Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Riepilogo

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Abstract

I modelli murini svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull'aritmia e consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi, tra cui l'alterata funzione dei canali ionici e la manipolazione del calcio. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti atriali o ventricolari di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp o per esplorare anomalie di manipolazione del calcio. Tuttavia, la resa limitata di cardiomiociti di alta qualità ottenuti dagli attuali protocolli di isolamento non consente entrambe le misurazioni nello stesso topo. Questo articolo descrive un metodo per isolare miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, per successive misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L da un animale. Si ottengono cuori di topo e l'aorta viene rapidamente incannulata per rimuovere il sangue. I cuori vengono quindi inizialmente perfusi con una soluzione priva di calcio (37 °C) per dissociare il tessuto a livello dei dischi intercalati e successivamente con una soluzione enzimatica contenente poco calcio per distruggere la matrice extracellulare (37 °C). Il cuore digerito viene successivamente sezionato in atri e ventricoli. I campioni di tessuto vengono tagliati in piccoli pezzi e sciolti mediante pipettaggio accurato su e giù. La digestione enzimatica viene interrotta e le cellule vengono gradualmente reintrodotte alle concentrazioni fisiologiche di calcio. Dopo il caricamento con un indicatore fluorescente Ca²⁺, i cardiomiociti isolati vengono preparati per la misurazione simultanea di correnti di calcio e transitori. Inoltre, vengono discusse le insidie dell'isolamento e vengono forniti protocolli patch-clamp e tracce rappresentative di correnti di calcio di tipo L con misurazioni simultanee dei transitori di calcio in miociti murini atriali e ventricolari isolati come descritto sopra.

Introduzione

Le aritmie cardiache sono comuni e rappresentano una delle principali sfide sanitarie attuali poiché colpiscono milioni di persone in tutto il mondo. Le aritmie sono associate ad elevata morbilità e mortalità ^1,2 e rappresentano la causa sottostante della maggior parte delle morti cardiache improvvise³. Le opzioni di trattamento aggiornate hanno migliorato la sopravvivenza dei pazienti, ma sono ancora principalmente trattamenti sintomatici piuttosto che mirati ai meccanismi sottostanti. Pertanto, questi trattamenti hanno un'efficacia limitata e possono spesso causare gravi effetti collaterali ^4,5,6. Un miglioramento delle attuali opzioni di trattamento richiede una comprensione della fisiopatologia sottostante, creando la necessità di modelli adatti da studiare. I piccoli modelli animali - e in particolare i modelli murini - svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull'aritmia in quanto consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi, ad esempio l'impatto genetico sull'elettrofisiologia cellulare, la funzione dei canali ionici o la manipolazione del calcio ^7,8.

A tale scopo sono necessari cardiomiociti atriali e ventricolari isolati di quantità e vitalità sufficienti. Un ampio spettro di diversi approcci di isolamento per ottenere miociti atriali e ventricolari è stato precedentemente descritto 9,10,11,12,13 e alcuni gruppi hanno presentato dati da misurazioni simultanee di transitori di calcio indotti da corrente di tipo L e transitori di calcio indotti da corrente atriale 14 o ventricolare ¹⁵ cardiomiociti murini. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, non sono disponibili dati sulle misurazioni atriali e ventricolari di un animale. I ricercatori si concentrano su un'ampia varietà di argomenti che vanno dall'elettrofisiologia alla proteomica, studi funzionali come contrattilità cellulare o interazioni proteiche, funzione mitocondriale o genetica - tutti che necessitano di cardiomiociti isolati. Molti dei protocolli pubblicati non sono stati quindi sviluppati specificamente per gli studi sui patch morb, portando a rese limitate e qualità delle celle insufficiente per gli studi sui patch morb. Pertanto, le misurazioni simultanee di patch clamp e transitori di calcio di cellule atriali e ventricolari isolate da un animale non possono essere eseguite con protocolli stabiliti.

L'isolamento dei miociti murini, specialmente atriali, per gli esperimenti di patch clamp rimane impegnativo. Questo articolo fornisce un metodo semplice e veloce per l'isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, che consente successivamente misurazioni simultanee sia della corrente netta di membrana che dei transitori di calcio indotti dalla corrente da un animale. Questo articolo elabora un protocollo per l'isolamento di miociti atriali e ventricolari derivati da topi wild type e topi portatori di mutazioni genetiche. Questo protocollo può essere utilizzato sia per i topi maschi che per le femmine. L'isolamento dei miociti, le immagini e i risultati rappresentativi descritti di seguito sono stati ottenuti da topi selvatici tipo C57Bl/6 all'età di 6 (± 1) mesi. Tuttavia, questo protocollo è stato utilizzato con successo per topi di varie età che vanno da 2 a 24 mesi con genotipi diversi. La Figura 1 mostra la configurazione dell'isolamento e un primo piano di un cuore cannulato durante la perfusione enzimatica.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Lower Saxony Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) e sono state condotte in conformità con tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere degli animali.

1. Predisposizioni

1. Preparare 1 L di tampone di perfusione 10x (Tabella 1), 500 mL di tampone di perfusione 1x (Tabella 2), 50 mL di tampone di digestione (Tabella 3), 10 mL di tampone di arresto (Tabella 4), 1 L di soluzione di Tyrode (Tabella 5), 10 mL di ciascuna soluzione di fase di calcio (Soluzione di Tyrode con glucosio e la rispettiva quantità di calcio come indicato), 1 L di soluzione 4-AP (Tabella 5), 100 mL di soluzione per pipetta (Tabella 6) e 5 ml di acido pluronico secondo le ricette fornite.
   NOTA: Le soluzioni da bagno (Tyrode e soluzione 4-AP) possono essere preparate (senza glucosio) in anticipo e conservate a +4 °C, il glucosio viene aggiunto il giorno sperimentale. La soluzione di pipetta può essere conservata a -20 °C, l'indicatore di calcio viene aggiunto il giorno sperimentale e la soluzione viene quindi conservata su ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Il tampone di perfusione 10x può essere conservato a temperatura ambiente, il tampone di perfusione 1x, il tampone di digestione e il tampone di arresto devono essere preparati al momento il giorno sperimentale.
2. Accendere il bagno d'acqua e la pompa a rulli.
3. Apparecchio Langendorff di preriempimento con tampone di perfusione; Assicurati che sia privo di aria.
4. Preparare la cannula aortica fissandola sotto il microscopio a dissezione, collegare con una siringa da 1 mL riempita con tampone di perfusione e aria pulita risciacquando la cannula.
   NOTA: È fondamentale evitare qualsiasi aria all'interno del sistema di perfusione, poiché ciò influenzerà direttamente la perfusione coronarica e quindi l'efficacia della digestione. Una trappola a bolle potrebbe essere aggiunta alla configurazione, se necessario, per evitare in modo sicuro qualsiasi intrappolamento d'aria.
5. Preparare le piastre di Petri con sufficiente tampone di perfusione per la raccolta degli organi e la microscopia (il tampone dovrebbe coprire saldamente l'intero organo, pochi millilitri – a seconda delle dimensioni della capsula di Petri utilizzata – dovrebbero essere sufficienti).
6. Preparare 3 piastre di Petri con tampone di digestione per la dissociazione tissutale e la microscopia, il tampone deve coprire l'organo per la dissezione al microscopio all'interno della rispettiva capsula di Petri, la quantità dipende dalla dimensione della capsula di Petri utilizzata. Per la dissociazione utilizzare 3 ml per il tessuto ventricolare e 1,5 ml per il tessuto atriale.

2. Prelievo di organi

1. Iniettare nel mouse 0,1 mL di eparina (1.000 U/mL) i.p. utilizzando una siringa da 1 mL con una cannula da 27 G e attendere 5-10 minuti.
2. Posizionare il topo in una camera di induzione insieme a un piccolo tessuto imbevuto di circa 500 μL di isoflurano. L'animale non deve essere in contatto con il tessuto. Per evitare ciò, è possibile utilizzare una cassetta di plastica per incorporare biopsia per coprire il tessuto. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, controllare il riflesso del pizzico del dito del piede e non appena non è più presente, eutanasia rapidamente il topo per lussazione cervicale.
3. Posizionare il mouse su una piattaforma sul dorso (ad esempio, su polistirolo coperto con un tovagliolo di carta) e fissare le zampe verso il basso con cannule per tenerlo in posizione.
4. Rimuovere la pelliccia e la pelle che copre il torace e parte dell'addome con un taglio netto dal giugulo verso la sinfisi e aprire l'addome proprio sotto lo xifoide senza ferire alcuna struttura d'organo usando le forbici. Sollevare lo sterno con una pinza chirurgica e tagliare il diaframma con le forbici lungo il bordo delle costole, quindi tagliare le costole nella linea ascellare mediale e rimuovere la gabbia toracica per esporre il cuore.
5. Rimuovere con attenzione il pericardio con una pinza smussata e rimuovere rapidamente il cuore sollevandolo con una pinza smussata dal basso e tagliando i grandi vasi con un singolo taglio usando le forbici.
6. Mettere il cuore in tampone di perfusione a temperatura ambiente e cannulare l'aorta con un ago smussato al microscopio il più rapidamente possibile.
   NOTA: Rimuovere qualsiasi tessuto polmonare e tessuto adiposo attaccato all'organo senza perdere troppo tempo su di esso. Durante l'incannulamento, assicurarsi che l'estremità dell'ago non si estenda attraverso la valvola aortica, poiché ciò comprometterà i risultati impedendo ai tamponi di entrare nelle arterie coronarie.
7. Legare saldamente il cuore con un pezzo di seta suturatrice all'ago e scollegare dalla siringa.
   NOTA: L'intera procedura dall'ottenimento del cuore (il momento in cui i grandi vasi vengono tagliati) fino alla sutura dell'aorta all'ago dovrebbe richiedere il minor tempo possibile. Si raccomanda di non impiegare più di 90-180 s dalla rimozione del cuore fino all'inizio della perfusione.

3. Digestione enzimatica

1. Dopo l'incannulamento aortico, collegare immediatamente il cuore cannulato all'apparato Langendorff evitando che l'aria entri nel sistema.
   NOTA: Può essere utile avere una goccia sospesa di tampone di perfusione nella parte inferiore dell'apparecchio Langendorff e una goccia di tampone di perfusione posizionata sulla parte superiore dell'ago per evitare che l'aria entri nel sistema.
2. Perfondere il cuore con tampone di perfusione per 1 minuto ad una temperatura di esattamente 37 °C e una velocità di perfusione di esattamente 4 mL/min.
   NOTA: Per avere una temperatura di 37 °C sulla punta dell'ago di perfusione, la temperatura del bagno d'acqua deve essere impostata leggermente al di sopra di circa 40 °C. Questo dovrebbe essere testato regolarmente misurando la temperatura sulla punta di perfusione.
3. Commutare la perfusione in tampone di digestione e perfondere per esattamente 9 minuti ad una temperatura di esattamente 37 °C e una velocità di perfusione di esattamente 4 mL/min.
4. Trasferire il cuore digerito in una capsula di Petri con abbastanza tampone di digestione per mantenerlo completamente coperto. Quindi sezionare attentamente gli atri e i ventricoli al microscopio.
5. Trasferire gli atri in una capsula di Petri con 1,5 ml di tampone di digestione e i ventricoli in un'altra capsula di Petri con 3 ml di tampone di digestione.
6. Dissezione atriale
   1. Con attenzione, ma senza perdita di tempo, separare gli atri in piccoli pezzi usando una pinza smussata.
   2. Sciogliere il tessuto con attenzione su e giù utilizzando una punta da 1.000 μL, che è stata precedentemente tagliata per allargare l'apertura della punta.
   3. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere una quantità equivalente di tampone di arresto (1,5 mL) mediante pipettaggio accurato sul lato del tubo per terminare la reazione.
   4. Passare con cautela tutti i 3 ml di soluzioni cellulari/tissutali attraverso una rete di nylon da 200 μm per rimuovere i restanti pezzi di tessuto più grandi che non sono stati completamente digeriti.
      NOTA: Una digestione di successo non lascerà quasi nessun pezzo solido.
7. Dissezione ventricolare
   1. Tritare rapidamente il tessuto ventricolare in piccoli pezzi usando forbici da dissezione e pipetta su e giù per dissolvere. Utilizzare un'altra punta per pipetta da 1.000 μL per il pipettaggio su e giù, può essere accorciata per allargare l'apertura.
   2. Trasferire la cellula/soluzione tissutale in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere una quantità equivalente di tampone di arresto (3 ml) mediante pipettaggio accurato sul lato del tubo per terminare la reazione.
   3. Passare con cautela tutti i 6 ml di soluzione cellulare/tissutale attraverso una rete di nylon da 200 μm per rimuovere i pezzi di tessuto più grandi che non sono stati completamente digeriti.
      NOTA: Una digestione di successo non lascerà quasi nessun pezzo solido.
8. Lasciare entrambi i tubi (sospensione di cellule atriali e ventricolari) sul banco a temperatura ambiente per 6 minuti per sedimentare.
9. Centrifugare entrambi i tubi da 15 ml a 5 x g per 2 minuti.

4. Reintroduzione del calcio

NOTA: I seguenti passaggi sono identici sia per le cellule atriali che per quelle ventricolari (se non diversamente specificato) e vengono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica e risospendere accuratamente il pellet in 10 mL di soluzione di Tyrode senza calcio.
2. Lasciare le cellule per 8 minuti per la sedimentazione.
3. Centrifugare a 5 x g per 1 minuto (solo cellule atriali, la sedimentazione è sufficiente per le cellule ventricolari).
4. Eliminare il surnatante e risospendere accuratamente il pellet in 10 mL di soluzione di Tyrode con concentrazione di calcio di 100 μM.
5. Lasciare le cellule per 8 minuti per la sedimentazione.
6. Centrifugare a 5 x g per 1 minuto (solo cellule atriali, la sedimentazione è sufficiente per le cellule ventricolari).
7. Eliminare il surnatante e risospendere accuratamente il pellet in 10 mL di soluzione di Tyrode con concentrazione di calcio di 400 μM.
8. Lasciare le cellule per 8 minuti per la sedimentazione.
9. Centrifugare a 5 x g per 1 minuto (solo cellule atriali, la sedimentazione è sufficiente per le cellule ventricolari).
10. Scartare il surnatante e risospendere con cautela il pellet in 1 mL (atriale)/ 5 mL (ventricolare) di soluzione di Tyrode con concentrazione di calcio di 1 mM.

5. Carico di miociti con indicatore di calcio fluorescente Fluo-3 AM

NOTA: A causa della sensibilità alla luce dell'indicatore fluorescente di calcio, i seguenti passaggi devono essere eseguiti protetti dalla luce (ad esempio, coprendo i tubi con un foglio di alluminio).

1. Preparare la soluzione madre di Fluo-3 AM aggiungendo 44 μL di F-127 pluronico al 20% in DMSO anidro a 50 μg di Fluo-3AM (può essere conservato a -20 °C al riparo dalla luce).
2. Aggiungere 10 μL di soluzione madre Fluo-3 AM a 1 mL di sospensione cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
3. Centrifugare a 5 x g per 1 min.
4. Scartare il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica e risospendere il pellet in una quantità ragionevole di soluzione di bagno per ottenere una buona concentrazione di lavoro (1-5 ml di soluzione di bagno a seconda della densità cellulare).
5. Lasciare agire per 30 minuti per la deesterificazione prima di iniziare con gli esperimenti.

6. Misurazioni simultanee di patch-clamp e transitori di Ca²⁺ epifluorescenti come descritto in precedenza¹⁶

NOTA: Le misurazioni dei morsetti patch non sono l'argomento di questo articolo, il lettore interessato può essere rimandato alle principali pubblicazioni che forniscono descrizioni approfondite di questo metodo 17,18,19,20,21,22. Tuttavia, per una migliore comprensione generale, viene fornito un riassunto su un protocollo per misurare le correnti di calcio di tipo L insieme ai transitori di calcio indotti dalla corrente.

1. Trasferire i miociti in una camera cellulare e superfondere con soluzione di bagno a 37 °C.
2. Bloccare le correnti di potassio aggiungendo 4-amminopiridina e cloruro di bario alla soluzione del bagno come indicato nella Tabella 5.
3. Assicurarsi che i microelettrodi borosilicati abbiano una resistenza della punta di 2-5 MΩ riempiti con soluzione di pipetta (Tabella 6).
4. Impostare le misure per consentire la registrazione simultanea di segnali elettrici ed epifluorescenza allo stesso tempo. La modalità di morsetto di tensione viene utilizzata per misurare la corrente Ca²+ di tipo L con un protocollo che mantiene la cella a -80 mV e un impulso di rampa di 600 ms a -40 mV per inattivare la corrente veloce Na⁺, seguita da un impulso di prova di 100 ms a +10 mV a 0,5 Hz (Figura 2).
5. Utilizzare l'eccitazione a 488 nm, la luce emessa a <520 nm per rilevare e convertire in [Ca²⁺]_I assumendo
   
   Dove k_d = costante di dissociazione di Fluo-3 (864 nM), F = fluorescenza Fluo-3; F_max = fluorescenza satura di Ca²⁺ ottenuta alla fine di ogni esperimento¹⁹.

Risultati

La resa di isolamento viene determinata dopo la reintroduzione del calcio pipettando 10 μL di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio. Più di 100 cellule vitali, a forma di bastoncello, non contraenti/10 μL per l'isolamento delle cellule atriali e più di 1.000 cellule vitali, a forma di bastoncello, non contraenti/10 μL per l'isolamento delle cellule ventricolari sono considerate come resa sufficiente e sono comunemente ottenute utilizzando questo protocollo. Le cellule atriali ottenute con questo protoco...

Discussione

Questo articolo fornisce un modo semplice e funzionale per ottenere miociti atriali e ventricolari di alta qualità dallo stesso topo per studi patch-clamp con registrazioni simultanee di transitori di calcio. La qualità dei dati ottenuti dipende fortemente dalla qualità dell'isolamento cellulare. Come accennato in precedenza, molti metodi per isolare cardiomiociti murini sono stati descritti in precedenza 9,10,11,12.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	31550
27G cannula	Servoprax	L10220
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	A78403
Anhydrous DMSO	Sigma-Aldrich	D12345
Aortic cannula	Radnoti	130163-20
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920
blunt surgical forceps	Kent Scientific	INS650915-4
Bovine Calf Serum	Sigma-Aldrich	12133C
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Circulating heated water bath	Julabo	ME
Collagenase Type II	Worthington	LS994177
disscetion scissors	Kent Scientific	INS600124
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Fluo-3	Invitrogen	F3715
Fluo-3 AM	Invitrogen	F1242
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Guanosine 5′-triphosphate tris salt	Sigma-Aldrich	G9002
Heating coil	Radnoti	158821
Heparin	Ratiopharm	25.000 IE/5ml
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136
induction chamber	CWE incorporated	13-40020
Isoflurane	Cp-pharma	1214
Jacketed heart chamber	Radnoti	130160
KCl	Merck	1049360250
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
MgCl x 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250
MgSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Na2HPO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Nylon mesh (200 µm)	VWR-Germany	510-9527
pasteur pipette	Sigma Aldrich	Z331759
petri-dishes	Thermo Fisher	150318
Pluronic Acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
Roller Pump	Ismatec	ISM597D
surgical forceps	Kent Scientific	INS650908-4
surgical scissors	Kent Scientific	INS700540
suturing silk	Fine Science Tools	NC9416241
syringe	Merck	Z683531-100EA
Taurin	Sigma-Aldrich	86330