原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

要約

液体試料からのエキソソームおよび細胞外小胞の標識フリー固定化および原子間力顕微鏡(AFM)によるイメージングに関するステップバイステップの手順について説明する。AFM画像は、溶液中の小胞のサイズを推定し、他の生物物理学的特性を特徴付けるために使用されます。

要約

エキソソームおよび他の細胞外小胞(EV)は、脂質膜小胞、膜タンパク質および他の分子による表面装飾、およびRNAを含む親細胞から受け継がれた多様な発光含有量からなる分子複合体であり、タンパク質、および DN。小胞の大きさや表面装飾によって形成される冠状層に依存するEVの流体力学的サイズの特性化は、日常化している。EVの最小であるエキソソームの場合、流体力学と小胞のサイズの相対的な差は重要です。低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングによる小胞サイズの特性解析は、金の標準的な技術であり、機器のコスト、サンプル調製、イメージングおよびおよびデータ分析、および画像で観察される粒子の数が少ない。広く利用可能でアクセス可能な代替手段は、原子力顕微鏡(AFM)であり、3次元幾何学、サイズ、および細胞外小胞の他の生物物理学的特性に関する多目的なデータを生成することができる。開発されたプロトコルは、この分析ツールを利用するユーザーを導き、水和または乾燥した形でEVをイメージングするためのサンプル準備を含むAFMによるEVの分析のためのワークフローを概説し、静電固定基板上の小胞、データ取得、分析、および解釈。代表的な結果は、変更されたマイカ表面上のEVの固定が予測可能でカスタマイズ可能であり、ユーザーが多数の小胞のサイジング結果を得ることを可能にすることを示しています。AFMデータに基づく小胞サイジングは、クライオ-TEMイメージングと一致することがわかった。

概要

細胞外小胞(EV)は、血液、尿、唾液、牛乳、羊水を含むすべての体液に存在する。エキソソームは、エンドソーム生体形成、エンドソーム経路のマーカー、およびすべてのEVの中で最小サイズによって他のEVと区別されるEVの地区クラスを形成します。エキソソームの大きさは、多くの場合、研究間の実質的な変動で報告されます。サイジング結果は、EV^{サイズ1、2}を推定する異なる分析技術によって採用される物理原理の違いを反映^して、方法依存性であることが判明した。例えば、最も広く使用されているサイズ特性解析技術であるナノ粒子トラッキング解析(NTA)は、EVのサイズを流体力学的直径として推定し、溶液中のEVのブラウンモビリティに対する耐性を特徴付けます。小胞のより大きい流体力学の直径は液体の低い移動性を意味する。小胞の周りの冠状層は、表面タンパク質および膜表面に固定または吸着された他の分子からなる、実質的に移動性を阻害し、EVの流体力学的サイズを増加させる。相対的に見て、この増加は、図1に示すように、エキソソー^ム3に対して特に大きい。

低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングは、小胞の大きさと形態を水和状態で特徴付ける決定的な技術です。しかし、計測器のコストが高く、それを正しく使用するために必要な専門知識は、水和されたEVを画像化できる代替技術の探求を動機づけます。取得したクライオ-TEM画像で観測または特徴付けられた比較的少数のEVは、この技術のもう一つの顕著な欠点です。

原子力顕微鏡(AFM)は、水和または乾燥^{したEV4、5、6}の3次元地形を可視化^し、基板全体のプローブをスキャンして表面上の粒子の画像をラスター化する。本研究では、AFMによってEVを特徴付けるプロトコルの本質的なステップについて概説する。小胞を液体中で撮像する前に、機能性表面へのテザリング、フィルタ内の捕捉、または静電引き付^け7によって基板上に固定化されなければならない。正に帯電した基板上の静電固定は、負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの固定化のための特に便利なオプションである。しかし、表面上の細胞外小胞を固定するのと同じ静電力もその形状を歪め、ポストイメージングデータ解析が不可欠です。この点を詳しく説明するには、表面に固定化されたエキソソームの歪んだ形状に関するAFMデータに基づいて、溶液中の球状小胞の大きさを推定するアルゴリズムを説明する。

開発されたプロトコルでは、小胞の堅牢な静電固定化の手順が提示され、水和または乾燥状態で原子力イメージングを実行するために必要な手順が続きます。固定化された小胞の表面濃度に影響を与える因子が同定される。このガイダンスは、溶液中のEV濃度が異なるサンプルに対して静電固定を実行する方法について説明します。十分に多数の固定化小胞に基づく異なる生物物理特性の経験的確率分布の推定を可能にする実験条件の選択が議論される。AFMデータのポストイメージング分析の例が示される。具体的には、固定化されたEVのAFM特性に基づいて溶液中の小胞の大きさを決定するためのアルゴリズムが記載されている。代表的な結果は、凍結TEMイメージングの結果とAFMによる小胞サイジングの一貫性を示す。

プロトコル

1. 生体流体からのEVの分離

1. 差動超遠心^分離8、降水量、またはサイズ排除クロマト^{グラフィー9}などの確立された方法のいずれかによってEVを分離する。
2. 期待される表面および発光バイオマーカーの存在および製剤のクロスコンタミネーションを示すバイオマーカーの欠如を確認する。電子顕微鏡で単離粒子の脂質二層形態を確認する。
   注:エキソソームを分離する場合、ナノ粒子追跡解析(NTA)または動的光散乱によって測定される流体力学的なサイズ分布は、期待される範囲内にあるべきである。EVとエキソソームの分離の詳細は、このプロトコルの範囲を超えています。選択された方法は、実験的な質問と^研究10の目標に依存します。次のステップは、市販の沈殿キット(材料の表)を用いてMCF-7乳癌細胞の増殖培地からの沈殿によってエキソソームを濃縮する手順の具体的な図を示す。
3. 細胞培養拡大の前に、MCF-7乳癌細胞を液体窒素中に貯蔵する。細胞をサブ培養に解凍する。
4. 無菌の慣行に従って、150のmm版の細胞めっきを行う。イーグルの最小必須培地、0.01 mg/mLヒト組換えインスリン、および10%のエキソソームフリーの胎児ウシ血清で構成される成長培地を使用する。
5. 培養を95%の空気と5%_のCO2で通気し、37°Cでインキュベートします。
6. 細胞が落ち着いた後(めっき後約24時間)、培体を変更する。1:10比でプレートを分割し、培養10枚、それぞれ20mLの培地を含む。
7. 細胞がまだ増殖期にある場合、これらのプレートの9(180 mL)から〜70−80%の合流で培養およびプール媒体を収穫する。
8. メディアを 60 mL と 120 mL に分割し、さらに 30 mL/チューブに分割し、遠心分離機を 3,000 x gで 15 分間使用します。
9. 各管から新しい無菌50 mLチューブに上清を移し、エキソソーム分離を行います。
10. 公開されたプロトコルに従って沈殿によってエキソソームを分離するか(例えば、^参照11を参照)、または市販の絶縁キット(材料の表)を使用する場合は、製造元の指示に従ってください。後者の場合の最初のステップとして、遠心分離機細胞培地を3,000 x gで15分間引き出し、細胞や細胞の破片を廃棄する。
11. 沈殿液(1:5容積比)を上清に加え、混合し、一晩冷蔵する。
12. 室温で30分間1,500 x gで遠心分離機。遠心分離後に上清を捨てます。
13. 残りのエキソソームペレットを1,500 x gでさらに5分間回転させます。ペレットを乱すことなく、吸引によって残りの沈殿液を除去する。
14. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーの100 -500 μLでペレットを再ステーペンし、ダウンストリーム分析に必要に応じて複数のアリコートに分割します。
15. 直ちにAFMイメージング用の単離エキソソームの表面固定化に進む。必要に応じて、凍結解凍サイクル中にサンプルの損傷を避けるために予防措置を講じながら、後で使用するために-80°Cでアリコートを凍結してください。

2. 細胞外小胞の表面固定

1. 強力な両面テープ、エポキシ、または代替接着剤を使用して、マイカディスクをAFM/走査トンネリング顕微鏡(STM)磁気ステンレススチール製試料ディスクにしっかりと取り付けます。
2. 鋭いかみそりやユーティリティナイフを使用して、または上面に粘着テープを取り付け、それを孔質にして材料の層を取り除くことによって、マイカディスクをクリーブします。
   注:いずれの方法も、以前に環境にさらされたマイカの薄い層を取り除くことによって、処女表面を明らかにする必要があります。手順の後、AFM/STM金属試料ディスクへのマイカの取り付けは堅固なままでなければなりません。
3. 室温で、10mM NiCl₂溶液の100 μLでマイカの上面を10sで処理し、表面電荷を負から正に変更します。
4. 糸くずのない拭き取りまたはブロッティングペーパーを備えたブロットNiCl₂溶液。マイカ表面を脱イオン(DI)水で3倍洗い、乾燥窒素の流れで乾燥させます。
   注: AFM で修正したサーフェスをスキャンして、汚染物質が含まれであることを確認することをお知めします。
5. AFM試料ディスクに、付属の表面改変マイカをペトリ皿に入れます。
6. 1x PBSでステップ1.14からエキソソームサンプルを希釈し、溶液のmL当たり4.0 x 10^{x 10 10}の粒子の間の濃度を得る。NTAを用いて希釈粒子濃度を検証する。
7. ピペットから希釈されたエキソソーム溶液の100 μLを空にしてマイカの表面にセッシルドロップを形成する。
8. ペトリ皿に蓋をしてパラフィンフィルムで密封し、サンプルの蒸発を減らします。4°Cで12-18hのサンプルをインキュベートします。
   注:固定化されたエキソソームの表面密度は、インキュベーション時間と液体中のEVの濃度に伴って増加します。エキソソームが低濃度でサンプル中に存在する場合は、より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。
9. インキュベーション後、表面を乱すことなく試料の80−90%を吸引する。この時点で、エキソソームはマイカ基板上で静電固定化される。
10. 水和したEVをイメージングする前に、1x PBSで表面をすすいで下さい。3倍を繰り返します。試すプロセス全体を通してサンプルを水和するように注意してください。
11. マイカ表面を1x PBSで洗浄した後、液体の80%~90%を除去し、新鮮な1x PBSのピペット〜40 μLを取り除き、サンプルをカバーします。
12. 乾燥したEVをイメージングする場合は、基板をDI水ですすいでください。3倍を繰り返します。
    注:DI水でリンスすると、塩結晶の形成や、基板が乾燥するにつれて表面に溶剤が堆積するのを防ぐことができます。
13. 乾燥したEVをイメージングする前に、表面に触れることなくできるだけ多くの液体を吸引し、残りを乾燥窒素の流れで乾燥させます。

3. AFMイメージング

1. 乾燥したEVをイメージするには、タッピングおよび非接触イメージングモードで空気中でスキャンするように設計された片持ち直しを選択し、プローブホルダーに取り付けます。
   注:材料の表に記載されている例の片持ち味の特性(長さ123μm、幅40μm、先端半径7nm、および37 N/mばね定数)は、利用可能なAFM計測器と互換性のあるプローブを選択する際にガイドとして使用することができます。
   1. ステップ 2.13 から AFM ステージに準備を配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクは段階のサンプルを固定する。準備と段階が熱的に平衡化するための時間を確保します。
   2. タップモードを使用して、マイカの表面の十分に大きな領域をスキャンします。たとえば、5 x 5 μm の面積を選択し、512 行で 512 行のスキャンレートでラスター化し、高さと位相の両方の画像を取得して、サンプルの地形と表面特性に関する補完的な情報を提供します。
      注: イメージ領域とイメージを形成するために選択した行数に伴ってスキャン時間が増加しますが、スキャンレートが 1 秒あたりにスキャンされた行数として定義されると減少します。高速スキャン速度は、画質に影響を与える可能性があります。したがって、ラスター化の速度は、取得時間と画質のトレードオフのバランスをとる必要があります。
2. 水和小胞を画像化するには、柔らかい水和サンプルのスキャンに適した片持ち直しを選択し、液体中のスキャン用に設計されたプローブホルダーに片持ち式を取り付けます。
   注:利用可能なAFM計測器と互換性のあるプローブを選択する場合、材料の表に記載されているプローブの仕様(公称長さ175μm、幅22μm、先端半径20nm、0.07 N/mばね定数、および4~8kHzの範囲の駆動周波数でのイメージング用に最適化された)をガイドとして使用できます。
   1. 1x PBSで片持ちの先端を濡らし、スキャン中に液体に気泡を導入する可能性を減らします。
   2. ステップ 2.11 から AFM ステージに準備を配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクは、その表面に固定化されたEVを含む付属のマイカを固定します。
   3. 調製とAFMステージが熱的に平衡化する時間を確保します。
   4. タッピングモードで水和マイカサーフェスをイメージします。高さと位相の両方の画像を取得します。
      注:イメージング品質は、計測、選択されたプローブ、およびスキャンパラメータの影響を受けます。スキャン条件を最適化する場合、開始点として使用できます: 5 x 5 μm 領域を 512 行でスキャンし、~0.8~ 1.0 Hz のスキャン レートと 4 ~ 8 kHz のドライブ周波数を選択します。

4. 画像解析

注: 取得した高さ画像には、次のデータ処理および解析手順が適用されます。同様の手順は、位相データを分析するために適応されてもよい。以下の説明は、GNU一般公衆ライセンスの下で利用可能な無料でオープンソースのソフトウェアであるGwyddion¹²に固有です。同様の機能は、代替ソフトウェア ツールで使用できます。

1. データプロセス、SPMモード、ヒントに移動し、モデルヒントを選択します(図2)。サンプルのスキャンに使用する先端のジオメトリと寸法を選択し、[OK]をクリックします。
2. 表面の再構成を実行して、先端の浸食アーティファクトを修正します。画像を開きます。メニューから、[データプロセス]、[SPMモード]、[ヒント]を選択し、[サーフェスの再構成]を選択し、[OK] をクリックします (図3)。
3. スキャン データから基板の傾きを取り除いて、実験室の XY 平面に一致するようにイメージング プレーンを配置します。このタスクを実行するには、[データ プロセス] 、[レベル]を選択し、[平面レベル]を選択します (図 4)。
4. [データ プロセス]を選択してイメージの行を位置合わせし、[データを修正]を選択し、[行の位置を整列]を選択します。いくつかの配置オプションを使用できます (図 5)。たとえば、中央値は、各スキャン ラインの平均高さを検出し、データから減算するアルゴリズムです。
5. [データ プロセス]に移動し、[データを修正]に移動し、[傷跡の削除] (図 6)を選択します。
6. データプロセスからアクセス可能なレベルドロップダウンメニューで[ベースを平坦化]を選択して、マイカサーフェスをゼロの高さZ = 0に位置合わせします(図7)。
7. グレインドロップダウンメニュー(図8A)で[しきい値でマーク]を使用して、スキャンしたサーフェス上のEVを識別します。このアルゴリズムは、表面固定エキソソームを、ユーザが選択した閾値を超える高さによってゼロサーフェス基板から突き出た粒子として識別します。1 ~ 3 nm の範囲のしきい値を選択すると、バックグラウンド干渉のほとんどが除去されます。より小さいしきい値は、よりクリーンな背景で使用されます。
   注: 図8Aのしきい値は 1.767 nm です。この閾値化を伴うMCF-7エキソソーム同定の結果を図8Bに示す。Gwyddionは、自動しきい値(大津の方法)、エッジ検出、流域アルゴリズムなど、画像内の小胞を自動的に識別するアルゴリズムとして、しきい値に代わるいくつかの選択肢を提供します。
   注:粒子凝集体は、AFM画像に存在する場合、マスクされ、解析から除外され得る。
8. グレインズメニューからアクセス可能な分布アルゴリズムを使用して、識別されたEVの幾何学的および寸法的な特性解析を実行します。
   注:Gwyddionは、水和または乾燥状態で固定化されたEVのスカラー値、アール、体積、およびその他の特性の分布を評価するためのツールを提供します。スカラー値プロパティの例を図 9に示し、識別された各エキソソームのフットプリント内の最大高さの分布を示します。
9. 他の計算ツールやカスタムコンピュータプログラムによる特殊な分析のためにGwyddionからAFMデータをエクスポートします。

結果

EVの表面固定は、イメージングシーケンスの重要なステップです。負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの静電表面固定化は、マイカの基板が正の表面電荷を有するように修飾された後に強く起こるであろう。_NiCl2による処理を行わずに表面変化を良好に付与すると、基板上のEVの固定化は効果がないことが判明した。図10Aの高さ画像は、PBS?...

ディスカッション

生体液からのEVの固定化、表面スキャン、画像解析は、液体中のEVのAFM特性解析のために開発されたプロトコルの重要なステップです。AFMイメージングに適した小胞の数は、画像化された表面積および基板上に固定化された小胞の表面濃度と共にスケールする。EVやエキソソー^ム18の負のゼータ電位を考えると、液体サンプルからAFM基板へのEVの静電固定を提唱する。固定化は...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4