Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Resumo

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Resumo

Modelos de camundongos desempenham um papel crucial na pesquisa de arritmias e permitem estudar mecanismos-chave da arritmogênese, incluindo função alterada do canal iônico e manipulação de cálcio. Para isso, cardiomiócitos atriais ou ventriculares de alta qualidade são necessários para realizar medidas de patch-clamp ou explorar anormalidades no manuseio do cálcio. No entanto, o rendimento limitado de cardiomiócitos de alta qualidade obtido pelos protocolos de isolamento atuais não permite ambas as medidas no mesmo camundongo. Este artigo descreve um método para isolar miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, para subsequentes medições simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L de um animal. Corações de camundongos são obtidos, e a aorta é rapidamente canulada para remover o sangue. Os corações são então inicialmente perfundidos com uma solução isenta de cálcio (37 °C) para dissociar o tecido ao nível dos discos intercalados e, posteriormente, com uma solução enzimática contendo pouco cálcio para romper a matriz extracelular (37 °C). O coração digerido é posteriormente dissecado em átrios e ventrículos. As amostras de tecido são picadas em pequenos pedaços e dissolvidas por pipetagem cuidadosa para cima e para baixo. A digestão enzimática é interrompida e as células são gradualmente reintroduzidas nas concentrações fisiológicas de cálcio. Após o carregamento com um indicador fluorescente de Ca²⁺, os cardiomiócitos isolados são preparados para a medição simultânea de correntes de cálcio e transientes. Além disso, armadilhas de isolamento são discutidas e protocolos de patch-clamp e traços representativos de correntes de cálcio do tipo L com medidas simultâneas de transientes de cálcio em miócitos murinos atriais e ventriculares isolados como descrito acima são fornecidos.

Introdução

As arritmias cardíacas são comuns e um dos grandes desafios atuais para a saúde, uma vez que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. As arritmias estão associadas a alta morbidade e mortalidade ^1,2 e representam a causa básica da maioria das mortes súbitas cardíacas³. As opções de tratamento atualizadas melhoraram a sobrevida do paciente, mas ainda são principalmente tratamentos sintomáticos em vez de visar os mecanismos subjacentes. Assim, esses tratamentos têm eficácia limitada e podem frequentemente causar efeitos colaterais graves ^4,5,6. Uma melhoria das opções de tratamento atuais requer informações sobre a fisiopatologia subjacente, criando a necessidade de modelos adequados para estudo. Modelos de pequenos animais - e especificamente modelos de camundongos - desempenham um papel crucial na pesquisa de arritmias, pois permitem estudar mecanismos-chave da arritmogênese, por exemplo, o impacto genético na eletrofisiologia celular, na função dos canais iônicos ou no manuseio do cálcio ^7,8.

Para isso, são necessários cardiomiócitos atriais e ventriculares isolados em quantidade e viabilidade suficientes. Um amplo espectro de diferentes abordagens de isolamento para obtenção de miócitos atriais e ventriculares foi previamente descrito9,10,11,12,13 e alguns grupos apresentaram dados de medidas simultâneas de transientes de cálcio induzidos pela corrente L e pela corrente de cálcio do átrio ¹⁴ ou ventricular15 cardiomiócitos murinos. No entanto, até onde sabemos, não há dados disponíveis de medidas atriais e ventriculares de um animal. Os pesquisadores se concentram em uma ampla variedade de tópicos que vão desde eletrofisiologia até proteômica, estudos funcionais como contratilidade celular ou interações proteicas, função mitocondrial ou genética – todos precisando de cardiomiócitos isolados. Muitos dos protocolos publicados, portanto, não foram desenvolvidos especificamente para estudos de patch clamp, levando a rendimentos limitados e qualidade celular insuficiente para estudos de patch clamp. Assim, medidas simultâneas de patch clamp e transiente de cálcio de células atriais e ventriculares isoladas de um animal não podem ser realizadas com protocolos estabelecidos.

O isolamento de miócitos murinos – especialmente atriais – para experimentos de patch clamp permanece desafiador. Este artigo fornece um método simples e rápido para o isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que subsequentemente permite medições simultâneas de transientes de cálcio induzidos pela corrente líquida e corrente de um animal. Este artigo elabora um protocolo para o isolamento de miócitos atriais e ventriculares derivados de camundongos selvagens e portadores de mutações genéticas. Este protocolo pode ser usado para camundongos machos e fêmeas. O isolamento de miócitos, as imagens e os resultados representativos descritos abaixo foram obtidos de camundongos selvagens C57Bl/6 com idade de 6 (± 1) meses. No entanto, este protocolo tem sido utilizado com sucesso em camundongos em várias idades variando de 2 a 24 meses com diferentes genótipos. A Figura 1 mostra o arranjo de isolamento e o close-up de um coração canulado durante a perfusão enzimática.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Lower Saxony Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) e conduzidos de acordo com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais de bem-estar animal.

1. Pré-arranjos

1. Preparar 1 L de tampão de perfusão 10x (Tabela 1), 500 mL de tampão de perfusão 1x (Tabela 2), 50 mL de tampão de digestão (Tabela 3), 10 mL de tampão de parada (Tabela 4), 1 L de solução de Tyrode (Tabela 5), 10 mL de cada solução de etapa de cálcio (solução de Tyrode com glicose e respectiva quantidade de cálcio, conforme indicado), 1 L de solução de 4-AP (Tabela 5), 100 mL de solução de pipeta (Tabela 6) e 5 mL de ácido plurônico de acordo com as receitas fornecidas.
   NOTA: As soluções de banho (Tyrode e solução 4-AP) podem ser preparadas (sem glicose) com antecedência e armazenadas a +4 °C, a glicose é adicionada no dia do experimento. A solução de pipeta pode ser armazenada a -20 °C, o indicador de cálcio é adicionado no dia experimental e a solução então armazenada em gelo até uso posterior. 10x tampão de perfusão pode ser armazenado à temperatura ambiente, 1x tampão de perfusão, tampão de digestão e tampão de parada devem ser preparados na hora no dia experimental.
2. Ligue o banho-maria e a bomba de roletes.
3. Aparelho de Langendorff pré-preenchido com tampão de perfusão; Certifique-se de que está livre de ar.
4. Preparar a cânula aórtica fixando-a sob o microscópio de dissecção, conectar com uma seringa de 1 mL preenchida com tampão de perfusão e ar puro enxaguando a cânula.
   OBS: É fundamental evitar qualquer ar dentro do sistema de perfusão, pois isso afetará diretamente a perfusão coronariana e, consequentemente, a eficácia da digestão. Uma armadilha de bolhas pode ser adicionada à configuração, se necessário, para evitar com segurança qualquer aprisionamento de ar.
5. Prepare placas de Petri com tampão de perfusão suficiente para coleta de órgãos e microscopia (o tampão deve cobrir com segurança todo o órgão, alguns mililitros – dependendo do tamanho da placa de Petri usada – devem ser suficientes).
6. Preparar 3 placas de Petri com tampão de digestão para dissociação tecidual e microscopia, tampão deve cobrir o órgão para dissecção sob o microscópio dentro da respectiva placa de Petri, quantidade depende do tamanho da placa de Petri utilizada. Para a dissociação utilizar 3 mL para tecido ventricular e 1,5 mL para tecido atrial.

2. Captação de órgãos

1. Injetar 0,1 mL de heparina (1.000 U/mL) i.p. em camundongo usando uma seringa de 1 mL com cânula de 27 G e aguardar 5-10 min.
2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução junto com um pequeno tecido embebido em aproximadamente 500 μL de isoflurano. O animal não deve estar em contato com o tecido. Para evitar isso, pode-se usar um de plástico embutido em biópsia para cobrir o tecido. Uma vez que o animal esteja totalmente anestesiado, verifique se há reflexo de pinça do dedo do pé e, assim que ele não estiver mais presente, eutanasie rapidamente o camundongo por deslocamento cervical.
3. Coloque o mouse em uma plataforma nas costas (por exemplo, em isopor coberto com um papel toalha) e fixe as patas com cânulas para mantê-lo no lugar.
4. Remova o pelo e a pele que cobre o tórax e parte do abdômen com um corte claro da jugúgula em direção à sínfise e abra o abdome logo abaixo do xifoide sem ferir qualquer estrutura do órgão usando uma tesoura. Levante o esterno com pinça cirúrgica e corte o diafragma com tesoura ao longo da borda das costelas, depois corte as costelas na linha axilar medial e remova a caixa torácica para expor o coração.
5. Remova cuidadosamente o pericárdio usando pinça romba e remova rapidamente o coração, levantando-o com pinça romba por baixo e cortando os grandes vasos com um único corte usando tesoura.
6. Coloque o coração em tampão de perfusão à temperatura ambiente e canule a aorta com uma agulha romba sob o microscópio o mais rápido possível.
   NOTA: Remova qualquer tecido pulmonar e tecido adiposo ligado ao órgão sem perder muito tempo nele. Ao canular, certifique-se de que a extremidade da agulha não se estenda através da válvula aórtica, pois isso prejudicará os resultados, impedindo que os tampões entrem nas artérias coronárias.
7. Amarre o coração com um pedaço de seda de sutura firmemente à agulha e desconecte da seringa.
   NOTA: Todo o procedimento desde a obtenção do coração (momento em que os grandes vasos são cortados) até a sutura da aorta à agulha deve levar o menor tempo possível. Recomenda-se não demorar mais do que 90-180 s da remoção do coração até o início da perfusão.

3. Digestão enzimática

1. Após a canulação da aorta, conectar imediatamente o coração canulado ao aparelho de Langendorff, evitando a entrada de ar no sistema.
   NOTA: Pode ajudar a ter uma gota pendurada de tampão de perfusão na parte inferior do aparelho de Langendorff, bem como uma gota de tampão de perfusão na parte superior da agulha, a fim de evitar a entrada de ar no sistema.
2. Perfundir o coração com tampão de perfusão por 1 min a uma temperatura de exatamente 37 °C e uma taxa de perfusão de exatamente 4 mL/min.
   NOTA: Para que a temperatura seja de 37 °C na ponta da agulha de perfusão, a temperatura em banho-maria deve ser ligeiramente superior a aproximadamente 40 °C. Isso deve ser testado regularmente, medindo a temperatura na ponta de perfusão.
3. Alternar a perfusão para o tampão de digestão e perfundir por exatamente 9 min a uma temperatura de exatamente 37 °C e uma taxa de perfusão de exatamente 4 mL/min.
4. Transfira o coração digerido para uma placa de Petri com tampão de digestão suficiente para mantê-lo totalmente coberto. Em seguida, disseque cuidadosamente os átrios e ventrículos sob o microscópio.
5. Transfira os átrios para uma placa de Petri com 1,5 mL de tampão de digestão e os ventrículos para outra placa de Petri com 3 mL de tampão de digestão.
6. Dissecção atrial
   1. Com cuidado, mas sem perda de tempo, afaste os átrios em pequenos pedaços usando pinças rombas.
   2. Dissolva o tecido pipetando cuidadosamente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL, que foi previamente cortada para ampliar a abertura da ponta.
   3. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 ml e adicione uma quantidade equivalente de tampão de paragem (1,5 ml) pipetando cuidadosamente para baixo na lateral do tubo para terminar a reacção.
   4. Passe cuidadosamente todos os 3 mL de soluções celulares/teciduais através de uma malha de nylon de 200 μm para remover pedaços de tecido maiores remanescentes que não foram totalmente digeridos.
      NOTA: Uma digestão bem-sucedida não deixará quase nenhum pedaço sólido.
7. Dissecção ventricular
   1. Pique rapidamente o tecido ventricular em pequenos pedaços usando tesoura de dissecção e pipeta para cima e para baixo para dissolver. Use outra ponta de pipeta de 1.000 μL para pipetar para cima e para baixo, ela pode ser encurtada para ampliar a abertura.
   2. Transfira célula/solução de tecido para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione uma quantidade equivalente de tampão de parada (3 mL) pipetando cuidadosamente para baixo na lateral do tubo para encerrar a reação.
   3. Passe cuidadosamente todos os 6 mL de célula/solução de tecido através de uma malha de nylon de 200 μm para remover pedaços de tecido maiores que não foram totalmente digeridos.
      NOTA: Uma digestão bem-sucedida não deixará quase nenhum pedaço sólido.
8. Deixar ambos os tubos (suspensão de células atriais e ventriculares) no banco à temperatura ambiente por 6 min para assentar.
9. Centrifugar ambos os tubos de 15 mL a 5 x g por 2 min.

4. Reintrodução do cálcio

NOTA: Os passos seguintes são idênticos para as células atriais e ventriculares (salvo indicação em contrário) e são realizados à temperatura ambiente.

1. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta plástica de Pasteur e ressuspender cuidadosamente o pellet em 10 ml de solução de Tyrode sem cálcio.
2. Deixar as células por 8 min para sedimentação.
3. Centrifugar a 5 x g por 1 min (apenas células atriais, a sedimentação é suficiente para as células ventriculares).
4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet em 10 ml de solução de Tyrode com concentração de cálcio de 100 μM.
5. Deixar as células por 8 min para sedimentação.
6. Centrifugar a 5 x g por 1 min (apenas células atriais, a sedimentação é suficiente para as células ventriculares).
7. Eliminar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet em 10 ml de solução de Tyrode com concentração de cálcio de 400 μM.
8. Deixar as células por 8 min para sedimentação.
9. Centrifugar a 5 x g por 1 min (apenas células atriais, a sedimentação é suficiente para as células ventriculares).
10. Eliminar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet em 1 ml (atrial)/ 5 ml (ventricular) de solução de Tyrode com concentração de cálcio a 1 mM.

5. Carga de miócitos com indicador de cálcio fluorescente Fluo-3 AM

NOTA: Devido à sensibilidade à luz do indicador de cálcio fluorescente, as seguintes etapas devem ser executadas protegidas da luz (por exemplo, cobrindo tubos com folha de alumínio).

1. Preparar a solução-mãe de Fluo-3 AM adicionando 44 μL de F-127 plurónico a 20% em DMSO anidro a 50 μg de Fluo-3AM (pode ser armazenado a -20 °C protegido da luz).
2. Adicionar 10 μL de solução-mãe de Fluo-3 AM a 1 ml de suspensão celular e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente protegida da luz.
3. Centrifugar a 5 x g por 1 min.
4. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta plástica de Pasteur e ressuspenda o pellet em uma quantidade razoável de solução de banho para obter uma boa concentração de trabalho (1-5 mL de solução de banho, dependendo da densidade celular).
5. Deixe por 30 min para desesterificação antes de iniciar os experimentos.

6. Medidas simultâneas de patch-clamp e Ca²⁺ transiente epifluorescente, conforme descrito anteriormente¹⁶

OBS: Medidas de patch clamp não são o tema deste artigo, o leitor interessado pode ser encaminhado para as principais publicações que fornecem descrições detalhadas deste método 17,18,19,20,21,22. No entanto, para uma melhor compreensão geral, um resumo sobre um protocolo para medir correntes de cálcio do tipo L juntamente com transientes de cálcio induzidos pela corrente é fornecido.

1. Transferir miócitos para uma câmara celular e superfundir-se com solução de banho a 37 °C.
2. Bloquear as correntes de potássio adicionando 4-aminopiridina e cloreto de bário à solução de banho, conforme indicado na Tabela 5.
3. Certifique-se de que os microeletrodos de borossilicato tenham uma resistência de ponta de 2-5 MΩ preenchidos com solução de pipeta (Tabela 6).
4. Configure medições para permitir a gravação simultânea de sinais elétricos e epifluorescência ao mesmo tempo. O modo de fixação de tensão é usado para medir a corrente Ca²+ tipo L com um protocolo que mantém a célula em -80 mV e um pulso de rampa de 600 ms a -40 mV para inativar a corrente rápida de Na⁺, seguido por um pulso de teste de 100 ms a +10 mV a 0,5 Hz (Figura 2).
5. Use excitação a 488 nm, luz emitida a <520 nm para detectar e converter para [Ca²⁺]_I supondo
   
   Onde k_d = constante de dissociação de fluorescência de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescência de Fluo-3; F_max = fluorescência saturada de Ca²⁺ obtida ao final de cada experimento¹⁹.

Resultados

O rendimento do isolamento é determinado após a reintrodução de cálcio por pipetagem de 10 μL de suspensão celular em uma lâmina de microscópio. Mais de 100 células viáveis, em forma de bastonete, sem contração/10 μL para isolamento de células atriais, e mais de 1.000 células viáveis, em forma de bastonete, não contraídas/10 μL para isolamento de células ventriculares são consideradas como rendimento suficiente e são comumente obtidas usando este protocolo. As células atriais obtidas com este prot...

Discussão

Este artigo fornece uma maneira fácil e funcional de obter miócitos atriais e ventriculares de alta qualidade do mesmo camundongo para estudos de patch-clamp com registros simultâneos de transientes de cálcio. A qualidade dos dados obtidos depende muito da qualidade do isolamento celular. Como mencionado acima, vários métodos para isolar cardiomiócitos murinos foram descritos previamente9,10,11,12.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	31550
27G cannula	Servoprax	L10220
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	A78403
Anhydrous DMSO	Sigma-Aldrich	D12345
Aortic cannula	Radnoti	130163-20
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920
blunt surgical forceps	Kent Scientific	INS650915-4
Bovine Calf Serum	Sigma-Aldrich	12133C
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Circulating heated water bath	Julabo	ME
Collagenase Type II	Worthington	LS994177
disscetion scissors	Kent Scientific	INS600124
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Fluo-3	Invitrogen	F3715
Fluo-3 AM	Invitrogen	F1242
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Guanosine 5′-triphosphate tris salt	Sigma-Aldrich	G9002
Heating coil	Radnoti	158821
Heparin	Ratiopharm	25.000 IE/5ml
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136
induction chamber	CWE incorporated	13-40020
Isoflurane	Cp-pharma	1214
Jacketed heart chamber	Radnoti	130160
KCl	Merck	1049360250
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
MgCl x 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250
MgSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Na2HPO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Nylon mesh (200 µm)	VWR-Germany	510-9527
pasteur pipette	Sigma Aldrich	Z331759
petri-dishes	Thermo Fisher	150318
Pluronic Acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
Roller Pump	Ismatec	ISM597D
surgical forceps	Kent Scientific	INS650908-4
surgical scissors	Kent Scientific	INS700540
suturing silk	Fine Science Tools	NC9416241
syringe	Merck	Z683531-100EA
Taurin	Sigma-Aldrich	86330