Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Zusammenfassung

Zur etikettenfreien Immobilisierung von Exosomen und extrazellulären Vesikeln aus flüssigen Proben und deren Bildgebung mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben. Die AFM-Bilder werden verwendet, um die Größe der Vesikel in der Lösung zu schätzen und andere biophysikalische Eigenschaften zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Exosomen und andere extrazelluläre Vesikel (EVs) sind molekulare Komplexe, die aus einem Lipidmembranvesikel, seiner Oberflächendekoration durch Membranproteine und anderen Molekülen und einem vielfältigen Luminalgehalt bestehen, der von einer übergeordneten Zelle geerbt wird, zu der RNAs, Proteine und DNAs. Die Charakterisierung der hydrodynamischen Größen von Elektrofahrzeugen, die von der Größe des Vesikels und seiner durch Oberflächendekorationen gebildeten koronalen Schicht abhängt, ist zur Routine geworden. Bei Exosomen, dem kleinsten EVs, ist der relative Unterschied zwischen der hydrodynamischen und der Vesikelgröße signifikant. Die Charakterisierung von Vesikelgrößen durch die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM), eine Goldstandard-Technik, bleibt aufgrund der Kosten des Instruments, des für die Probenvorbereitung, Bildgebung und Datenanalyse und eine kleine Anzahl von Partikeln, die häufig in Bildern beobachtet werden. Eine weit verbreitete und zugängliche Alternative ist die Atomkraftmikroskopie (AFM), die vielseitige Daten über dreidimensionale Geometrie, Größe und andere biophysikalische Eigenschaften extrazellulärer Vesikel erzeugen kann. Das entwickelte Protokoll führt die Anwender bei der Nutzung dieses Analysetools und skizziert den Workflow für die Analyse von Elektrofahrzeugen durch den AFM, der die Probenvorbereitung für bildgebende Elektrofahrzeuge in hydratisierter oder ausgetrockneter Form, die elektrostatische Immobilisierung von Vesikel auf einem Substrat, Datenerfassung, deren Analyse und Interpretation. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Fixierung von Elektrofahrzeugen auf der modifizierten Glimmeroberfläche vorhersagbar und anpassbar ist und es dem Benutzer ermöglicht, Größenergebnisse für eine große Anzahl von Vesikeln zu erhalten. Die Vesikelgröße auf Basis der AFM-Daten stellte sich heraus, dass sie mit der Kryo-TEM-Bildgebung übereinstimmt.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind in allen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Milch und der Fruchtwasser. Exosomen bilden eine Bezirksklasse von Elektrofahrzeugen, die sich durch endosomale Biogenese, die Marker des endosomalen Weges und die kleinste Größe unter allen Elektrofahrzeugen von anderen Elektrofahrzeugen unterscheiden. Die Größe der Exosomen wird oft mit erheblichen Schwankungen zwischen den Studien berichtet. Die Größenergebnisse waren methodisch abhängig, was den Unterschied in den physikalischen Prinzipien widerspiegelt, die von verschiedenen Analysetechniken zur Schätzung der EV-Größen^1,2verwendet werden. Beispielsweise schätzt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) – die am weitesten verbreitete Größencharakterisierungstechnik – die Größe von Elektrofahrzeugen als ihre hydrodynamischen Durchmesser, die den Widerstand gegen die Brownsche Mobilität von Elektrofahrzeugen in der Lösung charakterisieren. Ein größerer hydrodynamischer Durchmesser eines Vesikels impliziert seine geringere Beweglichkeit in Flüssigkeit. Die koronale Schicht um Vesikel, bestehend aus Oberflächenproteinen und anderen Molekülen, die an der Membranoberfläche verankert oder adsorbiert werden, behindert die Beweglichkeit erheblich und erhöht die hydrodynamische Größe von Elektrofahrzeugen. Relativ gesehen ist dieser Anstieg besonders groß für die Exosomen³, wie in Abbildung 1dargestellt.

Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine definitive Technik zur Charakterisierung von Vesikelgrößen und Morphologie in ihren hydratisierten Zuständen. Die hohen Kosten der Instrumentierung und das für ihre korrekte Verwendung erforderliche Fachwissen motivieren jedoch die Erforschung alternativer Techniken, die hydratisierte Elektrofahrzeuge abbilden können. Eine relativ kleine Anzahl von EVs, die in den erfassten Kryo-TEM-Bildern beobachtet oder charakterisiert werden, ist ein weiterer bemerkenswerter Nachteil dieser Technik.

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) visualisiert die dreidimensionale Topographie hydratisierter oder ausgetrockneter Elektrofahrzeuge^4,5,6, indem eine Sonde über das Substrat gescannt wird, um das Bild der Partikel auf der Oberfläche zu rastern. Die wesentlichen Schritte des Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch AFM werden in dieser Studie beschrieben. Bevor die Vesikel in Flüssigkeit abgeglichen werden, müssen sie auf einem Substrat immobilisiert werden, indem sie entweder an eine funktionalisierte Oberfläche binden, in einem Filter einfangen oder durch elektrostatische Anziehung⁷. Die elektrostatische Fixierung auf einem positiv geladenen Substrat ist eine besonders praktische Option zur Immobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat. Die gleichen elektrostatischen Kräfte, die die extrazellulären Vesikel auf der Oberfläche immobilisieren, verzerren jedoch auch ihre Form, was eine post-imaging-Datenanalyse unerlässlich macht. Wir erarbeiten diesen Punkt, indem wir den Algorithmus beschreiben, der die Größe der Kugelbläschen in der Lösung auf der Grundlage der AFM-Daten über die verzerrte Form der auf der Oberfläche immobilisierten Exosomen schätzt.

Im entwickelten Protokoll wird das Verfahren zur robusten elektrostatischen Immobilisierung von Vesikeln vorgestellt und mit den Schritten verfolgt, die für die Durchführung der Atomkraft-Bildgebung in den hydratisierten oder ausgetrockneten Zuständen erforderlich sind. Die Faktoren, die die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel beeinflussen, werden identifiziert. Es wird die Anleitung gegeben, wie die elektrostatische Immobilisierung für Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von Elektrofahrzeugen in der Lösung durchgeführt werden kann. Diskutiert wird die Auswahl von Versuchsbedingungen, die die Schätzung empirischer Wahrscheinlichkeitsverteilungen verschiedener biophysikalischer Eigenschaften auf der Grundlage einer ausreichend großen Anzahl von immobilisierten Vesikeln ermöglichen. Beispiele für die nach-Imaging-Analyse der AFM-Daten werden angeführt. Insbesondere wird ein Algorithmus zur Bestimmung der Größe von Vesikeln in der Lösung beschrieben, basierend auf der AFM-Charakterisierung von immobilisierten Elektrofahrzeugen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Konsistenz der Vesikelgröße durch AFM mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung.

Protokoll

1. Isolierung von Elektrofahrzeugen aus einem Biofluid

1. Isolieren Sie Elektrofahrzeuge nach einer der etablierten Methoden, z. B. der Differenz-Ultrazentrifugation⁸, Derfällung oder Größenausschlusschromatographie⁹.
2. Bestätigen Sie das Vorhandensein von erwarteten Oberflächen- und Luminal-Biomarkern und das Fehlen von Biomarkern, die auf eine Kreuzkontamination der Zubereitung hinweisen. Bestätigen Sie die Lipid-Bilayer-Morphologie der isolierten Teilchen durch Elektronenmikroskopie.
   HINWEIS: Bei der Isolierung der Exosomen sollte die hydrodynamische Größenverteilung, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) oder dynamische Lichtstreuung gemessen wird, im erwarteten Bereich liegen. Die Details der Ev- und Exosomenisolierung gehen über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. Die gewählte Methode hängt von experimentellen Fragen und dem Ziel der Studie¹⁰ab. Die folgenden Schritte liefern eine konkrete Darstellung des Verfahrens zur Anreicherung der Exosomen durch Niederschlag aus dem Wachstumsmedium von MCF-7 Brustkrebszellen mit einem handelsüblichen Niederschlagssatz (Materialtabelle).
3. Vor der Zellkulturexpansion, speichern MCF-7 Brustkrebszellen in flüssigem Stickstoff. Tauen Sie Zellen in Subkultur.
4. Führen Sie nach aseptischen Übungen die Zellbeschichtung auf 150 mm Platten durch. Verwenden Sie das Wachstumsmedium, das aus dem minimalen essentiellen MediumdesAdlers, 0,01 mg/ml humanem rekombinantem Insulin und 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum besteht.
5. Belüften Sie die Kultur um 95% Luft und 5%_CO2 und brüten bei 37 °C.
6. Nachdem die Zellen sesshaft (ca. 24 h nach der Beschichtung) abgerechnet wurden, ändern Sie das Medium. Teilen Sie die Platte bei 1:10 Verhältnis und Kultur zehn Platten, die jeweils 20 ml Medien enthalten.
7. Ernte- und Poolmedien von 9 dieser Platten (180 ml) bei einem Zusammenfluss von 70bis80 %, wenn sich die Zellen noch in der Wachstumsphase befinden.
8. Teilen Sie die Medien in 60 ml und 120 ml auf, weiter aufgeteilt in 30 ml/Rohr und Zentrifuge bei 3.000 x g für 15 min.
9. Übertragen Sie den Überstand von jedem Rohr auf ein neues steriles 50 ml Rohr und führen Sie die exosome Isolierung durch.
10. Isolieren Sie Exosomen durch Niederschlag gemäß veröffentlichten Protokollen (siehe z. B. Referenz¹¹) oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wenn einkommerzielles Isolationskit(Tabelle der Materialien) verwendet wird. Als ersten Schritt im letzteren Fall, Zentrifugenzellmedium bei 3.000 x g für 15 min. Rückzug Überstand und Entsorgen von Zellen und Zellablagerungen.
11. Fügen Sie die Niederschlagslösung (1:5 Volumenverhältnis) dem Überstand hinzu, mischen und über Nacht kühlen.
12. Zentrifuge bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.
13. Drehen Sie das verbleibende Exosomepellet für weitere 5 min bei 1.500 x g. Ohne das Pellet zu stören, entfernen Sie die verbleibende Niederschlagslösung durch Aspiration.
14. Setzen Sie das Pellet in 100x500 l 1x Phosphat-gepufferter Salzsäurepuffer (PBS) aus und teilen Sie es bei Bedarf für die nachgeschaltete Analyse in mehrere Aliquots auf.
15. Gehen Sie sofort zur Oberflächenimmobilisierung der isolierten Exosomen für die AFM-Bildgebung über. Falls erforderlich, frieren Sie die Aliquots bei -80 °Cfür die spätere Verwendung ein, während Sie Vorsichtsmaßnahmen treffen, um Schäden an der Probe während des Frost-Tau-Zyklus zu vermeiden.

2. Oberflächenfixierung von extrazellulären Vesikeln

1. Verwenden Sie starkes doppelseitiges Klebeband, Epoxid oder einen alternativen Klebstoff, um eine Glimmerscheibe fest an einem AFM/Scanning Tunneling Microscope (STM) magnetischer Edelstahl-Probenscheibe zu befestigen.
2. Cleave Glimmerscheibe mit einem scharfen Rasiermesser oder Gebrauchsmesser, oder durch Befestigen eines Klebebandes an der Oberseite und dann Pealing es aus, um eine Schicht von Material zu entfernen.
   HINWEIS: Beide Methoden sollten eine unberührte Oberfläche offenbaren, indem eine dünne Schicht Glimmer entfernt wird, die zuvor der Umgebung ausgesetzt war. Nach dem Eingriff muss die Befestigung von Glimmer an der AFM/STM-Metallprobenscheibe fest bleiben.
3. Bei Raumtemperatur die Oberfläche des Glimmers für 10 s mit 100 l von 10 mM NiCl₂ Lösung behandeln, die die Oberflächenladung von negativ in positiv ändert.
4. Blot NiCl₂ Lösung mit einem fusselfreien Wisch- oder Blotting-Papier. Waschen Sie die Glimmeroberfläche 3x mit entionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie mit einem Strom trockenen Stickstoffs.
   HINWEIS: Es ist eine gute Praxis, die modifizierte Oberfläche mit AFM zu scannen, um zu bestätigen, dass sie frei von Verunreinigungen ist.
5. Legen Sie die AFM-Probenscheibe mit dem angehängten oberflächenmodifizierten Glimmer in eine Petrischale.
6. Verdünnen Sie die Exosomenprobe aus Schritt 1.14 mit 1x PBS, um eine Konzentration zwischen 4,0 x 10⁹ und 4,0 x 10¹⁰ Partikel pro ml Lösung zu erhalten. Validieren Sie die verdünnte Partikelkonzentration mit NTA.
7. Bilden Sie einen sessilen Tropfen auf der Oberfläche des Glimmers, indem Sie 100 l der verdünnten Exosomenlösung aus einer Pipette entleeren.
8. Deckel auf die Petrischale legen und mit einem Paraffinfilm versiegeln, um die Probenverdunstung zu reduzieren. Inkubieren Sie die Probe für 12x18 h bei 4 °C.
   HINWEIS: Die Oberflächendichte der immobilisierten Exosomen wird mit der Inkubationszeit und der Konzentration von Elektrofahrzeugen in der Flüssigkeit zunehmen. Eine längere Inkubationszeit kann erforderlich sein, wenn Exosomen in der Probe in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind.
9. Nach der Inkubation 80bis90 % der Probe aspirieren, ohne die Oberfläche zu stören. An dieser Stelle werden die Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf dem Glimmersubstrat.
10. Vor der Abbildung hydratisierter Elektrofahrzeuge spülen Sie die Oberfläche mit 1x PBS ab. Wiederholen Sie 3x. Achten Sie darauf, die Probe während des Spülvorgangs hydratisiert zu halten.
11. Nach dem Waschen der Glimmeroberfläche mit 1x PBS, entfernen Sie 80%90%der Flüssigkeit, und Pipette 40 l frische 1x PBS, um die Probe zu bedecken.
12. Bei der Abbildung der ausgetrockneten Elektrofahrzeuge spülen Sie das Substrat mit DI-Wasser ab. Wiederholen Sie 3x.
    HINWEIS: Das Spülen mit DI-Wasser verhindert die Bildung von Salzkristallen und die Ablagerung von Gelösten auf der Oberfläche, wenn das Substrat trocknet.
13. Vor der Abbildung ausgetrocknete Elektrofahrzeuge, aspirieren Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, ohne die Oberfläche zu berühren und trocknen Sie den Rest mit einem Strom von trockenem Stickstoff.

3. AFM-Bildgebung

1. Um die ausgetrockneten Elektrofahrzeuge abzubilden, wählen Sie einen Freischwinger aus, der für das Scannen in der Luft in abstichenden und berührungslosen Bildgebungsmodi entwickelt wurde, und montieren Sie ihn auf den Sondenhalter.
   ANMERKUNG: Die Merkmale eines Beispielauslegers, der in der Stofftabelle aufgeführt ist (123 m Länge, 40 m Breite, 7 nm Spitzenradius und 37 N/m Federkonstante), können als Richtschnur bei der Auswahl einer Sonde verwendet werden, die mit der verfügbaren AFM-Instrumentierung kompatibel ist.
   1. Platzieren Sie die Vorbereitung ab Schritt 2.13 auf der AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die Probe auf der Bühne immobilisieren. Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die Bühne, um thermisch auszueinemt.
   2. Verwenden Sie den Tippmodus, um eine ausreichendgroße Fläche der Glimmeroberfläche zu scannen. Wählen Sie z. B. eine Fläche von 5 x 5 m aus, gerastert in 512 Zeilen mit einer Scanrate von 1 Hz. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder, da sie ergänzende Informationen über die Topographie und die Oberflächeneigenschaften der Probe liefern.
      HINWEIS: Die Scanzeit wird mit dem abgebildeten Bereich und der Anzahl der Linien, die für die Bildbildung ausgewählt wurden, erhöht, verringert sich jedoch mit der Scanrate, die als Anzahl der pro Sekunde gescannten Zeilen definiert ist. Schnelle Scanraten können sich auf die Bildqualität auswirken. Daher sollte die Geschwindigkeit des Rasterns den Kompromiss zwischen der Erfassungszeit und der Bildqualität juristisch ausgleichen.
2. Um hydratisierte Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Ausleger aus, der zum Scannen weicher, hydratisierter Proben geeignet ist, und montieren Sie den Ausleger auf einen Sondenhalter, der für das Scannen in Flüssigkeiten entwickelt wurde.
   ANMERKUNG: Bei der Auswahl einer Sonde, die mit der verfügbaren AFM-Instrumentierung kompatibel ist, werden die Spezifikationen der Sonde in der Tabelle der Werkstoffe aufgeführt (dreieckiger Ausleger mit 175 m Nennlänge, 22 m Breite, 20 nm Spitzenradius, 0,07 N/m Federkonstante und optimiert für die Bildgebung mit der Antriebsfrequenz im Bereich zwischen 4 und 8 kHz) kann als Leitfaden verwendet werden.
   1. Befeuchten Sie die Spitze des Auslegers mit 1x PBS, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Luftblasen während des Scannens in die Flüssigkeit eingeführt werden.
   2. Stellen Sie die Vorbereitung ab Schritt 2.11 auf die AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die befestigte Glimmer mit immobilisierten Elektrofahrzeugen auf ihrer Oberfläche immobilisieren.
   3. Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die AFM-Stufe, um thermisch auszueinem.
   4. Stellen Sie die hydratisierte Glimmeroberfläche im Abstichmodus ab. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder.
      HINWEIS: Die Bildqualität wird durch die Instrumentierung, die ausgewählten Sonden- und Scanparameter beeinflusst. Bei der Optimierung der Scan-Bedingungen können die folgenden Optionen als Ausgangspunkt verwendet werden: 5 x 5 m Fläche, die in 512 Zeilen mit einer Scanrate von 0,8-1,0 Hz und einer Laufwerksfrequenz zwischen 4 und 8 kHz gescannt wird.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Die folgenden Datenverarbeitungs- und Analyseschritte werden auf die erfassten Höhenbilder angewendet. Ein ähnliches Verfahren kann angepasst werden, um die Phasendaten zu analysieren. Die folgende Beschreibung ist spezifisch für Gwyddion¹², eine kostenlose und Open-Source-Software, die unter GNU General Public License verfügbar ist. Ähnliche Funktionen sind in alternativen Software-Tools verfügbar.

1. Gehen Sie zu Datenprozess, SPM-Modi, Tipp und wählen Sie Modelltipp (Abbildung 2). Wählen Sie die Geometrie und die Bemaßungen der Spitze aus, mit der das Beispiel scannt, und klicken Sie auf OK.
2. Korrigieren Sie die Spitzenerosionsartefakte, indem Sie die Oberflächenrekonstruktion durchführen. Öffnen Sie das Bild. Wählen Sie im Menü Datenprozess, SPM-Modi, Tipp, dann wählen Sie Oberflächenrekonstruktion und klicken Sie auf OK (Abbildung 3).
3. Richten Sie die Bildebene an die XY-Ebene des Labors aus, indem Sie die Neigung im Substrat aus den Scandaten entfernen. Um diese Aufgabe zu erfüllen, wählen Sie Datenprozess, Ebene und Ebene Ebene (Abbildung 4).
4. Richten Sie Die Zeilen des Bildes aus, indem Sie Data Process, Correct Data and then choose Align Rows auswählen. Es stehen mehrere Ausrichtungsoptionen zur Verfügung (Abbildung 5). Median ist z. B. ein Algorithmus, der eine durchschnittliche Höhe jeder Scanzeile findet und von den Daten subtrahiert.
5. Wechseln Sie zu Datenprozess, Korrigieren von Daten und wählen Sie Narben entfernen (Abbildung 6), wodurch häufige Scanfehler entfernt werden, die als Narben bezeichnet werden.
6. Richten Sie die Glimmeroberfläche auf der Nullhöhe, Z = 0, aus, indem Sie im Dropdown-Menü Ebene abflachen, auf das sie über den Datenprozess zugreifen kann (Abbildung 7).
7. Identifizieren Sie EVs auf der gescannten Oberfläche mithilfe des Dropdown-Menüs Markierung nach Schwellenwert im Dropdown-Menü Körner (Abbildung 8A). Dieser Algorithmus identifiziert oberflächenimmobilisierte Exosomen als Partikel, die aus dem Null-Oberflächen-Substrat durch die Höhe über dem vom Benutzer gewählten Schwellenwert herausragen. Wählen Sie einen Schwellenwert im Bereich zwischen 1 und 3 nm aus, wodurch die meisten Hintergrundinterferenzen eliminiert werden. Kleinere Schwellenwerte werden mit saubererem Hintergrund verwendet.
   HINWEIS: Der Schwellenwert in Abbildung 8A beträgt 1.767 nm. Das Ergebnis der MCF-7-Exosomenidentifikation mit dieser Schwelle ist in Abbildung 8Bdargestellt. Gwyddion bietet mehrere Alternativen zum Schwellenwert als Algorithmus zur automatischen Identifizierung von Vesikel nakelten Im bilden, einschließlich automatisierter Schwellenwerte (Otsu-Methode), Kantenerkennung und dem Wendepunktalgorithmus.
   HINWEIS: Partikelagglomerate, sofern sie im AFM-Bild vorhanden sind, können maskiert und von der Analyse ausgeschlossen werden.
8. Führen Sie die geometrische und dimensionale Charakterisierung der identifizierten Elektrofahrzeuge mithilfe der verfügbaren Verteilungsalgorithmen durch, auf die über das Menü Körner zugegriffen werden kann.
   HINWEIS: Gwyddion bietet Werkzeuge zur Bewertung der Verteilung von skalaren, arealen, volumetrischen und anderen Eigenschaften von immobilisierten Elektrofahrzeugen in einem hydratisierten oder dessikierten Zustand. Ein Beispiel für eine Skalarwerteigenschaft ist in Abbildung 9dargestellt, die die Verteilung der maximalen Höhen innerhalb des Footprints jedes identifizierten Exosomens angibt.
9. Exportieren Sie die AFM-Daten aus Gwyddion für eine spezielle Analyse durch andere Rechenwerkzeuge und benutzerdefinierte Computerprogramme.

Ergebnisse

Die Oberflächenfixierung von Elektrofahrzeugen ist ein wichtiger Schritt in der Bildsequenz. Die elektrostatische Oberflächenimmobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat, wird robust auftreten, nachdem das Substrat des Glimmers modifiziert wurde, um eine positive Oberflächenladung zu haben. Ohne die Behandlung mit NiCl_2, um positive Oberflächenveränderungen zu vermitteln, erwies sich die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf dem Substrat als unwirksam. D...

Diskussion

Die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen aus einer biologischen Flüssigkeit, Oberflächenscans und Bildanalysen sind die wesentlichen Schritte des entwickelten Protokolls zur AFM-Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Flüssigkeiten. Die Anzahl der Vesikel, die AFM-Bildwaagen mit der abgebildeten Oberfläche und der auf dem Substrat immobilisierten Oberflächenkonzentration der Vesikel zugänglich sind. Angesichts eines negativen Zeta-Potenzials von Elektrofahrzeugen und Exosomen¹⁸befürwort...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4