JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

Abstract

רצף במיקומים מרוחקים והגדרות משאבים עניים מציג אתגרים ייחודיים. רצפי Nanopore ניתן להשתמש בהצלחה בתנאים כאלה, והוא נפרס במערב אפריקה במהלך האחרונה מגיפת נגיף האבולה, הדגשת אפשרות זו. בנוסף ליתרונותיה המעשיים (עלות נמוכה, הקלות של הובלת ציוד ושימוש), טכנולוגיה זו גם מספקת יתרונות בסיסיים על פני הדור השני הגישות ברצף, במיוחד את אורך הקריאה הארוכה מאוד, יכולת הרצף הישיר רנ א, וזמינות בזמן אמת של נתונים. דיוק לקרוא Raw נמוך יותר מאשר בפלטפורמות רצף אחרות, המייצג את המגבלה העיקרית של טכנולוגיה זו; עם זאת, זה יכול להיות מוחלט חלקית על ידי עומק קריאה גבוהה שנוצר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול תואם שדה עבור רצף של קידוד mRNAs עבור נימן-לאסוף C1, אשר הוא קולטן הסלולר עבור ebolaviruses. פרוטוקול זה כולל חילוץ של רנ א מדגימות דם בעלי חיים, ואחריו RT-PCR עבור העשרה היעד, ברקוד, הכנת הספרייה, ואת רצף הפעלה עצמה, והוא יכול להיות מותאם בקלות לשימוש עם מטרות DNA או RNA אחרים.

Introduction

רצף הוא כלי רב עוצמה וחשוב במחקר ביולוגי וביורפואי. זה מאפשר ניתוח של genomes, וריאציות גנטיות, ו-RNA פרופילי ביטוי, ובכך ממלא תפקיד חשוב בחקירת מחלותאדם ובעלי חיים כאחד,2. רצף שיטות, אחת השיטות הישנות ביותר הזמינות עבור רצפי DNA, עדיין משמש באופן שגרתי עד היום הזה היה אבן פינה של ביולוגיה מולקולרית. במהלך 50 השנים האחרונות, טכנולוגיה זו שופרה כדי להשיג לאורך זמן של יותר מ 1,000 nt ודיוק גבוה ככל 99.999%1. עם זאת, רצף Sanger גם יש מגבלות. רצף ערכה גדולה יותר של דגימות או ניתוח של גנום שלם עם שיטה זו הוא זמן רב ויקר1,3. הדור השני (הדור הבא) שיטות ברצף DNA כגון 454 פירורצף וטכנולוגיית המאיר אפשרו לנו להקטין באופן משמעותי את עלות ועומס העבודה הנדרש לרצף בעשור האחרון, והובילו לעלייה עצומה ב כמות מידע הרצף הביולוגי הזמין4. אף על פי כן, רצף באופן פרטני פועל באמצעות טכנולוגיות אלה הדור השני הם יקרים, ורצף לפי תנאי שדה הוא מאתגר, כמו הציוד הדרוש הוא מגושם ושברירי (בדומה התקני רצף sanger), ולעתים קרובות צריך ל לכייל ולקבל שירות על ידי צוות מיומן במיוחד. כמו כן, עבור רבים של טכנולוגיות הדור השני לאורך לקרוא הם מוגבלים למדי, אשר לעתים קרובות עושה ניתוח ביואינפורמטיקה של מידע אלה מאתגרת.

רצף הדור השלישי באמצעות התקנים nanopore בגודל כיס (ראה טבלת חומרים) יכול לשמש חלופה לפלטפורמות אלה הקימו רצף. במכשירים אלה מולקולת DNA יחיד או RNA עובר דרך nanopore בו זמנית עם זרם יונית כי הוא נמדד אז על ידי חיישן (איור 1). כפי שקורה הnanopore, את האפנון של הזרם על ידי נוקלאוטידים הנוכחים בנקבובית בכל זמן נתון מזוהה, ו בחזרה מבחינה חישובית לתוך הרצף נוקלאוטיד5. בשל עיקרון מבצעי זה, רצף nanopore מאפשר הן את הדור של קריאות ארוכות מאוד (קרוב ל-1 x 106 נוקלאוטידים6) וניתוח של נתונים ברצף בזמן אמת. Barcoding ניתן על ידי הצמדת רצפי נוקלאוטיד מוגדר לחומצות גרעין במדגם, אשר מאפשר ניתוח של דגימות מרובות בהפעלה ברצף בודד, ובכך הגדלת התפוקה לדוגמה והורדת לכל מדגם עלויות. בשל הניידות הגבוהה שלהם קלות השימוש, התקנים nanopore רצפי כבר נעשה שימוש בהצלחה בשדה במהלך מגיפת הנגיף האחרונות מחלת האבולה במערב אפריקה, הדגשת שלהם התאמה לפריסה מהירה לאזורים מרוחקים7 , שמונה.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט תואם השדה עבור רצף של קידוד mrna עבור נימן-פיק C1 (NPC1) חלבון, אשר הוא קולטן הכניסה החובה עבור filoviruses כגון ebolaviruses, ו הוכח להגביל את הרגישות מינים כדי ל אלה וירוסים9,10. הפרוטוקול מקיף את החילוץ של RNA שלם מדגימות דם, הגברה ספציפית של NPC1 mRNA על ידי RT-PCR, ברקוד של דגימות, הכנת הספרייה ורצף עם מכשיר nanopore רצף. אין אפשרות לדון בניתוח נתונים עקב מגבלות שטח, למרות שכמה כיוונים בסיסיים מסופקים בתוצאות הנציגים; עם זאת, הקורא המתעניין מתייחס לפרסום קודם11 לתיאור מפורט יותר של זרימת העבודה בה השתמשנו, כמו גם לפרסומים על-ידי אחרים12,13,14 למידע מפורט לגבי כלי הניתוח המשמשים בזרימת עבודה זו.

Protocol

הדגימות נאספו בעקבות הלוח המוסדי של אוניברסיטת ניואלה (NUIRB) פרוטוקול לא. IRB00008861/FWA00018924.

1. הפקת רנ א מדגימות דם

  1. לאסוף 3 מ ל של דם שלם מן המינים להיות מנותח לתוך צינור איסוף דם מילא 6 מ ל של DNA/RNA ייצוב מגיב (לראות את טבלת חומרים) ולערבב על ידי היפוך 5 פעמים. אחסן את דגימת הדם עד חודש אחד ב-4 ° c.
  2. העבר את תוכן צינור הדם לתוך שפופרת אוסף 50 mL, להוסיף 120 μL של פרוטטינואז K, ולערבב על ידי vortexing עבור 5 s. מארג הדגימה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף 9 מ ל של איזופנול לתערובת ומערבולת עבור 5 s.
  4. מניחים מאגר על לטור הספין של RNA (ראו טבלת חומרים) ומניחים את ההרכבה על סעפת ואקום (ראו טבלת חומרים). הוסיפו את התערובת לדוגמה למאגר. החל ריק עד שכל הנוזל עבר דרך העמודה.
  5. לחילופין, אם אין סעפת ואקום זמין, הדם יכול לעבור דרך העמודה 700 μL מנות על ידי חוזר צנטריפוגה עבור 30 s ב 12,000 x g עם הזרימה-דרך מושלך בין שלבים צנטריפוגה. עם זאת, הדבר ידרוש כ -26 שלבים צנטריפוגה.
  6. מניחים את ה-RNA לטיהור טור הספין לתוך צינור אוסף ולהוסיף 400 μL DNA/RNA מאגר להכין (ראה טבלת חומרים). צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s ולמחוק את הזרימה.
  7. הוסף 400 μL של דנ א/RNA מאגר לשטוף (ראה טבלת חומרים) לעמודה, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s ולמחוק את הזרימה דרך.
  8. מערבבים 5 μL של DNase I (1 U/μL) (ראה טבלת חומרים) עם 75 μl של מאגר העיכול DNA (ראה לוח חומרים) ולהוסיף את התערובת על הטור. המשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הוסף 400 μL של מאגר ה-DNA/RNA להכין את העמודה ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. למחוק את הזרימה.
  10. לשטוף את העמודה עם 700 μL של DNA/RNA לשטוף מאגר צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. למחוק את הזרימה.
  11. חזור על שלב 1.9 עם 400 μL של DNA/RNA מאגר לשטוף צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 2 דקות כדי להסיר את כל מאגר לשטוף שיורית לייבש את הטור. בעת הסרת העמודה מצינור האוסף, הקפד לא להרטיב את החלק התחתון של העמודה עם המאגר בצינור הגבייה.
  12. מניחים את העמודה לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 70 μL של nuclease-מים ללא תשלום. דגירה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר צנטריפוגה עבור 30 s ב 12,000 x g. אחסן את ה-RNA ב-80 ° צ' עד לשימוש נוסף (או השתמש באופן מיידי).
    1. אופציונלי: כדי לכמת את ה-RNA, לקחת סדרת מחלקים ולקבוע את הריכוז באמצעות ספקטרוסקופיה UV (ראה טבלת חומרים).

2. תמלול הפוכה של NPC1 mRNA לתוך cDNA

  1. בצינור התגובה 0.2 mL, להוסיף 8 μL של תבנית RNA (1 pg כדי 2.5 μg של RNA) ו-1 μL כל אחד 10x DNase מאגר האנזים DNase (ראה טבלת חומרים). מודקון ב 37 ° c עבור 2 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התגובה לזמן קצר ומניחים אותו על הקרח.
  2. הוסף 4 μL של היפוך ההמרה מיקס מאסטר (ראה טבלת חומרים) ו 6 μl של nuclease-מים חינם לצינור התגובה ולערבב בעדינות. מודקון את התגובה בתוך הציקלייט במשך 10 דקות ב -25 ° צ' (עבור פריימר ריפוי), ואחריו 10 דקות ב 50 ° צ' (עבור שעתוק הפוכה של RNA). כדי להשבית את האנזים, הדגירה 5 דקות ב 85 ° c.
  3. העברת cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL ולאחסן ב-80 ° צ' עד שימוש נוסף (או להשתמש באופן מיידי).

3. הגברה של מסגרת הקריאה הפתוחה NPC1

  1. צעד הגברה ראשוני
    1. הגדר טאצ'דאון PCR15,16 כדי להגביר את NPC1 cdna עם תחל להגדיר 1 (לראות את שולחן 1), באמצעות התחלה חם באיכות גבוהה DNA פולימראז (ראה טבלת חומרים) עם מאגר התגובה המתאים בתגובת 50 μl אמצעי אחסון עם תבנית 1 μL. במידת האפשר, הגדר את התגובה על הקרח או בבלוק קריר של 4 ° c.
    2. מודדאת התגובה בתוך התרתרטריום עם צעד הראשוני של 30 s ב 98 ° c, ואחריו 10 מחזורים עם דנטורציה ב 98 ° צ' עבור 10 s, פריימר ריפוי עבור 20 s ב 65 ° c, הפחתת הטמפרטורה על ידי 0.5 ° צ' למחזור, ו התארכות עבור 1 דקות ב 72 ° c. לאחר מכן, הפעל 20 מחזורים נוספים עם 10 s ב 98 ° c, 20 s ב 60 ° צ', ו 1 דקות ב 72 ° c, ואחריו צעד התארכות סופי של 5 דקות בשעה 72 ° c.
  2. PCR טיהור שימוש בחרוזים מגנטיים
    1. העבר 50 μL של המוצר PCR לתוך שפופרת ה-DNA של 1.5 mL-נמוך כריכת התגובה (ראה טבלת חומרים). השעיה מחדש חרוזים מגנטיים (ראה טבלת חומרים) ביסודיות על ידי vortexing ולהוסיף 50 μl חרוזים לתגובת ה-PCR. . תערבב היטב דגירה את המדגם על מערבל מסתובבת (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (ב 15 סל ד).
    2. בקצרה לסובב את המדגם ולמקם את 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת על מדף מגנטי (ראה טבלת חומרים) כדי להוריד את החרוזים המגנטי. המתן עד שסופרנטנט הובהר לחלוטין לפני שהמשיך בשלב הבא.
    3. מבלי להפריע את הגלולה ולהשליך.
    4. פיפטה 200 μL של 70% אתנול לתוך צינור התגובה ואת הדגירה של 30 s. מרוב האתנול מבלי להפריע. לגלולה ולהשליך חזור על הסכום הכולל של שתי שטיפות. . תוודא שאף אתנול לא נשאר זה יכול להיות הכרחי כדי לקבל אספירין הראשון עם פיפטה גדול (למשל, 1000 μL), ולאחר מכן להסיר את טיפות אתנול הנותרים עם פיפטה קטן יותר (למשל, 10 μL).
    5. מייבשים את הגלולה למשך 1 דקות. בטמפרטורת החדר
    6. להסיר את צינור התגובה מהמדף המגנטי, להשעות מחדש את הגלולה ב 30 μL של מים חינם של nuclease ו-דגירה עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. מניחים את צינור התגובה בחזרה על המדף המגנטי ולחכות עד שהחרוזים מפלשים לחלוטין.
    8. הסר את supernatant מבלי להפריע את הגלולה ולהעביר אותו שפופרת חדש 1.5 mL התגובה.
  3. הוספת מתאמי ברקוד על-ידי PCR מקונן
    1. הגדר את ה-PCR 50 μL עם התחלה חמה באיכות גבוהה DNA פולימראז עם מאגר תגובה 5x ו פריימר Set 2 (ראה טבלה 1). התחל בקבוצה זו מורכב מאזור ספציפי רצף היעד כדי לאפשר איגוד של מוצרי ה-PCR שנוצר בשלב 3.2 (בתוך מערכת התחל להגדיר 1 רצפים), כמו גם רצף מתאם המשמש כיעד התגובה הבאה של ה-PCR בקוד (cf. סעיף 4). במידת האפשר, הגדר את התגובה על הקרח או בבלוק קריר של 4 ° c. השתמש ב-1 μL של מוצר ה-PCR הטהור שהוכן בסעיף 3.2 כתבנית.
    2. דגירה מיקס התגובה באמצעות צעד הראשוני בשלב הראשון של 30 s ב 98 ° c, ואחריו 10 מחזורים עם דנטורציה ב 98 ° צ' עבור 10 s, פריימר ריפוי עבור 20 s ב 65 ° צ', הפחתת הטמפרטורה על ידי 0.5 ° צ' למחזור והתארכות במשך 1 דקות בשעה 72 ° c. לאחר מכן, מודיית את התגובה עבור 30 מחזורים נוספים עבור 10 s ב 98 ° c, 20 s ב 71 ° c, ו 1 דקות ב 72 ° c, ואחריו צעד התארכות סופי של 5 דקות ב 72 ° c.
    3. נקה את מוצר ה-PCR באמצעות חרוזים מגנטיים כמתואר בסעיף 3.2.

4. ברקוד of NPC1 הגברה

  1. עבור כל מוצר PCR שנוצר בסעיף 3, להגדיר את תגובת ה-PCR בצינור 0.2 mL התגובה באמצעות 50 μL של Taq DNA פולימראז 2x לערבב מאסטר (ראה טבלת חומרים), 2 μl של אחד התחל ברקוד מערכת ה-pcr barcoding (ראה טבלת חומרים וטבלה 2) ו-1 μl של מוצר PCR מטוהר משלב 3.3.2 כתבנית. הוסף 47 μl של נוקלאז מים חינם כדי לקבל את הנפח הסופי של 100 μl.
  2. מודיית את התגובה בתוך התרתרטריום ב 95 ° c עבור 3 דקות כמו דנטורציה ראשונית. לאחר מכן, לרוץ 15 מחזורים עבור 15 s ב 95 ° c, 15 s ב 62 ° c, ו 1.5 דקות ב 65 ° c. בתור התארכות סופית, מודיית את התגובה ב 65 ° c עבור 5 דקות.
  3. לטהר את מוצר ה-PCR כפי שמתואר תחת 3.2, אבל להשתמש 100 μL של חרוזים מגנטיים ו elute ב 30 μL של מים חינם של nuclease.
  4. אם אפשר, לכמת את המדגם באמצעות ספקטרוסקופיה UV.

5. הכנה לספרייה

  1. לשלב כמות שווה של דנ א מקודד מתוך כל מדגם עבור סך של 1 μg של DNA בנפח של 45 μL (במידת הצורך, להוסיף nuclease ללא מים) בצינור התגובה 0.2 mL. אם לא קיימים ספקטרוסקופיה UV, השתמש בנפחים שווים של כל דוגמה. עבור דה-למעקב, להוסיף 7 μL של מאגר תגובת הכנה לסיים (ראה טבלת חומרים), 3 μl של מיקס להכנה הסופית (ראה טבלת חומרים), ו-5 μl של מים חינם. מערבבים בעדינות על ידי מצליף בשפופרת.
  2. מודקון את התגובה עבור 5 דקות ב 20 ° c, ואחריו 5 דקות ב 65 ° c בתוך הציקלייט.
  3. לטהר את מוצר התגובה כפי שמתואר בסעיף 3.2, אבל להשתמש 60 μL של חרוזים מגנטיים ו elute ב 25 μL של מים חינם של nuclease.
  4. אופציונלי: לקחת 1 μl כדי לכמת את ריכוז המדגם באמצעות ספקטרוסקופיה UV. הסכום הכולל צריך להיות יותר מ 700 ng.
  5. לשלב 22.5 μl של דנ א מטוהרים משלב 5.3 עם 2.5 μl של מתאם 1d2 (ראה טבלת חומרים) ו 25 μl של בוטה/TA ליגאז מיקס מאסטר (לראות את הטבלה של חומרים) ב חדש 1.5 mL-DNA התגובה כריכה נמוכה, לערבב בעדינות על ידי מצליף, ולקצר ספין למטה. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לטהר את מוצר התגובה כפי שמתואר בסעיף 3.2, אבל להשתמש 20 μL של חרוזים מגנטיים, להגדיל את זמן הדגירה של ה-DNA איגוד ל 10 דקות, לבצע שני שלבי שטיפת עם 1 מ ל של אתנול כל אחד, ו elute ב 46 μL של nuclease-מים ללא תשלום.
  7. לשלב 45 μl של מוצר התגובה משלב 5.6 עם 5 μl של מתאם ברקוד לערבב (לראות את הטבלה של חומרים) ו 50 μl של בוטה/TA ליגאז בסיס מיקס בצינור DNA-נמוך התגובה מחייב. מערבבים בעדינות על ידי מצליף ו דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. לטהר את מוצר התגובה כפי שמתואר בסעיף 3.2, אבל להשתמש 40 μL של חרוזים מגנטיים, לעשות שני שלבים לשטוף עם 140 μL של מאגר ה-אב (ראה טבלת חומרים) במקום אתנול, להשעות את החרוזים על ידי מצליף ואת הגלולה על מדף מגנטי. אליוט ב 15 μL של מאגר הימנעות (ראה טבלת חומרים). להגדיל את זמני הדגירה של האיגוד הראשוני של ה-DNA על החרוזים, כמו גם עבור הצעד להתחמק 10 דקות. לאחסן את המוצר שהתקבל על הקרח או ב 4 ° צ' עד השימוש.

6. בדיקת איכות של תא זרימה

  1. בצע בדיקת איכות בתא הזרימה לפני השימוש. לשם כך, חבר את התקן הרצף למחשב המארח ופתח את התוכנה.
  2. הכנס תא זרימה (ראה טבלת חומרים) להתקן הרצף ובחר את סוג תא הזרימה מתיבת הבורר ואשר על-ידי לחיצה על זמין.
  3. לחץ על בדוק תא זרימה בתחתית המסך ובחר את סוג תא הזרימה הנכון.
  4. לחץ על התחל בדיקה כדי להפעיל את בדיקת האיכות. מינימום של 800 active nanopores הכולל נדרש כדי שתא הזרימה יהיה שמיש.

7. טעינת תא הזרימה והפעלת רצף הפעלה

  1. פתח את מכסה היציאה לקרקע על-ידי הסטת המכסה בכיוון השעון. הגדר את הP1000-פיפטה כדי ל200 μL והכנס את הקצה לתוך היציאה לקרקע. להתאים את הצינורות כדי 230 μL בעת שמירה על הקצה ביציאה לקרקע, כדי לשרטט 20-30 μL מאגר ולהסיר בועות אוויר.
  2. ב חדש 1.5 mL ה-DNA התגובה שפופרת מחייב להכין את תמהיל לקרקע על ידי שילוב 576 μL של מאגר RBF (ראה טבלת חומרים) עם 624 μl של nuclease-מים ללא תשלום.
  3. בזהירות פיפטה 800 μL של שילוב הטרמה המוכן לתוך הנמל לקרקע ולחכות 5 דקות. הרם את כיסוי היציאה לדוגמה, והפיפטה נוסף 200 μL של תערובת הטרמה שהוכנה לתוך הנמל הטרמה.
  4. פיפטה 35 μL של מאגר RBF לתוך חדש, נקייה 1.5 mL DNA התגובה צינור נמוך. מערבבים ביסודיות את חרוזי LLB (ראו טבלת חומרים) באמצעות ליטוף ומוסיפים 25.5 μl של החרוזים למאגר rbf. הוסף 2.5 μL nuclease-מים ללא תשלום ו 12 μL של ספריית ה-DNA משלב 5.8 ולערבב על ידי ליטוף.
  5. הוסף 75 μL של התערובת לדוגמה בצורה הנפתחת איטית אל תא הזרימה דרך היציאה לדוגמה.
  6. החלף את מכסה היציאה לדוגמה, סגור את היציאה הטרמה וסגור את המכסה של התקן הרצף.
  7. בתוך התוכנה, ודא שתא הזרימה עדיין זמין, פתח ניסוי חדש והגדר את פרמטרי ההפעלה על-ידי בחירת הערכה הנמצאת בשימוש. בחר התקשרות בסיסית חיה. הפעל את רצפי הרצף על-ידי לחיצה על התחל ניסוי. המשך ברצף ההפעלה עד לאיסוף נתונים ניסיוניים מספיקים.

תוצאות

בניסוי מייצג כדי לבדוק את הפרוטוקול המוצג העברנו את ה-RNA מ -10 דגימות דם שונות של חמישה מינים של בעלי חיים (כלומר, 2 אנשים למינים (עז, כבשים, חזיר, כלב, בקר)) (שולחן 3). התשואות RNA ואיכות החילוץ הבאים יכול להשתנות באופן נרחב, במיוחד בשל הבדלים בטיפול במדגם ואחסון. בניסוי הנציג שלנו, הבחנו ריכוזי RNA בין 43 ng ו 543 ng לכל μL (שולחן 3). גם, לאחר הגברה על-ידי RT-PCR, ניתוח ג'ל של NPC-1 PCR-מוצרים הראו תוצאות שונות (איור 2), עם להקות חלשות במידה ניכרת עבור דגימות BC01 ו BC02 (שניהם עז). הבדלים אלה נגרמו ככל הנראה על ידי הבדלים באיכות המדגם, למרות הבדלים ביעילות ה-PCR בשל הבדלים בכריכה פריימר אל הגן NPC1 של מינים שונים לא ניתן לכלול. עם זאת, הבדלים אלה בתשואה ו/או יעילות הגברה לא השפיעו בצורה ניכרת על תוצאת הרצף הכוללת. יתרה מזאת, מוצר PCR נוסף שאינו ספציפי התרחש במדגם BC10 (בקר). בניגוד לרצפי הרצף של סאנגר, מוצרים לא ספציפיים כאלה אינם משפיעים באופן שלילי על תוצאות רצפי הnanopore, מאחר שקריאות אלה יימחקו במהלך המיפוי של הקריאות המתקבלות לרצף התייחסות כחלק מניתוח הנתונים.

לפני כל הפעלה רצף, בדיקת איכות של תא הזרימה לשמש מומלץ מאוד, עם דרישה מינימלית של 800 הנקבוביות הכוללת. בניסוי הנציג שלנו, בדיקת איכות זו החזירה 1,102 נקבוביות זמין לרצף. מאחר שהנתונים מסופקים בזמן אמת וניתן לנתח אותם באופן מיידי, האורך של הפעלת רצף יכול להיות מותאם עבור היישום הפרטני (כלומר, עד לקבלת נתוני רצף מספיקים עבור הניתוח הרצוי). בניסויים שלנו, רצף רצפים מבוצעים בדרך כלל לילה, ובמקרה של ניסוי הנציג שלנו הצלחנו כ 1,400,000 במהלך לרוץ 14 שעות כזה.

בהתאם לסוג ניתוח הנתונים שיבוצע, ניתן להיות מומלץ לעבד רק קבוצת משנה של הקריאות שהתקבלו. במקרה של ניסוי הנציג שלנו, נבחר קבוצת משנה של 10,000 קריאות לניתוח נוסף. לשם כך, הקבצים fastq שנוצר במהלך רצף הפעלה היו מעובדים עוד בסביבה של אובונטו 18.04 הארה, ומלא באמצעות flexbar v 3.0.3 עם פרמטרים אופטימיזציה עבור deריבוב של נתוני רצף nanopore (ברקוד-זנב-אורך 300 , ברקוד-שגיאה-קצב 0.2, ברקוד-הפער-עונש -1)12. לאחר ביטול ריבוב, לקרוא מיפוי הקונצנזוס הדור יכול להיעשות באמצעות מספר כלים שונים, אבל דיון מפורט על ההיבט ביואינפורמטיקה של רצף nanopore מעבר להיקף של כתב היד הזה. עם זאת, במקרה של תוצאות הנציג שלנו, לקרוא מיפוי לרצף התייחסות בוצעה באמצעות Geneious 10.2.3. מתוך 10,000 קריאות שנותחו, 5,457 הראה אורך בין 1,750 לבין 2,000 נוקלאוטידים, אשר מתאים את הגדלים הצפויים של שברי ה-PCR מוגבר כחלק מזרימת העבודה שלנו (1,769 nt, איור 3). שיא נוסף בהתפלגות האורך של הקריאות נצפתה בין 250 ל 500 נוקלאוטידים, אשר ניתן לייחס למוצרי PCR לא ספציפיים. דיריבוב של קריאות מותר להקצאה של 87.6% מקריאות לאחד 10 ברקודים/דגימות שנותחו (איור 4). החלק של קריאות מ, מ, עבור כל ברקוד נע בין 3.4% עבור ברקוד 1 עד 16.9% עבור ברקוד 10; עם זאת, בשל המספר הגדול הכולל של קריאות זה עדיין מותר הקונצנזוס משמעותי הקריאה עם עומק לקרוא גבוה גם עבור אלה השפע התחתון ברקוד datasets. אכן, מיפוי של קריאות ממוין לרצף התייחסות של NPC1 הביא בין 31.7% (ברקוד 2) ו 100% (ברקוד 7 ו-8) הקריאות מיפוי להפניה, מתן עומק לקרוא של יותר מ 90 קורא בכל מיקום עבור כל מדגם. זה לאחר מכן יותר מספיק כדי לאפשר ביטחון בסיסי הסכמה בסיסית עם שיעור שגיאה זניח.

figure-results-3334
איור 1: ייצוג סכמטי של רצפי DNA באמצעות טכנולוגיית nanopore. מולקולת ה-DNA אחד שנתקע עובר דרך nanopore מוטבע קרום עמיד בחשמלית, עם האליאז ויסות מהירות המעבר. זרם יוניים עובר בו זמנית דרך הנקבובית ונמדד ברציפות. אוספים של הזרם שנגרם על ידי נוקלאוטידים הנוכחי בנקבוביות מזוהים בחזרה מבחינה חישובית לתוך הרצף נוקלאוטיד של ה-DNA הגדיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3972
איור 2: הגברה של מוצרי ה-PCR של נימן-פיק C1 מ-mRNA. mRNA היה מבודד עז (BC01 ו-02), כבשים (BC03 ו-04), חזיר (BC05 ו-06), כלב (BC07 ו-08), בקר (BC09 ו -10). מוצרי PCR מקוננים הופרדו 0.8% agarose ג'ל ב-1 x טה מאגר (מוכן מאגר 50x טה: 242.28 g של בסיס טריס, 57.1 mL של חומצה אצטית קרחוני, 100 mL של 0.5 M EDTA, dH2O 1 L, pH מותאם ל 8.0) עבור 45 דקות ב 100 V ומוכתם עם Sybr בטוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4663
איור 3: התפלגות באורך הקריאה של 10,000 קורא מתוך הניסוי המייצג. מספר הקריאות שהתקבלו עם מרווח זמן מסוים של אורך קריאה מצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5094
איור 4: הפצת הקריאות לאחר הדריבוב. המספר והאחוזים של קריאות ממופות (אפורות) וקריאה ממופה (שחור) עבור כל ברקוד מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: סקירה של סטים של תחל שימוש. הגברה ראשונית של רצפי היעד בוצעה עם פריימר סט 1. פריימר Set 2 שימש לאחר מכן עבור הגברה מקוננת ותוספת מתאם. מתאמים מסומנים באדום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה 2: סקירה של רצפי ברקוד. ברקודים נפרדים שימשו לזיהוי כל דגימה ברצף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

שולחן 3: ריכוזי RNA שהתקבלו בעקבות החילוץ מדגימות הדם הרצף בניסוי המייצג. ריכוזי RNA של שני אנשים מכל אחד מחמשת המינים מוצגים, והיחס של הצפיפויות האופטיות ב260/280 nm ו-260/230 ננומטר מצוינים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

בשני העשורים האחרונים, רצף של דגימות ביולוגיות הפך להיבט חשוב יותר ויותר של מחקרים במגוון רחב של נושאים. פיתוח מערכות רצף הדור השני המבוסס על רצף של מערך צפוף של תכונות דנ א באמצעות מחזורים איטרטיביים של מניפולציה אנזימטית ורכישת נתונים מבוססי תמונה1 יש תפוקה מוגברת באופן דרמטי לעומת ה טכניקת הרצף המסורתי של סאנגר, ומאפשרת ניתוח של דגימות מרובות, כמו גם מינים שונים של חומצות גרעין במדגם נתון במקביל4. עם זאת, עבור רוב מערכות הדור השני בשימוש נפוץ, רק קריאות קצרות מיוצרים, ואת כל הפלטפורמות להסתמך על רגיש, מגושם, ויקר ציוד3,4.

בניגוד לפלטפורמות רצף הדור השני, התקן הרצף המשמש בפרוטוקול זה מבוסס על טכנולוגיית nanopore. כאן אחד-תקועים חומצות גרעין מולקולה עובר דרך nanopore, וכתוצאה מכך אפנון של הזרם יונית כי הוא גם זורם דרך nanopore אותו, ואשר ניתן למדוד ובחזרה בתרגום להסיק את הרצף של מולקולת חומצות גרעין. גישה זו של דור שלישי ברצף מעניקה מספר יתרונות על פני גישות אחרות. היתרונות העיקריים הקשורים ישירות לעקרון העבודה הייחודי של טכנולוגיה זו הם אורך לקריאה ארוך מאוד המיוצר (לקרוא אורכי של עד 8.8 x 105 נוקלאוטידים דווחו6), היכולת רצף לא רק DNA אבל גם RNA ישירות, אשר הפגינו לאחרונה עבור גנום וירוס שפעת מלאה17, ואת היכולת לנתח נתונים בזמן אמת כפי שהם מופקים, אשר מאפשר זיהוי metagenomics מהירה של פתוגנים בתוך דקות18. יתרונות מעשיים נוספים הם בגודל קטן מאוד של המכשיר nanopore רצף, המאפשר להשתמש בו בכל מעבדה או על משימות שדה למיקומים מרוחקים19,20, ואת המחיר הנמוך בהשוואה לרצף אחר פלטפורמות. במונחים של עלויות ריצה, כיום תא זרימה חדשה נדרשת עבור כל הפעלה רצף, מה שמביא לעלויות של כ $1,100 לכל הפעלה עבור תא הזרימה והכנת הספרייה ריאגנטים. עלויות אלה עשויות להצטמצם במקרים מסוימים על-ידי כביסה ושימוש חוזר בתא הזרימה, או על-ידי ברקוד וברצף של דגימות מרובות בהפעלה אחת. כמו כן, סוג הרומן של תא זרימה נמצא כרגע בדיקת בטא על ידי מספר קטן של מעבדות, אשר ידרוש שימוש במתאם תא הזרימה (נקרא "flongle"), וצריך להפחית באופן משמעותי את מחיר התא ובכך להפעיל עלויות.

הקיצור העיקרי של רצף nanopore שרידי הדיוק שלה, עם קריאה אחת accuracies בטווח של 83 כדי 86% שדווחו6,21,22, ואת רוב אי-דיוקים הנגרמים על ידי הכנסה/מחיקות ( indels)5,21. עם זאת, עומק קריאה גבוה יכול לפצות על אי-דיוקים אלה, ומחקר שנערך לאחרונה הציע בהתבסס על שיקולים תיאורטיים שעומק קריאה של > 10 עשוי להגדיל את הדיוק הכולל כדי > 99.8%21. עם זאת, יש צורך בשיפורים נוספים בדיוק, במיוחד אם יש לבצע ניתוח ברמת מולקולה בודדת ולא ברמת רצף הסכמה. השימוש בטכנולוגיה של 1D2 כמתואר בפרוטוקול זה, אשר מבוסס על תוספת של 1d2 ומתאמי ברקוד (cf. סעיף 5.5) כי התוצאה הן קווצות של מולקולת DNA יחיד להיות הרצף על ידי אותו nanopore, מגביר לקרוא דיוק מאז מידע משני קווצות DNA ניתן להשתמש לקביעת רצף. עוד, אסטרטגיה לעקיפת הדרך שניתן לרדוף אחריה כדי לשלב את היתרונות של רצף nanopore (אורך קריאה ארוך במיוחד) עם הדיוק הגבוה יותר של טכנולוגיות ברצף אחרות היא להשתמש nanopore רצף מידע כפיגום, אשר הוא לאחר מכן מלוטש באמצעות רצף נתונים מפלטפורמות אחרות6.

הגורם הקריטי ביותר להצלחת הפרוטוקול המוצג כאן הוא איכות דגימה, ובמיוחד את הכמות והאיכות של ה-RNA המחולצים. אחסון נכון ושליפת הבקשה של RNA לעזור בהשגת תשואה נאותה RNA. השימוש בצינורות של איסוף דם מתאים מאפשר אחסון של דגימות דם עד חודש אחד, אבל קרישת דם יכול להיות בעיה, במיוחד כאשר הדגימות מאוחסנות בטמפרטורות גבוהות, אשר יכול להיות המקרה תחת תנאי שדה. הצעד הקריטי השני הוא הגברה של רצפי היעד, ובמיוחד תחת תנאי השדה תגובות PCR בדרך כלל לבצע פחות טוב מאשר בתנאים סטנדרטיים מעבדה7. לשם כך, העיצוב הקפדני והאופטימיזציה הוא בעל חשיבות עליונה להשגת הגברה חזקה. בנוסף, הגישות המקוננות של ה-pcr והטאצ ' pcr, כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול זה, יכולות להגביר את הפירוט והרגישות של הגברה הגן היעד4,7. אכן, בניסיון שלנו בליבריה וגינאה עם הטכנולוגיה הזאת מקוננים הפרוטוקולים נדרשו תחת תנאי שדה עם דגימות שדה אפילו עבור סטים המאפשרת הגברה של מטרות מתוך דגימות מעבדה ובתנאי מעבדה עם סבב יחיד של ה-PCR (7 ותוצאות שלא פורסמו).

בניגוד לצעדים קריטיים יותר אלה, הכנה לספרייה והפעלת רצף עצמה הם הליכים חזקים למדי. עם זאת, תחת תנאי שדה בעיות מעשיות כגון הזמינות של פיסות מסוימות של ציוד יכול להיות בעייתי. לדוגמה, ספקטרוסקופיה UV יש צורך לקבוע ריכוזי DNA לפני הכנת הספריה דגימות ברקודים. עם זאת, צריך מכשיר כזה לא יהיה זמין תחת תנאי שדה, כמות שווה של כל מדגם יכול פשוט להיות משולב כדי ליצור את 45 μL נדרש עבור הכנת הספרייה, עם הבדלים בחומר הקלט לדוגמה אז בדרך כלל להיות הולם על ידי הגדול מספר הקריאות. באופן דומה, הצורך בקישוריות לאינטרנט עבור הפעלת רצף יכול להיות בעיה, למרות בסיס קריאה לא צריך עוד להתבצע באופן מקוון, אך ניתן לעשות מקומי; עם זאת, הכרח זה ניתן להסרה בנסיבות מסוימות על ידי היצרן אם נדרש.

לסיכום, הפרוטוקול שהוצג מאפשר רצף בעלות נמוכה יחסית במיקומים ללא גישה לציוד רצף מסורתי, כולל במיקומים מרוחקים. זה יכול בקלות להיות מותאם לכל היעד RNA או DNA, ובכך לאפשר לחוקרים לענות על שאלות ביולוגיות רבות.

Disclosures

TH השתתפו בתוכנית אוקספורד Nanopore טכנולוגיות (ONT) מיניון גישה מוקדמת מ 2014 אל 2015, וקיבל התקנים מיניון ותאי זרימה עבור מחקר הקודם 7 ביצוע על ידי המכון הלאומי לבריאות, ארה ב, ללא תשלום או בעלויות מופחתת . הוא הוזמן על ידי ONT להציג חלק מהעבודה הזאת בלונדון קורא 2015 בלונדון, בריטניה, ו-ONT שתשלום עבור הובלה ולינה. עבור העבודה המוצגת בכתב יד זה, אין הטבות (למשל חומרה או ריאגנטים בעלות מופחתת, החזרים לנסיעות וכו ') הושגו מ-ONT. AM, KF ו-RS אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לאליסון גרוסת על קריאה קריטית של כתב היד. עבודה זו היה נתמך כספית על ידי המשרד הפדרלי הגרמני של מזון וחקלאות (BMEL) מבוסס על החלטה של הפרלמנט של הרפובליקה הפדרלית של גרמניה באמצעות המשרד הפדרלי לחקלאות ומזון (BLE).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beadsOxford Nanopore TechnologiesSQK-LSK3081D² Sequencing Kit
Blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagentZymo ResearchR1150DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube
Blunt/TA ligase master mixNew England BiolabsM0367SBlunt/TA Ligase Master Mix
DNA-low binding reaction tubeEppendorf30108051DNA LoBind Tube
DNase buffer and DNaseThermoFisher Scientific11766050SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme
Flow cellOxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN105.24flow cell R9.4
Hot start high fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0493LQ5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U)
Magnetic beadsBeckman CoulterA63881Agencourt AMPure XP beads
Magnetic rackThermoFisher Scientific12321DDynaMag-2 Magnet
Nanopore sequencing deviceOxford Nanopore Technologies-MinION Mk 1B
PCR barcoding kitOxford Nanopore TechnologiesEXP-PBC001PCR Barcoding Kit I (R9)
Reverse transcriptase master mixThermoFisher Scientific11766050SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion bufferZymo ResearchR1151Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit
Rotating mixerThermoFisher Scientific15920DHulaMixer Sample Mixer
Taq DNA polymeraseNew England BiolabsM0287SLongAmp Taq 2x Master Mix
Ultra II End-prep kitNew England BiolabsE7546SNEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul
UV spectrophotometerImplen-NanoPhotometer
Vacuum manifoldZymo ResearchS7000EZ-Vac Vacuum Manifold

References

  1. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  2. Shendure, J., Lieberman Aiden, E. The expanding scope of DNA sequencing. Nature Biotechnology. 30 (11), 1084-1094 (2012).
  3. Liu, L., et al. Comparison of next-generation sequencing systems. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 251364 (2012).
  4. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in Next-Generation Sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17, 95-115 (2016).
  5. Lu, H., Giordano, F., Ning, Z. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (5), 265-279 (2016).
  6. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
  7. Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Ebola Outbreak Tool. Emerging Infectious Diseases. 22 (2), 331-334 (2016).
  8. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
  9. Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
  10. Ndungo, E., et al. A Single Residue in Ebola Virus Receptor NPC1 Influences Cellular Host Range in Reptiles. mSphere. 1 (2), (2016).
  11. Martin, S., et al. A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle. Genome Medicine. 10 (1), 58 (2018).
  12. Roehr, J. T., Dieterich, C., Reinert, K. Flexbar 3.0 - SIMD and multicore parallelization. Bioinformatics. 33 (18), 2941-2942 (2017).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Kielbasa, S. M., Wan, R., Sato, K., Horton, P., Frith, M. C. Adaptive seeds tame genomic sequence comparison. Genome Research. 21 (3), 487-493 (2011).
  15. Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research. 19 (14), 4008 (1991).
  16. Korbie, D. J., Mattick, J. S. Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nature Protocols. 3 (9), 1452-1456 (2008).
  17. Keller, M. W., et al. Direct RNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome. Scientific Reports. 8 (1), 14408 (2018).
  18. Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Medicine. 7, 99 (2015).
  19. Castro-Wallace, S. L., et al. Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station. Scientific Reports. 7 (1), 18022 (2017).
  20. Goordial, J., et al. In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79 degrees 26'N) Canadian High Arctic Permafrost Ice Wedge Microbial Communities. Frontiers in Microbiology. 8, 2594 (2017).
  21. Runtuwene, L. R., et al. Nanopore sequencing of drug-resistance-associated genes in malaria parasites, Plasmodium falciparum. Scientific Reports. 8 (1), 8286 (2018).
  22. Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148nanoporeC1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved