בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Summary

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

Abstract

מודלים של עכברים ממלאים תפקיד מכריע בחקר הפרעות קצב ומאפשרים לחקור מנגנונים מרכזיים של הפרעות קצב, כולל שינוי בתפקוד תעלת היונים וטיפול בסידן. לשם כך, קרדיומיוציטים פרוזדוריים או חדריים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק טלאי או לחקור הפרעות בטיפול בסידן. עם זאת, התשואה המוגבלת של קרדיומיוציטים באיכות גבוהה המתקבלים על ידי פרוטוקולי הבידוד הנוכחיים אינה מאפשרת את שתי המדידות באותו עכבר. מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באיכות גבוהה באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, למדידות עוקבות בו זמנית של מעברי סידן וזרם סידן מסוג L מחיה אחת. לבבות עכבר מתקבלים, ואבי העורקים הוא cannulated במהירות כדי להסיר דם. לאחר מכן הלבבות מחוררים תחילה בתמיסה נטולת סידן (37°C) כדי לנתק את הרקמה ברמה של דיסקים משולבים ולאחר מכן בתמיסת אנזים המכילה מעט סידן כדי לשבש מטריצה חוץ-תאית (37°C). הלב המעוכל מנותח לאחר מכן לאטריה ולחדרים. דגימות רקמה נחתכות לחתיכות קטנות ומומסות על ידי פיפטציה בזהירות למעלה ולמטה. העיכול האנזימטי מופסק, והתאים מוכנסים מחדש בהדרגה לריכוזי הסידן הפיזיולוגיים. לאחר טעינה עם מחוון פלואורסצנטי Ca²⁺, קרדיומיוציטים מבודדים מוכנים למדידה בו זמנית של זרמי סידן וחולפים. בנוסף, נדונות מלכודות בידוד ופרוטוקולי מהדק טלאי ועקבות מייצגים של זרמי סידן מסוג L עם מדידות ארעיות סידן בו זמנית במיוציטים מורין פרוזדורים וחדריים שבודדו כמתואר לעיל.

Introduction

הפרעות קצב לב הן נפוצות ואחד האתגרים העיקריים כיום בתחום הבריאות, שכן הן משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם. הפרעות קצב קשורות לתחלואה גבוהה ולתמותה ^1,2 ומייצגות את הסיבה הבסיסית לרוב מקרי המוות הלבבי הפתאומי³. אפשרויות הטיפול העדכניות שיפרו את הישרדות המטופלים, אך עדיין מדובר בעיקר בטיפולים סימפטומטיים ולא במנגנונים הבסיסיים. לכן, טיפולים אלה הם בעלי יעילות מוגבלת ועלולים לגרום לעתים קרובות לתופעות לוואי חמורות ^4,5,6. שיפור אפשרויות הטיפול הנוכחיות דורש תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה הבסיסית, מה שיוצר את הצורך במודלים מתאימים למחקר. מודלים של בעלי חיים קטנים - ובמיוחד מודלים של עכברים - ממלאים תפקיד מכריע במחקר הפרעות קצב, שכן הם מאפשרים לחקור מנגנוני מפתח של הפרעות קצב, למשל ההשפעה הגנטית על אלקטרופיזיולוגיה תאית, תפקוד תעלות יונים או טיפול בסידן ^7,8.

לשם כך נדרשים קרדיומיוציטים פרוזדוריים וחדריים מבודדים בכמות מספקת וכדאיות. ספקטרום רחב של גישות בידוד שונות להשגת מיוציטים פרוזדוריים וחדריים תואר בעבר 9,10,11,12,13 וכמה קבוצות הציגו נתונים ממדידות סימולטניות של זרם מסוג L וזרם סידן המושרה על ידי מעבר סידן מפרוזדורים 14 או חדר ¹⁵ קרדיומיוציטים מורין. עם זאת, למיטב ידיעתנו אין נתונים זמינים על מדידות פרוזדורים כמו גם חדרים מחיה אחת. החוקרים מתמקדים במגוון רחב של נושאים, החל מאלקטרופיזיולוגיה ועד פרוטאומיקה, מחקרים פונקציונליים כמו התכווצות תאים או אינטראקציות חלבונים, תפקוד מיטוכונדריאלי או גנטיקה – כולם זקוקים לקרדיומיוציטים מבודדים. לפיכך, רבים מהפרוטוקולים שפורסמו לא פותחו במיוחד עבור מחקרי מהדק טלאי, מה שמוביל לתפוקות מוגבלות ואיכות תאים לא מספקת למחקרי מהדק טלאים. לפיכך, מדידות בו זמנית של מהדק טלאי וסידן ארעיות של תאים פרוזדוריים וחדרים שבודדו מבעל חיים אחד אינן יכולות להתבצע עם פרוטוקולים מבוססים.

בידוד של מיוציטים מורינים – במיוחד פרוזדורים – עבור ניסויים מהדק טלאי נותר מאתגר. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ומהירה לבידוד של מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באיכות גבוהה באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר לאחר מכן מדידות בו זמנית הן של זרם קרום נטו והן של מעבר סידן המושרה בזרם מחיה אחת. מאמר זה מפרט פרוטוקול לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים שמקורם בעכברים מסוג בר ובעכברים הנושאים מוטציות גנטיות. פרוטוקול זה יכול לשמש עכברים זכרים ונקבות כאחד. בידוד המיוציטים, התמונות והתוצאות המייצגות המתוארות להלן התקבלו מעכברי בר מסוג C57Bl/6 בגיל 6 (± 1) חודשים. עם זאת, פרוטוקול זה שימש בהצלחה עבור עכברים בגילאים שונים החל מ 2 עד 24 חודשים עם גנוטיפים שונים. איור 1 מראה את מערך הבידוד ותקריב של לב משומר במהלך זילוח אנזימים.

Protocol

כל ההליכים בנושא בעלי חיים אושרו על ידי המועצה לביקורת בעלי חיים בסקסוניה התחתונה (LAVES, AZ-18/2900) ונערכו בהתאם לכל ההנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת בעלי חיים.

1. סידורים מראש

1. הכינו 1 ליטר של חיץ זילוח 10x (טבלה 1), 500 מ"ל של חיץ זילוח 1x (טבלה 2), 50 מ"ל של חיץ עיכול (טבלה 3), 10 מ"ל של חיץ עצירה (טבלה 4), 1 ליטר של תמיסת Tyrode (טבלה 5), 10 מ"ל של כל תמיסת שלב סידן (תמיסת Tyrode עם גלוקוז וכמות סידן מתאימה כפי שצוין), 1 ליטר של תמיסת 4-AP (טבלה 5), 100 מ"ל של תמיסת פיפטה (טבלה 6) ו-5 מ"ל של חומצה פלורונית לפי המתכונים שסופקו.
   הערה: ניתן להכין מראש תמיסות אמבטיה (Tyrode ותמיסת 4-AP) (ללא גלוקוז) ולאחסן ב +4 ° C, גלוקוז מתווסף ביום הניסוי. ניתן לאחסן תמיסת פיפטה ב -20 מעלות צלזיוס, מחוון סידן מתווסף ביום הניסוי ותמיסה מאוחסנת על קרח עד לשימוש נוסף. ניתן לאחסן חיץ זילוח 10x בטמפרטורת החדר, יש להכין חיץ זילוח 1x, חיץ עיכול וחיץ עצירה טריים ביום הניסוי.
2. הפעל את אמבט המים ואת משאבת הרולר.
3. מילוי מראש של מנגנון לנגנדורף בחיץ זילוח; ודא שהוא נטול אוויר.
4. הכינו צינורית אבי העורקים על ידי קיבוע מתחת למיקרוסקופ דיסקציה, חברו מזרק 1 מ"ל מלא בחיץ זילוח ואוויר צלול על ידי שטיפת הצינורית.
   הערה: חשוב להימנע מכל אוויר בתוך מערכת הזלוף, שכן זה ישפיע ישירות על זילוח כלילי ובכך על יעילות העיכול. במידת הצורך, ניתן להוסיף מלכודת בועות להתקנה, כדי למנוע בבטחה לכידת אוויר.
5. הכינו צלחות פטרי עם מספיק חיץ זילוח לאיסוף איברים ומיקרוסקופ (החיץ צריך לכסות היטב את כל האיבר, כמה מיליליטרים – תלוי בגודל צלחת הפטרי המשומשת – אמורים להספיק).
6. הכינו 3 צלחות פטרי עם חיץ עיכול לדיסוציאציה של רקמות ומיקרוסקופ, החיץ צריך לכסות את האיבר לדיסקציה תחת המיקרוסקופ בתוך צלחת הפטרי המתאימה, הכמות תלויה בגודל צלחת הפטרי המשומשת. עבור דיסוציאציה להשתמש 3 מ"ל עבור רקמה חדרית ו 1.5 מ"ל עבור רקמת פרוזדורים.

2. קצירת איברים

1. הזריקו לעכבר 0.1 מ"ל הפרין (1,000 U/mL) כלומר באמצעות מזרק 1 מ"ל עם צינורית 27 גרם והמתינו 5-10 דקות.
2. הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה יחד עם רקמה קטנה ספוגה בכ-500 מיקרוליטר איזופלורן. החיה לא צריכה להיות בקשר עם הרקמה. כדי להימנע מכך, ניתן להשתמש בקלטת הטבעה של ביופסיה פלסטית כדי לכסות את הרקמה. ברגע שהחיה מורדמת לחלוטין, בדוק אם יש רפלקס צביטת בוהן וברגע שהוא אינו קיים יותר, להרדים במהירות את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם.
3. הניחו את העכבר על פלטפורמה על גבו (למשל, על קלקר מכוסה במגבת נייר) וקיבעו את הכפות עם צינוריות כדי להחזיק אותו במקומו.
4. הסר פרווה ועור המכסים את החזה וחלק מהבטן עם חתך ברור מ jugulum לכיוון סימפיזיס ולפתוח את הבטן ממש מתחת xiphoid מבלי לפגוע בכל מבנה איבר באמצעות מספריים. להרים את עצם החזה עם מלקחיים כירורגיים לחתוך את הסרעפת עם מספריים לאורך קצה הצלעות, ולאחר מכן לחתוך את הצלעות בקו השחי המדיאלי ולהסיר את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
5. בזהירות להסיר את קרום הלב באמצעות מלקחיים קהה במהירות להסיר את הלב על ידי הרמת אותו עם מלקחיים קהה מלמטה על ידי חיתוך כלי גדול עם חתך אחד בודד באמצעות מספריים.
6. הכניסו את הלב לחיץ זילוח בטמפרטורת החדר וקשרו את אבי העורקים עם מחט קצה קהה מתחת למיקרוסקופ במהירות האפשרית.
   הערה: הסר כל רקמת ריאה ורקמת שומן המחוברת לאיבר מבלי לאבד זמן רב מדי עליו. בזמן הקנולציה, יש לוודא כי קצה המחט אינו משתרע דרך שסתום אבי העורקים, שכן הדבר יפגע בתוצאות על ידי מניעת חוצצים מלהיכנס לעורקים הכליליים.
7. קשרו את הלב עם פיסת משי תפירה בחוזקה למחט והתנתקו מהמזרק.
   הערה: כל ההליך מקבלת הלב (הרגע שבו כלי הדם הגדולים נחתכים) ועד תפירת אבי העורקים למחט צריך לקחת כמה שפחות זמן. מומלץ לא לקחת יותר מ 90-180 שניות מהסרת הלב עד תחילת הזלוף.

3. עיכול אנזימטי

1. לאחר קנולציה של אבי העורקים, חברו מיד את הלב המשומר למנגנון לנגנדורף תוך הימנעות מכניסת אוויר למערכת.
   הערה: זה יכול לעזור שיש טיפה תלויה של חיץ זילוח בתחתית מנגנון לנגנדורף, כמו גם טיפה של חיץ זילוח יושב על החלק העליון של המחט על מנת למנוע כל אוויר נכנס למערכת.
2. יש לערבב את הלב עם חיץ זילוח למשך דקה אחת בטמפרטורה של 37°C בדיוק וקצב זילוח של 4 מ"ל/דקה בדיוק.
   הערה: על מנת לקבל טמפרטורה של 37 °C בקצה מחט הזלוף, טמפרטורת אמבט המים צריכה להיות מוגדרת מעט מעל כ 40 °C (70 °F). זה צריך להיבדק באופן קבוע על ידי מדידת הטמפרטורה בקצה זילוח.
3. מעבירים את הזילוח לחיץ העיכול ומחוררים למשך 9 דקות בדיוק בטמפרטורה של 37°C בדיוק ובקצב זילוח של 4 מ"ל/דקה בדיוק.
4. העבירו את הלב המעוכל לצלוחית פטרי עם מספיק חיץ עיכול כדי לשמור עליו מכוסה במלואו. לאחר מכן לנתח בזהירות את אטריה וחדרים מתחת למיקרוסקופ.
5. מעבירים את האטריה לצלחת פטרי עם 1.5 מ"ל של חיץ עיכול ואת החדרים לצלחת פטרי אחרת עם 3 מ"ל של חיץ עיכול.
6. דיסקציה פרוזדורית
   1. בזהירות, אך ללא אובדן זמן, פרקו את האטריה לחתיכות זעירות באמצעות מלקחיים קהים.
   2. ממיסים את הרקמה על ידי זינוק זהיר למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה 1,000 μL, אשר נחתך בעבר כדי להרחיב את פתח הקצה.
   3. העבר את התמיסה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסף כמות שווה ערך של חיץ עצירה (1.5 מ"ל) על ידי פיפטציה בזהירות בצד הצינור כדי לסיים את התגובה.
   4. העבירו בזהירות את כל 3 מ"ל תמיסות התא/רקמות דרך רשת ניילון של 200 מיקרומטר כדי להסיר את חתיכות הרקמה הגדולות שנותרו שלא עוכלו במלואן.
      הערה: עיכול מוצלח לא ישאיר כמעט גושים מוצקים.
7. דיסקציה חדרית
   1. חותכים במהירות את רקמת החדר לחתיכות זעירות באמצעות מספריים דיסקציה ופיפטה למעלה ולמטה כדי להתמוסס. השתמש עוד 1,000 μL פיפטה קצה עבור pipeting למעלה ולמטה, זה עשוי להיות מקוצר כדי להרחיב את הפתח.
   2. העבר תמיסת תא/רקמה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסף כמות שווה ערך של חיץ עצירה (3 מ"ל) על ידי פיטיפציה בזהירות בצד הצינור כדי לסיים את התגובה.
   3. העבירו בזהירות את כל 6 מ"ל תמיסת התא/רקמה דרך רשת ניילון של 200 מיקרומטר כדי להסיר חתיכות רקמה גדולות יותר שלא עוכלו במלואן.
      הערה: עיכול מוצלח לא ישאיר כמעט גושים מוצקים.
8. השאירו את שני הצינורות (מתלה תאי פרוזדורים וחדר חדרים) על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 6 דקות כדי להתיישב.
9. צנטריפוגה שני צינורות 15 מ"ל ב 5 x גרם במשך 2 דקות.

4. החזרת סידן

הערה: השלבים הבאים זהים הן עבור תאי פרוזדורים והן עבור תאים חדריים (אלא אם צוין אחרת) ומבוצעים בטמפרטורת החדר.

1. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק ולהשהות בזהירות את הגלולה ב-10 מ"ל של תמיסת טירוד נטולת סידן.
2. השאירו תאים למשך 8 דקות לשיקוע.
3. צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקות (רק תאים פרוזדורים, שקיעה מספיקה עבור תאים חדריים).
4. יש להשליך את כדורי הסופרנאטנט בזהירות ב-10 מ"ל של תמיסת Tyrode עם ריכוז סידן של 100 מיקרומטר.
5. השאירו תאים למשך 8 דקות לשיקוע.
6. צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקות (רק תאים פרוזדורים, שקיעה מספיקה עבור תאים חדריים).
7. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות בזהירות את הגלולה ב-10 מ"ל של תמיסת טירוד עם ריכוז סידן של 400 מיקרומטר.
8. השאירו תאים למשך 8 דקות לשיקוע.
9. צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקות (רק תאים פרוזדורים, שקיעה מספיקה עבור תאים חדריים).
10. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות בזהירות את הגלולה ב-1 מ"ל (פרוזדור) / 5 מ"ל (חדרי) של תמיסת טירוד עם ריכוז סידן של 1 מ"מ.

5. העמסת מיוציטים עם מחוון סידן פלואורסצנטי Fluo-3 AM

הערה: בשל רגישות האור של מחוון הסידן הפלואורסצנטי, יש לבצע את השלבים הבאים מוגנים מפני אור (למשל, על ידי כיסוי צינורות ברדיד אלומיניום).

1. הכן את תמיסת המלאי Fluo-3 AM על ידי הוספת 44 μL של 20% פלורוני F-127 ב- DMSO נטול מים ל- 50 מיקרוגרם של Fluo-3AM (ניתן לאחסן ב- -20 °C מוגן מפני אור).
2. הוסף 10 μL של תמיסת מלאי Fluo-3 AM ל- 1 מ"ל של תרחיף תאים ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
3. צנטריפוגה ב 5 x גרם במשך 1 דקה.
4. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק ולהשהות מחדש את הגלולה בכמות סבירה של תמיסת אמבטיה כדי לקבל ריכוז עבודה טוב (1-5 מ"ל של תמיסת אמבטיה בהתאם לצפיפות התא).
5. השאירו למשך 30 דקות לדה-אסטריפיקציה לפני שתתחילו בניסויים.

6. מדידות ארעיות בו זמנית של מהדק טלאי ואפיפלואורסצנטי Ca²⁺ כמתואר לעיל¹⁶

הערה: מדידות מהדק טלאי אינן נושא מאמר זה, הקורא המעוניין עשוי להיות מופנה לפרסומים גדולים המספקים תיאורים מעמיקים של שיטה זו 17,18,19,20,21,22. עם זאת, להבנה כללית טובה יותר, ניתן סיכום על פרוטוקול למדידת זרמי סידן מסוג L יחד עם מעברי סידן המושרים בזרם.

1. מעבירים מיוציטים לתוך תא התא וסופרפיוז עם תמיסת אמבטיה ב 37 ° C.
2. חסום זרמי אשלגן על-ידי הוספת 4-אמינופירידין ובריום כלורי לתמיסת האמבטיה כמצוין בטבלה 5.
3. ודא שלמיקרואלקטרודות בורוסיליקט יש עמידות חוד של 2-5 MΩ מלא בתמיסת פיפטה (טבלה 6).
4. מדידות התקנה כדי לאפשר הקלטה בו זמנית של אותות חשמליים ואפיפלואורסנציה בו זמנית. מצב מהדק מתח משמש למדידת זרם Ca²+ מסוג L עם פרוטוקול המחזיק את התא ב -80 mV ודופק רמפה של 600 ms עד -40 mV כדי להשבית את זרם Na⁺ המהיר, ואחריו פעימת בדיקה של 100 ms ל +10 mV ב- 0.5 הרץ (איור 2).
5. השתמש בעירור ב 488 ננומטר, נפלט אור ב <520 ננומטר כדי לזהות ולהמיר ל [Ca²⁺] _אני מניח
   
   כאשר k_d = קבוע דיסוציאציה של Fluo-3 (864 nM), F = פלואורסצנטיות פלואורסצנטית; F_max = Ca²⁺ פלואורסצנטיות רוויה המתקבלת בסוף כל ניסוי¹⁹.

תוצאות

תפוקת הבידוד נקבעת לאחר החזרת הסידן על ידי הנחת 10 מיקרוליטר של תרחיף התא על שקופית מיקרוסקופ. יותר מ-100 תאים בני קיימא, בצורת מוט, שאינם מתכווצים/10 μL לבידוד תאים פרוזדוריים ויותר מ-1,000 תאים בני קיימא, בצורת מוט, שאינם מתכווצים/10 μL לבידוד תאים חדריים נחשבים לתנובה מספקת ומתקבלים בדרך כלל באמצ...

Discussion

מאמר זה מספק דרך קלה ופונקציונלית להשיג מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה מאותו עכבר עבור מחקרי מהדק טלאי עם הקלטות סידן חולפות בו זמנית. איכות הנתונים המתקבלים תלויה מאוד באיכות בידוד התא. כפי שהוזכר לעיל, שיטות רבות לבודד קרדיומיוציטים murine תוארו בעבר 9,10,11,12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	31550
27G cannula	Servoprax	L10220
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	A78403
Anhydrous DMSO	Sigma-Aldrich	D12345
Aortic cannula	Radnoti	130163-20
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920
blunt surgical forceps	Kent Scientific	INS650915-4
Bovine Calf Serum	Sigma-Aldrich	12133C
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Circulating heated water bath	Julabo	ME
Collagenase Type II	Worthington	LS994177
disscetion scissors	Kent Scientific	INS600124
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Fluo-3	Invitrogen	F3715
Fluo-3 AM	Invitrogen	F1242
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Guanosine 5′-triphosphate tris salt	Sigma-Aldrich	G9002
Heating coil	Radnoti	158821
Heparin	Ratiopharm	25.000 IE/5ml
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136
induction chamber	CWE incorporated	13-40020
Isoflurane	Cp-pharma	1214
Jacketed heart chamber	Radnoti	130160
KCl	Merck	1049360250
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
MgCl x 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250
MgSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Na2HPO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Nylon mesh (200 µm)	VWR-Germany	510-9527
pasteur pipette	Sigma Aldrich	Z331759
petri-dishes	Thermo Fisher	150318
Pluronic Acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
Roller Pump	Ismatec	ISM597D
surgical forceps	Kent Scientific	INS650908-4
surgical scissors	Kent Scientific	INS700540
suturing silk	Fine Science Tools	NC9416241
syringe	Merck	Z683531-100EA
Taurin	Sigma-Aldrich	86330