Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Riepilogo

Viene descritta una procedura passo-passo per l'immobilizzazione senza etichette di esosomi e vescicoli extracellulari da campioni liquidi e la loro imaging mediante microscopia a forza atomica (AFM). Le immagini AFM vengono utilizzate per stimare le dimensioni delle vesciche nella soluzione e caratterizzare altre proprietà biofisiche.

Abstract

Gli esosomi e altre vesciche extracellulari (EV) sono complessi molecolari costituiti da una vescica della membrana lipidica, la sua decorazione superficiale da proteine della membrana e altre molecole, e diversi contenuti luminali ereditati da una cellula madre, che include RNA, proteine e DNA. La caratterizzazione delle dimensioni idrodinamiche dei VE, che dipende dalle dimensioni della vescica e dal suo strato coronale formato da decorazioni superficiali, è diventata di routine. Per gli esosomi, il più piccolo dei VE, la differenza relativa tra le dimensioni idrodinamiche e vescicle è significativa. La caratterizzazione delle dimensioni delle vesciche mediante l'imaging criogenico elettronico (crio-TEM), una tecnica gold standard, rimane una sfida a causa del costo dello strumento, delle competenze necessarie per eseguire la preparazione del campione, l'imaging e analisi dei dati, e un piccolo numero di particelle spesso osservate nelle immagini. Un'alternativa ampiamente disponibile e accessibile è la microscopia a forza atomica (AFM), in grado di produrre dati versatili sulla geometria tridimensionale, le dimensioni e altre proprietà biofisiche delle vesciche extracellulari. Il protocollo sviluppato guida gli utenti nell'utilizzare questo strumento analitico e delinea il flusso di lavoro per l'analisi dei veicoli elettrici da parte dell'AFM, che include la preparazione del campione per l'imaging dei vee EV in forma idratata o desiccata, l'immobilizzazione elettrostatica su un substrato, l'acquisizione dei dati, la sua analisi e interpretazione. I risultati rappresentativi dimostrano che la fissazione dei verisulla superficie mica modificata è prevedibile, personalizzabile e consente all'utente di ottenere risultati di dimensionamento per un gran numero di vesciche. Il dimensionamento della vescica basato sui dati AFM è risultato coerente con l'imaging crio-TEM.

Introduzione

Le vesciche extracellulari (EV) sono presenti in tutti i fluidi corporei, tra cui sangue, urina, saliva, latte e liquido amniotico. Gli esosomiti formano una classe distrettuale di veicoli elettrici differenziati dagli altri VE dalla biogenesi endosomica, dai marcatori del percorso endosomico e dalla dimensione più piccola tra tutti i veicoli elettrici. La dimensione degli esosomi è spesso riportata con una sostanziale variabilità tra gli studi. I risultati del dimensionamento sono risultati dipendenti dal metodo, riflettendo la differenza nei principi fisici impiegati da diverse tecniche analitiche per stimare le dimensioni EV^1,2. Ad esempio, l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la tecnica di caratterizzazione delle dimensioni più utilizzata, stima la dimensione degli EV come diametri idrodinamici, che caratterizzano la resistenza alla mobilità browniana dei veicoli elettrici nella soluzione. Un diametro idrodinamico maggiore di una vescica implica la sua minore mobilità in liquido. Lo strato coronale intorno alle vesciche, costituito da proteine superficiali e altre molecole ancorate o adsorbite alla superficie della membrana, ostacola sostanzialmente la mobilità e aumenta le dimensioni idrodinamiche degli EV. In termini relativi, questo aumento è particolarmente elevato per gli esosomi³, come illustrato nella Figura 1.

La microscopia criogenica degli elettroni a trasmissione (crio-TEM) è una tecnica definitiva nella caratterizzazione delle dimensioni delle vescicole e della morfologia nei loro stati idratati. Tuttavia, l'elevato costo della strumentazione e le competenze specialistiche necessarie per utilizzarla motivano correttamente l'esplorazione di tecniche alternative in grado di identificare i veicoli elettrici idratati. Un numero relativamente ridotto di veicoli elettrici osservati o caratterizzati nelle immagini crio-TEM acquisite è un altro notevole svantaggio di questa tecnica.

La microscopia a forza atomica (AFM) visualizza la topografia tridimensionale degli EV idratati o desiccati^4,5,6 mediante la scansione di una sonda sul substrato per raster l'immagine delle particelle sulla superficie. Le fasi essenziali del protocollo per caratterizzare i veicoli elettrici da aFM sono descritte in questo studio. Prima di imaging delle vesciche in liquido, devono essere immobilizzate su un substrato legandosi a una superficie funzionalizzata, intrappolando in un filtro o per attrazione elettrostatica⁷. La fissazione elettrostatica su un substrato caricato positivamente è un'opzione particolarmente conveniente per l'immobilizzazione degli esosomi noti per avere un potenziale zeta negativo. Tuttavia, anche le stesse forze elettrostatiche che immobilizzano le vesciche extracellulari sulla superficie distorcono la loro forma, il che rende essenziale l'analisi dei dati post-imaging. Elaboriamo questo punto descrivendo l'algoritmo che stima la dimensione delle vescicoli globulari nella soluzione sulla base dei dati AFM sulla forma distorta degli esosomi immobilizzati sulla superficie.

Nel protocollo sviluppato, viene presentata la procedura per la robusta immobilizzazione elettrostatica delle vescicole e seguita dai passaggi necessari per eseguire l'imaging della forza atomica negli stati idratati o desiclati. Vengono identificati i fattori che influenzano la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate. La guida è fornita su come eseguire l'immobilizzazione elettrostatica per campioni con diverse concentrazioni di EV nella soluzione. Viene discussa la selezione di condizioni sperimentali che consentano la stima delle distribuzioni di probabilità empiriche di diverse proprietà biofisiche sulla base di un numero sufficientemente elevato di vesciche immobilizzate. Vengono forniti esempi di analisi post-imaging dei dati AFM. In particolare, viene descritto un algoritmo per determinare la dimensione delle vesciche nella soluzione in base alla caratterizzazione AFM degli EV immobilizzati. I risultati rappresentativi mostrano la consistenza del dimensionamento della vescica da parte dell'AFM con i risultati dell'imaging crio-TEM.

Protocollo

1. Isolamento dei veicoli elettrici da un biofluido

1. Isolare gli EV con uno dei metodi stabiliti, come l'ultracentrifugazione differenziale⁸, precipitazioni o cromatografia di esclusione di dimensioni⁹.
2. Confermare la presenza di biomarcatori superficiali e luminali previsti e l'assenza di biomarcatori che indicano la contaminazione incrociata della preparazione. Confermare la morfologia del bistrato lipidico delle particelle isolate mediante microscopia elettronica.
   NOTA: quando si isolano gli esosomi, la distribuzione delle dimensioni idrodinamiche misurata dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) o dalla dispersione dinamica della luce deve essere compresa nell'intervallo previsto. I dettagli di EV e l'isolamento esosomiso esulano dall'ambito di questo protocollo. Il metodo selezionato dipenderà da questioni sperimentali e dall'obiettivo dello studio¹⁰. I passaggi seguenti forniscono un'illustrazione concreta della procedura per arricchire gli esosomi mediante precipitazioni dal mezzo di crescita delle cellule di cancro al seno MCF-7 utilizzando un kit di precipitazione disponibile in commercio (Tabella dei materiali).
3. Prima dell'espansione della coltura cellulare, conservare le cellule MCF-7 del cancro al seno in azoto liquido. Scongelare le cellule alla sottocoltura.
4. Seguendo pratiche asettiche, eseguire placcatura cellulare su piastre da 150 mm. Utilizzare il mezzo dicrescita composto dal mezzo essenziale minimo dell'Aquila, dall'insulina ricombinante umana da 0,01 mg/mL e dal 10% di siero bovino fetale privo di esosomi.
5. Aerare la coltura del 95% aria e del 5% di CO₂ e incubare a 37 .
6. Dopo aver sistemato le cellule (circa 24 h dopo la placcatura), modificare il supporto. Dividere la piastra a 1:10 rapporto e cultura dieci piastre, ciascuno contenente 20 mL di supporti.
7. Raccogliere e mettere in comune i supporti da 9 di queste piastre (180 mL) a una confluenza di 70x80% quando le cellule sono ancora in fase di crescita.
8. Dividere il supporto in 60 mL e 120 mL, ulteriormente suddivisi in 30 mL/tubo, e centrifugare a 3.000 x g per 15 min.
9. Trasferire il supernatante da ogni tubo in un nuovo tubo sterile da 50 mL ed eseguire l'isolamento esosoma.
10. Isolare gli esosomi per precipitazioni in base ai protocolli pubblicati (vedere, ad esempio, il riferimento¹¹⁾o seguire le istruzionidelproduttore se viene utilizzato un kit di isolamento commerciale (Tabella dei materiali). Come primo passo in quest'ultimo caso, centrifugare il mezzo cellulare a 3.000 x g per 15 min. Ritirare supernatali e scartare le cellule e detriti cellulari.
11. Aggiungere la soluzione di precipitazione (rapporto di volume 1:5) al supernatante, mescolare e conservare in frigorifero durante la notte.
12. Centrifuga a 1.500 x g per 30 min a temperatura ambiente. Scartare il super-natante dopo la centrifugazione.
13. Girare il restante pellet esosoma per altri 5 min a 1.500 x g. Senza disturbare il pellet, rimuovere la soluzione di precipitazione rimanente per aspirazione.
14. Risospendere il pellet in 100x500 ll di 1x buffer salina con buffer fosfato (PBS) e dividerlo in più aliquote in base alle esigenze per l'analisi a valle.
15. Procedere immediatamente all'immobilizzazione superficiale degli esosomi isolati per l'imaging AFM. Se necessario, congelare gli aliquote a -80 gradi centigradiper un uso successivo mentre si prendono precauzioni per evitare danni al campione durante il ciclo di congelamento-disgelo.

2. Fissazione superficiale delle vesciche extracellulari

1. Utilizzare un forte nastro doppio lato, resina epossidica o un adesivo alternativo per collegare saldamente un disco mica a un disco di propulsore in acciaio inossidabile (STM) AFM/scanning.
2. Cleave mica disco utilizzando un rasoio affilato o un coltello di utilità, o attaccando un nastro adesivo alla superficie superiore e poi scandagliandolo per rimuovere uno strato di materiale.
   NOTA: Entrambi i metodi dovrebbero rivelare una superficie vergine rimuovendo un sottile strato di mica precedentemente esposto all'ambiente. Dopo la procedura, l'attaccamento della mica al disco campione metallico AFM/STM deve rimanere fermo.
3. A temperatura ambiente, trattare la superficie superiore della mica per 10 s con 100 luna di 10 mM Soluzione NiCl_2, che modifica la carica superficiale da negativa a positiva.
4. Soluzione Blot NiCl₂ con salvietta o carta assorbenti. Lavare la superficie mica 3x con acqua deionizzata (DI) e asciugarla con un flusso di azoto secco.
   NOTA: È buona norma eseguire la scansione della superficie modificata con AFM per verificare che sia priva di contaminanti.
5. Posizionare il disco campione AFM con la mica modificata in superficie collegata in una piastra di Petri.
6. Diluire il campione di esosoma dal punto 1.14 con 1x PBS per ottenere una concentrazione compresa tra 4,0 x 10⁹ e 4,0 x 10¹⁰ particelle per mL di soluzione. Convalidare la concentrazione di particelle diluite utilizzando NTA.
7. Formare una goccia sessile sulla superficie della mica svuotando 100 l della soluzione esosomica diluita da una pipetta.
8. Posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e sigillarlo con una pellicola di paraffina per ridurre l'evaporazione del campione. Incubare il campione per 12,18 h a 4 gradi centigradi.
   NOTA: La densità superficiale degli esosomi immobilizzati aumenterà con il tempo di incubazione e la concentrazione di EV nel liquido. Un tempo di incubazione più lungo può essere necessario se gli esosomi sono presenti nel campione a concentrazioni inferiori.
9. Dopo l'incubazione, aspirare l'80-90% del campione senza disturbare la superficie. A questo punto, gli esosomi saranno immobilizzati elettrostaticamente sul substrato mica.
10. Prima di imaging Tv idratate, sciacquare la superficie con 1x PBS. Ripetere 3x. Fare attenzione a mantenere il campione idratato per tutto il processo di risciacquo.
11. Dopo aver lavato la superficie mica con 1x PBS, rimuovere l'80%del90% di liquido e la pipetta 40 - L di 1x PBS fresco per coprire il campione.
12. Quando si immagina gli EV desiccati, risciacquare il substrato con acqua DI. Ripetere 3x.
    NOTA: Il risciacquo con acqua DI impedirà la formazione di cristalli di sale e la deposizione di soluti sulla superficie man mano che il substrato si asciuga.
13. Prima di imaging desiccato EV, aspirare il più liquido possibile senza toccare la superficie e asciugare il resto con un flusso di azoto secco.

3. Imaging AFM

1. Per creare un'immagine dei veli desiccati, selezionare un cantilever progettato per la scansione nell'aria nelle modalità di imaging di maschiatura e non contatto e montarlo sul supporto della sonda.
   NOTA: le caratteristiche di un esempio di cantilever elencato in Tabella dei materiali (lunghezza 123 m, larghezza di 40 m, raggio della punta di 7 nm e costante a molla di 3/m) possono essere utilizzate come guida quando si seleziona una sonda compatibile con la strumentazione AFM disponibile.
   1. Posizionare la preparazione dal punto 2.13 sullo stadio AFM. Il disco magnetico campione in acciaio inossidabile immobilizzerà il campione sullo stage. Lasciare il tempo per la preparazione e la fase per equilibrato termicamente.
   2. Utilizzare la modalità di maschiatura per eseguire la scansione di un'area sufficientemente ampia della superficiedellamica. Ad esempio, scegliete un'area di 5 x 5 m, rastered in 512 linee ad una velocità di scansione di 1 Hz. Acquisire sia l'altezza che le immagini di fase in quanto forniscono informazioni complementari sulla topografia e le proprietà della superficie del campione.
      NOTA: il tempo di scansione aumenterà con l'area dell'immagine e il numero di linee selezionate per formare l'immagine, ma diminuirà con la velocità di scansione definita come il numero di linee scansionate al secondo. Velocità di scansione rapida possono influire sulla qualità dell'immagine. Pertanto, la velocità di rastering dovrebbe bilanciare giudizialmente il compromesso tra il tempo di acquisizione e la qualità dell'immagine.
2. Per creare immagini di vesciboli idratati, selezionare un sbalzo appropriato per la scansione di campioni morbidi e idratati e montare il cantilever su un supporto della sonda progettato per la scansione in liquidi.
   NOTA: Quando si seleziona una sonda compatibile con la strumentazione AFM disponibile, le specifiche della sonda elencata in Tabella dei materiali (sbalzo triangolare con lunghezza nominale di 175 m, larghezza 22 m, raggio della punta di 20 nm, costante a molla di 0,07 N/m, e ottimizzata per l'imaging con la frequenza di trasmissione compresa tra 4 e 8 kHz) può essere utilizzata come guida.
   1. Bagna la punta del cantilever con 1x PBS per ridurre la probabilità di introdurre bolle d'aria nel liquido durante la scansione.
   2. Posizionare la preparazione dal punto 2.11 sullo stage AFM. Il disco magnetico di campioni in acciaio inossidabile immobilizzerà la mica collegata contenente eV immobilizzati sulla sua superficie.
   3. Lasciare il tempo per la preparazione e lo stadio AFM equilibrate termicamente.
   4. Immagine della superficie mica idratata nella modalità di maschiatura. Acquisire sia l'altezza che le immagini di fase.
      NOTA: la qualità dell'immagine è influenzata dalla strumentazione, dalla sonda selezionata e dai parametri di scansione. Quando si ottimizzano le condizioni di scansione, è possibile utilizzare le seguenti opzioni come punto di partenza: 5 x 5 m di area scansionata in 512 linee con velocità di scansione da 0,8 a 1,0 Hz e frequenza di trasmissione compresa tra 4 e 8 kHz.

4. Analisi dell'immagine

NOTA: le seguenti fasi di elaborazione e analisi dei dati vengono applicate alle immagini di altezza acquisite. Una procedura simile può essere adattata per analizzare i dati di fase. La descrizione qui sotto è specifica per Gwyddion¹², un software libero e open source disponibile sotto GNU General Public License. Funzionalità simili sono disponibili in strumenti software alternativi.

1. Passare a Processo dati, Modalità SPM, Suggerimento e scegliere Suggerimento modello ( Figura2). Selezionare la geometria e le quote della punta utilizzata per eseguire la scansione del campione e fare clic su OK.
2. Correggere i manufatti di erosione della punta eseguendo la ricostruzione della superficie. Aprire l'immagine. Dal menu, selezionare Processo dati, Modalità SPM, Suggerimento, quindi scegliere Ricostruzione superficie e fare clic su OK (Figura 3).
3. Allineare il piano di imaging in modo che corrisponda al piano XY di laboratorio rimuovendo l'inclinazione nel substrato dai dati di scansione. Per eseguire questa attività, selezionare Processo dati, Livella e scegliere Piano a livello ( Figura4).
4. Allineare le righe dell'immagine selezionando Elabora dati, Correggi dati e quindi scegliere Allinea righe. Sono disponibili diverse opzioni di allineamento (Figura 5). Ad esempio, Mediana è un algoritmo che trova un'altezza media di ogni linea di scansione e la sottrae dai dati.
5. Passare a Processo dati, Correggi dati e scegliere Rimuovi cicatrici (Figura 6), che rimuove gli errori di scansione comuni noti come cicatrici.
6. Allineare la superficie di mica all'altezza zero, s 0, selezionando Appiattisci base nel menu a discesa Livello accessibile da Processo dati ( Figura7).
7. Identificare i veicoli elettrici sulla superficie scansionata utilizzando il menu a discesa Contrassegna per soglia in grani (Figura 8A). Questo algoritmo identifica gli esosomi immobilizzati sulla superficie come particelle sporgenti dal substrato di superficie zero per l'altezza al di sopra della soglia selezionata dall'utente. Selezionare una soglia compresa tra 1 e 3 nm, in modo da eliminare la maggior parte delle interferenze di sfondo. Soglie più piccole vengono utilizzate con uno sfondo più pulito.
   NOTA: la soglia nella figura 8A è 1.767 nm. Il risultato dell'identificazione dell'esosoma MCF-7 con questa soglia è illustrato nella figura 8B. Gwyddion offre diverse alternative alla soglia come l'algoritmo per identificare automaticamente le vesciche nell'immagine, tra cui la soglia automatica (metodo di Otsu), il rilevamento dei bordi e l'algoritmo dello spartiacque.
   NOTA: gli agglomerati di particelle, se presenti nell'immagine AFM, possono essere mascherati ed esclusi dall'analisi.
8. Eseguire la caratterizzazione geometrica e dimensionale dei veicoli elettrici identificati utilizzando gli algoritmi di distribuzione disponibili accessibili dal menu Grani.
   NOTA: Gwyddion fornisce strumenti per valutare la distribuzione di proprietà scalari, arieti, volumetriche e di altre proprietà di veli immobilizzati in uno stato idratato o dessicato. Un esempio di una proprietà dei valori scalari è illustrato nella Figura 9, che fornisce la distribuzione delle altezze massime all'interno dell'impronta di ogni esoma identificato.
9. Esportare i dati AFM da Gwyddion per l'analisi specializzata da altri strumenti di calcolo e programmi per computer personalizzati.

Risultati

La fissazione superficiale dei veicoli elettrici è un passaggio fondamentale nella sequenza di imaging. L'immobilizzazione elettrostatica della superficie degli esosomi, nota per avere un potenziale zeta negativo, si verificherà in modo robusto dopo che il substrato della mica viene modificato per avere una carica superficiale positiva. Senza il trattamento con NiCl₂ per impartire cambiamenti positivi di superficie, l'immobilizzazione dei veli sul substrato è risultata inefficace. L'immagine dell'altezza in...

Discussione

L'immobilizzazione dei veicoli elettrici da un fluido biologico, la scansione superficiale e l'analisi delle immagini sono i passi essenziali del protocollo sviluppato per la caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici in liquido. Il numero di vesciche suscettibili di imaging AFM scala con la superficie di immagine e la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate sul substrato. Dato un potenziale zeta negativo di espeeedanti¹⁸, sosteniamo la fissazione elettrostatica dei veicoli elett...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4