Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Zusammenfassung

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Zusammenfassung

Mausmodelle spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung und ermöglichen die Untersuchung von Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese, einschließlich der veränderten Ionenkanalfunktion und des Kalziumhandlings. Zu diesem Zweck sind atriale oder ventrikuläre Kardiomyozyten von hoher Qualität notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen oder Calcium-Handling-Anomalien zu untersuchen. Die begrenzte Ausbeute an qualitativ hochwertigen Kardiomyozyten, die mit den derzeitigen Isolationsprotokollen gewonnen wird, erlaubt jedoch nicht beide Messungen in derselben Maus. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion für die anschließende simultane Messung von Calciumtransienten und L-Typ-Calciumstrom von einem Tier. Mäuseherzen werden gewonnen, und die Aorta wird schnell kanüliert, um Blut zu entfernen. Die Herzen werden dann zunächst mit einer kalziumfreien Lösung (37 °C) perfundiert, um das Gewebe auf der Ebene der interkalierten Bandscheiben zu dissoziieren, und anschließend mit einer Enzymlösung, die wenig Kalzium enthält, um die extrazelluläre Matrix (37 °C) zu stören. Das verdaute Herz wird anschließend in Vorhöfe und Ventrikel zerlegt. Gewebeproben werden in kleine Stücke zerkleinert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aufgelöst. Die enzymatische Verdauung wird gestoppt und die Zellen werden schrittweise wieder in physiologische Kalziumkonzentrationen gebracht. Nach Beladung mit einem fluoreszierenden Ca²⁺-Indikator werden isolierte Kardiomyozyten für die simultane Messung von Calciumströmen und -transienten präpariert. Darüber hinaus werden Isolationsfallstricke diskutiert und Patch-Clamp-Protokolle und repräsentative Spuren von L-Typ-Calciumströmen mit simultanen Calciumtransientenmessungen in atrialen und ventrikulären murinen Myozyten, die wie oben beschrieben isoliert wurden, bereitgestellt.

Einleitung

Herzrhythmusstörungen sind weit verbreitet und eine der größten Herausforderungen im Gesundheitswesen, da sie Millionen von Menschen weltweit betreffen. Herzrhythmusstörungen sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität assoziiert ^1,2 und stellen die zugrunde liegende Ursache für die Mehrzahl der plötzlichen Herztode^{dar 3}. Heutige Behandlungsoptionen haben das Überleben der Patienten verbessert, sind aber immer noch hauptsächlich symptomatische Behandlungen, anstatt auf die zugrunde liegenden Mechanismen abzuzielen. Daher sind diese Behandlungen nur begrenzt wirksam und können häufig schwere Nebenwirkungen verursachen ^4,5,6. Eine Verbesserung der derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten erfordert Einblicke in die zugrunde liegende Pathophysiologie, was die Notwendigkeit geeigneter Modelle für die Untersuchung schafft. Kleintiermodelle - und insbesondere Mausmodelle - spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung, da sie es ermöglichen, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen, z. B. den genetischen Einfluss auf die zelluläre Elektrophysiologie, die Funktion der Ionenkanäle oder den Umgang mit Kalzium ^7,8.

Zu diesem Zweck werden isolierte atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten in ausreichender Menge und Viabilität benötigt. Ein breites Spektrum unterschiedlicher Isolationsansätze zur Gewinnung von atrialen und ventrikulären Myozyten wurde bereits beschrieben 9,10,11,12,13, und einige Gruppen haben Daten aus gleichzeitigen Messungen von L-Typ-Strom und Kalziumstrom-induzierten Kalziumtransienten entweder aus dem Vorhof 14 oder dem Ventrikel ¹⁵ vorgelegt Kardiomyozyten der Maus. Unseres Wissens nach liegen jedoch keine Daten zu Vorhof- und Ventrikelmessungen eines Tieres vor. Die Forscher konzentrieren sich auf eine breite Palette von Themen, die von Elektrophysiologie über Proteomik, funktionelle Studien wie Zellkontraktilität oder Proteininteraktionen, mitochondriale Funktion bis hin zur Genetik reichen – alle benötigen isolierte Kardiomyozyten. Viele der veröffentlichten Protokolle wurden daher nicht speziell für Patch-Clamp-Studien entwickelt, was zu begrenzten Ausbeuten und unzureichender Zellqualität für Patch-Clamp-Studien führt. Daher können simultane Patch-Clamp- und Calcium-Transientenmessungen von Vorhof- und Ventrikelzellen, die aus einem Tier isoliert wurden, mit etablierten Protokollen nicht durchgeführt werden.

Die Isolierung von murinen – insbesondere atrialen – Myozyten für Patch-Clamp-Experimente ist nach wie vor eine Herausforderung. Dieser Artikel stellt eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion vor, die anschließend die gleichzeitige Messung von Nettomembranstrom und strominduzierten Kalziumtransienten von einem Tier ermöglicht. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit genetischen Mutationen ausgearbeitet. Dieses Protokoll kann sowohl für männliche als auch für weibliche Mäuse verwendet werden. Die Myozytenisolierung, die Bilder und die repräsentativen Ergebnisse, die unten beschrieben werden, wurden von Wildtyp-C57Bl/6-Mäusen im Alter von 6 (± 1) Monaten erhalten. Nichtsdestotrotz wurde dieses Protokoll erfolgreich bei Mäusen im Alter von 2 bis 24 Monaten mit unterschiedlichen Genotypen eingesetzt. Abbildung 1 zeigt den Isolationsaufbau und eine Nahaufnahme eines kanülierten Herzens während der Enzymperfusion.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Niedersächsischen Tierprüfungsamt (LAVES, AZ-18/2900) genehmigt und in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für den Tierschutz durchgeführt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie 1 l 10x Perfusionspuffer (Tabelle 1), 500 ml 1x Perfusionspuffer (Tabelle 2), 50 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 3), 10 ml Stopppuffer (Tabelle 4), 1 l Tyrode-Lösung (Tabelle 5), 10 ml jeder Calcium-Stufenlösung (Tyrode-Lösung mit Glukose und entsprechender Menge an Calcium wie angegeben) vor. 1 l 4-AP-Lösung (Tabelle 5), 100 ml Pipettenlösung (Tabelle 6) und 5 ml Pluronsäure gemäß den bereitgestellten Rezepturen.
   HINWEIS: Badlösungen (Tyrode und 4-AP-Lösung) können (ohne Glukose) im Voraus zubereitet und bei +4 °C gelagert werden, Glukose wird am Versuchstag hinzugefügt. Die Pipettenlösung kann bei -20 °C gelagert werden, der Calciumindikator wird am Versuchstag zugegeben und die Lösung dann bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert. 10x Perfusionspuffer kann bei Raumtemperatur gelagert werden, 1x Perfusionspuffer, Verdauungspuffer und Stopppuffer sollten am Versuchstag frisch zubereitet werden.
2. Schalten Sie das Wasserbad und die Rollenpumpe ein.
3. Langendorff-Apparatur mit Perfusionspuffer vorfüllen; Stellen Sie sicher, dass es luftfrei ist.
4. Bereiten Sie die Aortenkanüle vor, indem Sie sie unter dem Präpariermikroskop fixieren, mit einer 1-ml-Spritze verbinden, die mit Perfusionspuffer gefüllt ist, und reinigen Sie die Kanüle, indem Sie die Kanüle ausspülen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, jegliche Luft im Perfusionssystem zu vermeiden, da dies die koronare Perfusion und damit die Verdauungseffektivität direkt beeinflusst. Bei Bedarf kann dem Setup eine Blasenfalle hinzugefügt werden, um Lufteinschlüsse sicher zu vermeiden.
5. Bereiten Sie Petrischalen mit ausreichend Perfusionspuffer für die Organentnahme und die Mikroskopie vor (Puffer sollte das gesamte Organ sicher bedecken, einige Milliliter – je nach verwendeter Petrischalegröße – sollten ausreichen).
6. Bereiten Sie 3 Petrischalen mit Verdauungspuffer für die Gewebedissoziation und Mikroskopie vor, der Puffer sollte das Organ für die Präparation unter dem Mikroskop in der jeweiligen Petrischale bedecken, die Menge hängt von der verwendeten Petrischalegröße ab. Für die Dissoziation verwenden Sie 3 ml für ventrikuläres Gewebe und 1,5 ml für Vorhofgewebe.

2. Organentnahme

1. Injizieren Sie der Maus 0,1 ml Heparin (1.000 U/ml) i.p. mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27-g-Kanüle und warten Sie 5-10 Minuten.
2. Legen Sie die Maus zusammen mit einem kleinen Gewebe, das mit ca. 500 μl Isofluran getränkt ist, in eine Induktionskammer. Das Tier sollte nicht mit dem Gewebe in Berührung kommen. Um dies zu vermeiden, kann man eine Biopsie-Einbettungskassette aus Kunststoff verwenden, um das Gewebe abzudecken. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, überprüfen Sie den Zehenquetschreflex und sobald er nicht mehr vorhanden ist, schläfern Sie die Maus schnell durch Zervixluxation ein.
3. Legen Sie die Maus auf eine Plattform auf dem Rücken (z. B. auf Styropor, das mit einem Papiertuch bedeckt ist) und fixieren Sie die Pfoten mit Kanülen, um sie an Ort und Stelle zu halten.
4. Entfernen Sie das Fell und die Haut, die die Brust und einen Teil des Bauches bedecken, mit einem deutlichen Schnitt vom Jugulum in Richtung Symphyse und öffnen Sie den Bauch direkt unter dem Xipoid, ohne eine Organstruktur mit einer Schere zu verletzen. Heben Sie das Brustbein mit einer chirurgischen Zange an und schneiden Sie das Zwerchfell mit einer Schere entlang der Rippenkante durch, schneiden Sie dann die Rippen in der medialen Achsellinie ab und entfernen Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
5. Entfernen Sie den Herzbeutel vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette und entfernen Sie das Herz schnell, indem Sie es mit einer stumpfen Pinzette von unten anheben und die großen Gefäße mit einem einzigen Schnitt mit einer Schere durchtrennen.
6. Geben Sie das Herz in einen Perfusionspuffer bei Raumtemperatur und kanülieren Sie die Aorta mit einer stumpfen Endnadel so schnell wie möglich unter dem Mikroskop.
   Anmerkungen: Entfernen Sie jegliches Lungengewebe und Fettgewebe, das mit dem Organ verbunden ist, ohne zu viel Zeit damit zu verlieren. Achten Sie bei der Kanülierung darauf, dass das Ende der Nadel nicht durch die Aortenklappe ragt, da dies die Ergebnisse beeinträchtigt, da Puffer nicht in die Koronararterien gelangen.
7. Binden Sie das Herz mit einem Stück Nahtseide fest an die Nadel und trennen Sie es von der Spritze.
   HINWEIS: Der gesamte Vorgang von der Gewinnung des Herzens (dem Moment, in dem die großen Gefäße durchtrennt werden) bis zum Nähen der Aorta an die Nadel sollte so wenig Zeit wie möglich in Anspruch nehmen. Es wird empfohlen, von der Entfernung des Herzens bis zum Beginn der Perfusion nicht länger als 90-180 s zu dauern.

3. Enzymatische Verdauung

1. Nach der Aortenkanülierung wird das kanülierte Herz sofort an den Langendorff-Apparat angeschlossen, um das Eindringen von Luft in das System zu vermeiden.
   Anmerkungen: Es kann hilfreich sein, einen hängenden Tropfen Perfusionspuffer an der Unterseite der Langendorff-Apparatur sowie einen Tropfen Perfusionspuffer auf der Oberseite der Nadel zu haben, um zu verhindern, dass Luft in das System eindringt.
2. Perfundieren Sie das Herz 1 min lang mit Perfusionspuffer bei einer Temperatur von exakt 37 °C und einer Perfusionsrate von exakt 4 mL/min.
   HINWEIS: Um eine Temperatur von 37 °C an der Spitze der Perfusionsnadel zu erreichen, muss die Wasserbadtemperatur leicht über ca. 40 °C eingestellt werden. Dies sollte regelmäßig durch Messung der Temperatur an der Perfusionsspitze überprüft werden.
3. Perfusion auf Aufschlusspuffer umschalten und für exakt 9 min bei einer Temperatur von exakt 37 °C und einer Perfusionsrate von exakt 4 mL/min perfundieren.
4. Übertragen Sie das verdaute Herz in eine Petrischale mit genügend Verdauungspuffer, um es vollständig bedeckt zu halten. Anschließend werden die Vorhöfe und Herzkammern unter dem Mikroskop sorgfältig präpariert.
5. Übertragen Sie die Vorhöfe in eine Petrischale mit 1,5 ml Verdauungspuffer und die Ventrikel in eine andere Petrischale mit 3 ml Verdauungspuffer.
6. Vorhofdissektion
   1. Ziehen Sie die Vorhöfe vorsichtig, aber ohne Zeitverlust mit einer stumpfen Pinzette in winzige Stücke auseinander.
   2. Lösen Sie das Gewebe auf, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, die zuvor geschnitten wurde, um die Spitzenöffnung zu erweitern, vorsichtig auf und ab pipettieren.
   3. Übertragen Sie die Lösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer (1,5 ml) hinzu, indem Sie vorsichtig an der Seite des Röhrchens nach unten pipettieren, um die Reaktion zu beenden.
   4. Führen Sie alle 3 ml Zell-/Gewebelösungen vorsichtig durch ein 200 μm Nylonnetz, um verbleibende größere Gewebestücke zu entfernen, die nicht vollständig verdaut wurden.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Verdauung hinterlässt fast keine festen Brocken.
7. Ventrikuläre Dissektion
   1. Hacken Sie das Ventrikelgewebe schnell mit einer Sezierschere in winzige Stücke und pipettieren Sie es auf und ab, um es aufzulösen. Verwenden Sie eine weitere 1.000-μl-Pipettenspitze zum Auf- und Abpipettieren, sie kann gekürzt werden, um die Öffnung zu erweitern.
   2. Übertragen Sie die Zell-/Gewebelösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer (3 ml) hinzu, indem Sie vorsichtig an der Seite des Röhrchens nach unten pipettieren, um die Reaktion zu beenden.
   3. Führen Sie alle 6 ml Zell-/Gewebelösung vorsichtig durch ein 200 μm Nylonnetz, um größere Gewebestücke zu entfernen, die noch nicht vollständig verdaut sind.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Verdauung hinterlässt fast keine festen Brocken.
8. Lassen Sie beide Röhrchen (Vorhof- und Ventrikelzellsuspension) 6 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank, damit sie sich absetzen können.
9. Zentrifugieren Sie beide 15-ml-Röhrchen bei 5 x g für 2 min.

4. Wiedereinführung von Kalzium

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind sowohl für Vorhof- als auch für Ventrikelzellen identisch (sofern nicht anders angegeben) und werden bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml kalziumfreier Tyrode-Lösung.
2. Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.
3. Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).
4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 100 μM.
5. Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.
6. Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).
7. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 400 μM.
8. Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.
9. Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).
10. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml (atrial)/5 ml (ventrikulär) Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 1 mM.

5. Beladung von Myozyten mit fluoreszierendem Calcium-Indikator Fluo-3 AM

HINWEIS: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Calciumindikators sollten die folgenden Schritte lichtgeschützt durchgeführt werden (z.B. durch Abdecken der Röhrchen mit Aluminiumfolie).

1. Bereiten Sie die Fluo-3 AM-Stammlösung vor, indem Sie 44 μl 20 % pluronisches F-127 in wasserfreiem DMSO zu 50 μg Fluo-3AM hinzufügen (kann bei -20 °C lichtgeschützt gelagert werden).
2. 10 μl Fluo-3 AM-Stammlösung zu 1 ml Zellsuspension geben und 10 min bei lichtgeschützter Raumtemperatur inkubieren.
3. Bei 5 x g 1 min zentrifugieren.
4. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie das Pellet in einer angemessenen Menge Badlösung, um eine gute Arbeitskonzentration zu erzielen (1-5 ml Badlösung, je nach Zelldichte).
5. 30 Minuten zur Entesterung einwirken lassen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.

6. Simultane Patch-Clamp- und epifluoreszierende^Ca2+-Transientenmessungen wie zuvor beschrieben¹⁶

HINWEIS: Patch-Clamp-Messungen sind nicht das Thema dieses Artikels, der interessierte Leser kann auf wichtige Publikationen verwiesen werden, die diese Methode ausführlich beschreiben 17,18,19,20,21,22. Nichtsdestotrotz wird zum besseren Gesamtverständnis eine Zusammenfassung eines Protokolls zur Messung von L-Typ-Kalziumströmen zusammen mit strominduzierten Kalziumtransienten bereitgestellt.

1. Die Myozyten werden in eine Zellkammer überführt und mit einer Badelösung bei 37 °C überflossen.
2. Blockieren Sie Kaliumströme, indem Sie der Badelösung 4-Aminopyridin und Bariumchlorid hinzufügen, wie in Tabelle 5 angegeben.
3. Stellen Sie sicher, dass Borosilikat-Mikroelektroden einen Spitzenwiderstand von 2-5 MΩ aufweisen, die mit Pipettenlösung gefüllt sind (Tabelle 6).
4. Setup-Messungen, um die gleichzeitige Aufzeichnung von elektrischen Signalen und Epifluoreszenz zu ermöglichen. Der Voltage-Clamp-Modus wird verwendet, um den L-Typ Ca²+-Strom mit einem Protokoll zu messen, das die Zelle bei -80 mV hält, und einem 600 ms Rampenimpuls auf -40 mV, um den schnellen Na⁺-Strom zu inaktivieren, gefolgt von einem 100 ms Testimpuls auf +10 mV bei 0,5 Hz (Abbildung 2).
5. Verwenden Sie Anregung bei 488 nm, emittiertes Licht bei <520 nm, um es zu detektieren und in [Ca²⁺]_I umzuwandeln, unter der Annahme, dass
   
   Dabei ist k_d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz; Fmax = Ca²⁺-gesättigte Fluoreszenz, die am Ende jedes Experiments¹⁹ erhalten wurde.

Ergebnisse

Die Isolationsausbeute wird nach der Wiedereinführung von Calcium bestimmt, indem 10 μl Zellsuspension auf einen Objektträger pipettiert werden. Mehr als 100 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung von Vorhofzellen und mehr als 1.000 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung ventrikulärer Zellen gelten als ausreichende Ausbeute und werden üblicherweise mit diesem Protokoll gewonnen. Vorhofzellen, die mit diesem Protokoll ...

Diskussion

Dieser Artikel bietet eine einfache und funktionelle Möglichkeit, qualitativ hochwertige atriale und ventrikuläre Myozyten von derselben Maus für Patch-Clamp-Studien mit gleichzeitigen transienten Kalziumableitungen zu erhalten. Die Qualität der gewonnenen Daten hängt stark von der Qualität der Zellisolierung ab. Wie oben erwähnt, wurden bereits viele Verfahren zur Isolierung von murinen Kardiomyozyten beschrieben 9,10,11,12.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	31550
27G cannula	Servoprax	L10220
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	A78403
Anhydrous DMSO	Sigma-Aldrich	D12345
Aortic cannula	Radnoti	130163-20
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920
blunt surgical forceps	Kent Scientific	INS650915-4
Bovine Calf Serum	Sigma-Aldrich	12133C
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Circulating heated water bath	Julabo	ME
Collagenase Type II	Worthington	LS994177
disscetion scissors	Kent Scientific	INS600124
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Fluo-3	Invitrogen	F3715
Fluo-3 AM	Invitrogen	F1242
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Guanosine 5′-triphosphate tris salt	Sigma-Aldrich	G9002
Heating coil	Radnoti	158821
Heparin	Ratiopharm	25.000 IE/5ml
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136
induction chamber	CWE incorporated	13-40020
Isoflurane	Cp-pharma	1214
Jacketed heart chamber	Radnoti	130160
KCl	Merck	1049360250
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
MgCl x 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250
MgSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Na2HPO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Nylon mesh (200 µm)	VWR-Germany	510-9527
pasteur pipette	Sigma Aldrich	Z331759
petri-dishes	Thermo Fisher	150318
Pluronic Acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
Roller Pump	Ismatec	ISM597D
surgical forceps	Kent Scientific	INS650908-4
surgical scissors	Kent Scientific	INS700540
suturing silk	Fine Science Tools	NC9416241
syringe	Merck	Z683531-100EA
Taurin	Sigma-Aldrich	86330