix plaques, chacune contenant 20 ml de médias.
7. Les prises de support et de mise en commun de 9 de ces plaques (180 ml) à une confluence de70à 80 % lorsque les cellules sont encore en phase de croissance.
8. Diviser les supports en 60 ml et 120 ml, en répartir en 30 ml/tube et centrifuger à 3 000 x g pendant 15 min.
9. Transférer le supernatant de chaque tube dans un nouveau tube stérile de 50 ml et effectuer l'isolement exosome.
10. Isoler les exosomes par précipitation selon les protocoles publiés (voir, par exemple, la référence¹¹) ou suivre les instructionsdufabricant si un kit d'isolement commercial(tableau des matériaux)est utilisé. Dans ce dernier cas, le milieu cellulaire centrifugeà 3 000 x g pendant 15 min. Retirez les supernatants et jetez les cellules et les débris cellulaires.
11. Ajouter la solution de précipitation (rapport de volume de 1:5) au supernatant, mélanger et réfrigérer toute la nuit.
12. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 30 min à température ambiante. Jeter le supernatant après centrifugation.
13. Faire tourner le reste de la pastille exosome pendant 5 min à 1 500 x g. Sans déranger la pastille, retirez la solution de précipitation restante par aspiration.
14. Resuspendre la pastille en 100à500 oL de tampon salin tampon salin (PBS) tampon tampon tampon tampon tampon de phosphate (PBS) et diviser en plusieurs aliquots au besoin pour l'analyse en aval.
15. Procéder immédiatement à l'immobilisation de surface des exosomes isolés pour la formation image d'AFM. Si nécessaire, congeler les aliquots à -80 oCpour une utilisation ultérieure tout en prenant des précautions pour éviter d'endommager l'échantillon pendant le cycle de gel-dégel.

2. Fixation de surface des vésicules extracellulaires

1. Utilisez du ruban adhésif recto-verso, de l'époxy ou un adhésif alternatif pour attacher fermement un disque de mica à un disque magnétique de spécimen en acier inoxydable (STM) du microscope magnétique AFM/scanning ( STM).
2. Cleave disc mica en utilisant un rasoir pointu ou un couteau utilitaire, ou en attachant un ruban adhésif à la surface supérieure, puis le pealing hors pour enlever une couche de matériau.
   REMARQUE : L'une ou l'autre méthode devrait révéler une surface vierge en enlevant une fine couche de mica précédemment exposée à l'environnement. Après la procédure, l'attachement du mica au disque de spécimen métallique AFM/STM doit rester ferme.
3. À température ambiante, traitez la surface supérieure du mica pendant 10 s avec une solution de 100 oL de 10 ml NiCl_2, qui modifie la charge de surface de négative à positive.
4. Blot NiCl₂ solution avec une lingette sans papier sans papier ou de papier buvard. Laver la surface du mica 3x avec de l'eau déionisée (DI) et la sécher avec un jet d'azote sec.
   REMARQUE : Il est bon de scanner la surface modifiée avec l'AFM pour confirmer qu'elle est exempte de contaminants.
5. Placer le disque de spécimen d'AFM avec le mica modifié à la surface attaché dans un plat de Petri.
6. Diluer l'échantillon exosome de l'étape 1.14 avec 1x PBS pour obtenir une concentration entre 4,0 x 10⁹ et 4,0 x^{10 10} particules par mL de solution. Valider la concentration de particules diluées à l'aide de ntA.
7. Former une goutte de sessile à la surface du mica en vidant 100 l de la solution exosome diluée d'une pipette.
8. Placer le couvercle sur le plat de petri et le sceller avec un film de paraffine pour réduire l'évaporation de l'échantillon. Incuber l'échantillon de 12à18 h à 4 oC.
   REMARQUE : La densité de surface des exosomes immobilisés augmentera avec le temps d'incubation et la concentration des véhicules électriques dans le liquide. Un temps d'incubation plus long peut être nécessaire si des exosomes sont présents dans l'échantillon à des concentrations plus faibles.
9. Après l'incubation, aspirez 80à90 % de l'échantillon sans perturber la surface. À ce stade, les exosomes seront électrostatiquement immobilisés sur le substrat de mica.
10. Avant l'imagerie hydraté e Vs, rincer la surface avec 1x PBS. Répéter 3x. Prenez soin de garder l'échantillon hydraté tout au long du processus de rinçant.
11. Après avoir lavé la surface du mica avec 1x PBS, retirer 80 %à90 % du liquide et une pipette de 40 l de PBS 1x frais pour couvrir l'échantillon.
12. Lors de l'imagerie des véhicules électriques desséchés, rincez le substrat avec de l'eau DI. Répéter 3x.
    REMARQUE : Le rinçant à l'eau DI empêchera la formation de cristaux de sel et le dépôt de solutés à la surface au fur et à mesure que le substrat sèche.
13. Avant l'imagerie dessiccated EV, aspirer autant de liquide que possible sans toucher la surface et sécher le reste avec un flux d'azote sec.

3. Imagerie AFM

1. Pour imager les véhicules électriques desséchés, sélectionnez un porte-à-faux conçu pour la numérisation dans l'air en tapant et en mode d'imagerie sans contact et montez-le sur le porte-sonde.
   REMARQUE : Les caractéristiques d'un porte-à-faux d'exemple figurant dans table des matériaux (123 m de longueur, 40 m de largeur, 7 nm de rayon de pointe et 37 N/m de ressort constant) peuvent être utilisées comme guide lors de la sélection d'une sonde compatible avec l'instrumentation AFM disponible.
   1. Placez la préparation à partir de l'étape 2.13 sur la scène AFM. Le disque magnétique en acier inoxydable immobilisera l'échantillon sur la scène. Prévoyez du temps pour que la préparation et la scène s'équilibrent thermiquement.
   2. Utilisez le mode de tapotement pour scanner une surface suffisamment grande de la surfacedumica. Par exemple, choisissez une superficie de 5 x 5 m, rastered en 512 lignes à un taux d'analyse de 1 Hz. Acquérir à la fois la hauteur et les images de phase car ils fournissent des informations complémentaires sur la topographie et les propriétés de surface de l'échantillon.
      REMARQUE : Le temps d'analyse augmentera avec la zone d'image et le nombre de lignes sélectionnées pour former l'image, mais diminuera avec le taux d'analyse défini comme le nombre de lignes numérisées par seconde. Les taux d'analyse rapide peuvent avoir un impact sur la qualité de l'image. Par conséquent, la vitesse de rastering devrait sensiblement équilibrer le compromis entre le temps d'acquisition et la qualité de l'image.
2. Pour imager les vésicules hydratées, sélectionnez un porte-à-faux approprié pour la numérisation d'échantillons mous et hydratés et montez le porte-porte-porte-porte-couleurs sur un porte-sonde conçu pour la numérisation dans les liquides.
   REMARQUE : Lors de la sélection d'une sonde compatible avec l'instrumentation AFM disponible, les spécifications de la sonde figurant dans Tableau des matériaux (porte-à-faux triangulaire de 175 m de longueur nominale, largeur de 22 m, rayon de pointe de 20 nm, constante de ressort de 0,07 N/m, et optimisé pour l'imagerie avec la fréquence d'entraînement dans la gamme entre 4 à 8 kHz) peut être utilisé comme un guide.
   1. Mouillez la pointe du porte-à-faux avec 1x PBS pour réduire la probabilité d'introduire des bulles d'air dans le liquide pendant la numérisation.
   2. Placez la préparation à partir de l'étape 2.11 sur la scène AFM. Le disque magnétique en acier inoxydable immobilisera le mica attaché contenant des véhicules électriques immobilisés à sa surface.
   3. Prévoyez du temps pour que la préparation et l'étape De l'AFM s'équilibrent thermiquement.
   4. Imagez la surface du mica hydraté en mode tapant. Acquérir à la fois la hauteur et les images de phase.
      REMARQUE : La qualité de l'imagerie est influencée par l'instrumentation, la sonde sélectionnée et les paramètres d'analyse. Lors de l'optimisation des conditions de numérisation, les choix suivants peuvent être utilisés comme point de départ : 5 x 5 m de surface numérisés en 512 lignes avec un taux d'analyse et une fréquence d'entraînement de 0,8 à 1,0 Hz entre 4 et 8 kHz.

4. Analyse d'image

REMARQUE : Les étapes suivantes de traitement et d'analyse des données sont appliquées aux images de hauteur acquises. Une procédure similaire peut être adaptée pour analyser les données de phase. La description ci-dessous est spécifique à Gwyddion¹², un logiciel libre et open source disponible sous GNU General Public License. Des capacités similaires sont disponibles dans les outils logiciels alternatifs.

1. Aller à Data Process, modes SPM, Astuce et choisissez Astuce modèle (Figure 2). Sélectionnez la géométrie et les dimensions de la pointe utilisée pour scanner l'échantillon et cliquez sur OK.
2. Corriger les artefacts d'érosion de la pointe en effectuant la reconstruction de surface. Ouvrez l'image. Dans le menu, sélectionnez Data Process, modes SPM, Astuce, puis choisissez Surface Reconstruction et cliquez sur OK (Figure 3).
3. Alignez le plan d'imagerie pour qu'il corresponde au plan XY de laboratoire en supprimant l'inclinaison du substrat des données d'analyse. Pour accomplir cette tâche, sélectionnez Processus de données, Niveau et choisissez le niveau de l'avion (Figure 4).
4. Alignez les lignes de l'image en sélectionnant Data Process, Correct Data, puis choisissez Align Rows. Plusieurs options d'alignement sont disponibles (Figure 5). Par exemple, Median est un algorithme qui trouve une hauteur moyenne de chaque ligne d'analyse et la soustrait des données.
5. Aller à Data Process, Correct Data et choisissez Supprimer les cicatrices (Figure 6), qui supprime les erreurs de numérisation courantes connues sous le nom de cicatrices.
6. Alignez la surface du mica à la hauteur zéro, Z '0, en sélectionnant la base aplatie dans le menu de déclassement de niveau accessible à partir du processus de données (figure 7).
7. Identifiez les véhicules électriques sur la surface numérisée en utilisant le menu déroulant Mark by Threshold in Grains (figure 8A). Cet algorithme identifie les exosomes immobilisés en surface comme des particules dépassant du substrat à surface zéro par la hauteur au-dessus du seuil choisi par l'utilisateur. Sélectionnez un seuil dans la plage comprise entre 1 et 3 nm, ce qui éliminera la plupart des interférences d'arrière-plan. De plus petits seuils sont utilisés avec un fond plus propre.
   REMARQUE : Le seuil de la figure 8A est de 1,767 nm. Le résultat de l'identification exosome MCF-7 avec ce seuil est montré dans la figure 8B. Gwyddion offre plusieurs alternatives au seuil en tant qu'algorithme pour identifier automatiquement les vésicules dans l'image, y compris le seuil automatisé (méthode d'Otsu), la détection des bords et l'algorithme de bassin versant.
   REMARQUE : Les agglomérats de particules, s'ils sont présents dans l'image de l'AFM, peuvent être masqués et exclus de l'analyse.
8. Effectuer la caractérisation géométrique et dimensionnelle des véhicules électriques identifiés à l'aide des algorithmes de distribution disponibles accessibles à partir du menu Grains.
   REMARQUE : Gwyddion fournit des outils pour évaluer la distribution des propriétés scalaires, aréales, volumétriques et autres des véhicules électriques immobilisés dans un état hydraté ou désisté. Un exemple de propriété de valeurs scalaires est illustré dans la figure 9, qui donne la distribution des hauteurs maximales dans l'empreinte de chaque exosome identifié.
9. Exportez les données de l'AFM de Gwyddion pour une analyse spécialisée par d'autres outils informatiques et des programmes informatiques personnalisés.

Résultats

La fixation de surface des véhicules électriques est une étape critique dans la séquence d'imagerie. L'immobilisation de surface électrostatique des exosomes, connue pour avoir un potentiel négatif de zeta, se produira robustement après que le substrat du mica soit modifié pour avoir une charge positive de surface. Sans le traitement avec NiCl₂ pour donner des changements positifs de surface, l'immobilisation des véhicules électriques sur le substrat s'est avérée inefficace. L'image de hauteur de <...

Discussion

L'immobilisation des véhicules électriques à partir d'un fluide biologique, d'un balayage de surface et d'une analyse d'image sont les étapes essentielles du protocole élaboré pour la caractérisation des véhicules électriques par aFM en liquide. Le nombre de vésicules propices aux échelles d'imagerie AFM avec la surface imageetée et la concentration de surface des vésicules immobilisées sur le substrat. Compte tenu d'un potentiel zeta négatif des véhicules électriques et des exosomes^18,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4