JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

Abstract

מגהקריוציטים של מח עצם הם תאים פוליפלואידיים גדולים המבטיחים ייצור של טסיות דם. הם נובעים מתאי גזע hematopoietic דרך megakaryopoiesis. השלבים הסופיים של תהליך זה הם מורכבים וקלאסיים מעורבים אבות Megakaryocyte-אריתרוציטים דו-פוטנטיים (MEP) ואת אבות המגקריוציטים (MKp) החד-פעמיים. אוכלוסיות אלה מקדימות את היווצרותם של מגה-קריוציטים בתום לב, וככאלה, בידודם ואפיונם עלולים לאפשר ניתוח חזק ובלתי משוחד של היווצרות מגה-קריוציטים. פרוטוקול זה מציג בפירוט את ההליך לאיסוף תאים hematopoietic ממח עצם העכבר, העשרה של אבות hematopoietic באמצעות דלדול מגנטי ולבסוף אסטרטגיית מיון תאים המניבים אוכלוסיות MEP ו- MKP מטוהרות מאוד. ראשית, תאי מח עצם נאספים מעצם הירך, השוקה, וגם סמל הכסל, עצם המכילה מספר גבוה של אבות hematopoietic. השימוש בעצמות פסגת הכסל מגדיל באופן דרסטי את מספר התא הכולל המתקבל לעכבר ובכך תורם לשימוש אתי יותר בבעלי חיים. דלדול שושלת מגנטית היה אופטימיזציה באמצעות חרוזים מגנטיים 450 ננומטר המאפשר מיון תאים יעיל מאוד על ידי ציטומטריית זרימה. לבסוף, הפרוטוקול מציג את אסטרטגיית התיוג וההתארגנות למיון שתי אוכלוסיות אבות מגהקריוציט מטוהרות מאוד: MEP (לין-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9עמום) ו- MKP (לין- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9בהיר ). טכניקה זו קלה ליישום ומספקת מספיק חומר תאי לביצוע i) אפיון מולקולרי לידע מעמיק יותר של זהותם וביולוגיה שלהם, ii) במבחנה הבחנה assays, שיספק הבנה טובה יותר של מנגנוני ההתבגרות של megakaryocytes, או iii) במודלים במבחנה של אינטראקציה עם microenvironment שלהם.

Introduction

טסיות דם מיוצרות על ידי מגה-קריוציטים. תאים פוליפלואידיים גדולים אלה ממוקמים במח העצם ובפי כל תאי הדם הם נגזרים מתאי גזע Hematopoietic (HSC)1. המסלול הקלאסי של ייצור של megakaryocytes במח העצם מקורו HSC ומערב את הדור של אבות שונים המגבילים בהדרגה את פוטנציאל הבידול שלהם2. האב הקדמון הראשון החתום על המחויבות לשושלת המקרוציטית הוא האבות Megakaryocyte-אריתרוציט (MEP), צאצא דו-פונטי המסוגל לייצר הן תאי אריתרויד והן מגהקריוציטים3,4,5. לאחר מכן מייצר ה- MEP צאצא /מבשר חד-קומתי (MKP) שיבדל למגקריוציט בוגר המסוגל לייצר טסיות דם. המנגנונים המעורבים בדור אבות אלה, כמו גם הבידול וההתבגרות שלהם למגקריוציטים הם מורכבים ומובנים חלקית בלבד. בנוסף, ההטרוגניות של אוכלוסיית MEP במונחים של פוטנציאל בידול ורמת המחויבות המהותית של תאים אלה עדיין לא ברורה. כדי לפענח תהליכים אלה, חיוני להשיג (או לקבל גישה) אוכלוסיות מטוהרות של MEP ו- MKp עבור ניתוחים מולקולריים ותאיים בודדים עדינים.

מספר מחקרים הדגימו שילובים מסוימים של סמני פני השטח של התא לזיהוי אבות המחויבים לשושלת המגקריוציטית בעכבר6,7,8. מתוך אלה הומצאה שיטה המאפשרת טיהור של MEP ו- MKP מעכברים. שיטה זו הייתה ממוטבת כדי להשיג תאים במספר ובאיכות נאותים עבור מספר רב של בדיקות. מתוך שיקולים אתיים, וכדי לצמצם את מספר בעלי החיים המעורבים בניסויים, עוררנו לקצור את מח העצם מעצם הירך ומהשוקה, וגם מפסגת הכסל. עצם זו מכילה תדירות גבוהה ומספר אבות hematopoietic והוא רוב הזמן פגום במהלך קצירת עצם ארוכה. מוצג כאן היא שיטה מפורטת עבור אוסף אמין של עצם זו.

הקריטריונים השניים של אופטימיזציה הוא לייצר אוכלוסיות תאים מטוהרות מאוד. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא שיטה של בחירה על מנת להשיג אוכלוסיות מטוהרות של תאים מעניינים. עם זאת, תשואות נמוכות מגיעות כאשר אוכלוסיית התאים של עניין היא נדירה מאוד. לכן יש צורך בהליכי העשרה. בפרוטוקול זה, הליך בחירה שלילי נבחר באמצעות חרוזים מגנטיים.

Protocol

פרוטוקולים הנוגעים לבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). מספר היתר: E67-482-10).

1. אוסף עצמות עכבר

  1. להקריב את החיה בהתאם להנחיות המוסדיות.
    הערה: הנתונים המוצגים בכתב יד זה התקבלו מעכברים C57Bl/6 בני 8 עד 12 שבועות. מספר התאים שהושגו, ותדירות האוכלוסיות המצוטטים עשויים להשתנות בהתאם לגיל ולמתח העכבר.
  2. לרסס את הגוף עם 70% אתנול.
  3. באמצעות מספריים, לבצע 0.5-1 ס"מ פירוק של העור בניצב לעמוד השדרה ולקרוע את העור סביב כל הגוף. מוציאים את העור מהגוף התחתון ומסירים את העור.
  4. מניחים את החיה על משטח ההפצה, עם הפנים כלפי מטה. אתר את עצמות האגן על ידי הזזת האצבעות לאורך עמוד השדרה החשוף מלמעלה למטה. כדי לאתר את סמל הכסל, לזהות את הבליטה הקטנה באזור המותני ליד האחוריים (האזור הטרטרוסקופי של עצם האגן). איור 1A,B מציג ייצוג סכמטי של האנטומיה של העכבר.

figure-protocol-1081
איור 1: אנטומיה של עכבר. (A)צילום רנטגן של עכבר המציג את העצמות האחוריות. שים לב למרווח בין עצם האגן לעמוד השדרה (חץ צהוב), שבו המספריים חייבים להיות מוכנסים כדי להפריד כראוי את האחוריים מגוף העכבר (קו מקווקו צהוב). (ב)ייצוג סכמטי של עצמות עשירות במח העצם של עניין. עצמות האגן מתוארות באדום, עצם הירך בסגול, ואת השוקה בירוק. (C)ייצוג סכמטי של עצם האגן של העכבר. האיליה מתאים לחלק העשיר במח העצם של עצם האגן ומודגש באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מניחים את המספריים במקביל לעמוד השדרה כנגד החוליות וקרובים לבליטת פסגת הכסל. המשך לחתוך את השרירים לאורך הצד של עמוד השדרה מעל עצם האגן על ידי הזזת המספריים לאורך החוליות כל הדרך למטה לזנב.
    הערה: חלק ראשון זה של השרירים יכול להתבצע גם באמצעות להב אזמל.
  2. הניחו את המספריים מקבילים לעמוד השדרה והמשיכו לחתוך בין החוליות לפסגת הכסל, כפי שמציינים הקו המקווקו הצהוב באיור 1A. הקפד להישאר קרוב לחוליות ככל האפשר. חותכים את השרירים הנותרים כדי לנתק את האיבר מהגוף.
    הערה: צריכה להיות התנגדות מועטה עד לא קיימת.
  3. חזור על הפעולה בצד השני כדי לנתק את האיבר השני.
  4. מעבירים את הגפיים על משטח נקי ומשליכים את שאר הגוף בהתאם להנחיות המוסדיות.
  5. לחשוף את עצמות האגן, הירך, ו tibial על ידי הסרת הרקמה שמסביב ככל האפשר עם המלקחיים ואת האזמלים.
  6. המשך לפרוק בזהירות את ראש הירך מעצם האגן על ידי החזקת הקצה הדיסטלי של עצם הירך עם המלקחיים תוך חיתוך עדין של השרירים סביב הניסוח עם האזמלים. נענע את העצמות כדי להקל על הנקע.
  7. לגרד את השריר הנותר מעצם האגן לחתוך עם אזמל באמצע החלל כי החזיק את ראש הירך. האיליום נשמר מכיוון שהוא עשיר באבות המטופויים, בעוד הצד המשולש הדק מאוד של העצם מושלך, כפי שמוצג באיור 1C.
  8. הסר את שאריות הרקמות סביב האיליום עם האזמל ומניחים את העצם המנוקה PBS סטרילי בתוספת 2% סרום עגל שזה עתה נולד (PBS-2%NBCS).
  9. בעזרת מספריים, חותכים את הרגל מהרגל בקרסול.
  10. החזק את החלק התחתון של השוקה עם המלקחיים ולגרד את השריר לכיוון הברך. להשליך את השוביות לחתוך על פני הרמה tibial עם האזמל. מניחים את השוקה ב- PBS-2% NBCS סטרילי.
  11. הסר את שאריות הרקמות סביב עצם הירך עם אזמלים.
  12. החזק את הצד העליון של עצם הירך עם מלקחיים; מניחים את להב האזמל בבסיס פיקת הברך. החל כוח לכיוון פיקת הברך במקביל עצם הירך עד ניתוק פיקת הברך. מניחים את עצם הירך ב-PBS-2% סטריליים NBCS. הסרת פיקת הברך מספקת גישה נקייה להכנסת המחט לשטיפה של מח העצם.

2. דלדול מגנטי של תאים חיוביים שושלת

  1. בארון זרימה למינאר, להעביר את העצמות בצלחת פטרי סטרילית מלא PBS-2% NBCS סטרילי.
  2. עם אזמל חתוך את ראש עצם הירך.
  3. מלא מזרק 1 מ"ל עם PBS-2% NBCS סטרילי ולחבר מחט 21 G לשקע.
  4. מלא צינור פוליפרופילן 5 מ"ל עם 2 מ"ל של PBS-2% NBCS סטרילי.
  5. החזק את עצם הירך עם המלקחיים; הכנס בעדינות את המחט לחריץ שנותר לאחר הסרת פיקת הברך. החל סיבוב על המחט בעת החדרה כדי למנוע חיבור של המחט. ודא כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם עד שיפוע.
  6. העבר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל 2 מ"ל של PBS-2%NBCS. לוותר ולשאוף PBS-2%NBCS מהמזרק עד העצם ברורה.
  7. הסר את המחט מ עצם הירך ולהכניס אותו לחור בצד הנגדי שבו ראש עצם הירך היה. מחלקים ושואפים שוב את החיץ ומשליכים את העצם.
  8. עבור סמל הכסל והשוקה, להחזיק את העצם עם מלקחיים; הכנס בעדינות את המחט לצד הפתוח. החל סיבוב על המחט בעת החדרה כדי למנוע חיבור של המחט. ודא כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם עד שיפוע. העבר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל 2 מ"ל של PBS-2%NBCS. לוותר ולשאוף PBS-2%NBCS מהמזרק עד העצם ברורה. זרוק את העצמות.
    הערה: עצמות של עד שלושה עכברים ניתן לשטוף לתוך אותו צינור. תאחדו את ההשעיות של התאים.
  9. להעביר את השעיית התא המאגד דרך מכסה מסננת תא 40 מיקרומטר להציב על צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל.
  10. המשך לספור את התאים.
    הערה: ניתן לבצע ספירת תאים עם כל המוציטומטר, באמצעות Trypan Blue להערכת כדאיות, או עם כל מונה תאים אוטומטי. עכבר אחד מניב בדרך כלל 105 ± 7 x 106 תאים.
  11. קח הצידה 100 μL של השעיית התא כמו מח עצם הכולל, להוסיף 500 μL של PBS-2%NBCS ולשמור אותו על קרח עבור הליך הכתם.
  12. גלם את המתלים המסוננים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהשליך את supernatant.
    הערה: תאי דם אדומים יכולים להיות lysed על ידי שימוש חוזר את הכדור בתמיסת ליזה מוכן טרי (1/10th ב- dH2O). דגירה במשך 5 דקות עד המתלה הופך ברור ואדום בוהק ולהוסיף 10 כרכים של PBS סטרילי. המשך לשטוף את התאים PBS-2%NBCS על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). היזהר בעת הסרת supernatant כמו גלולה התא הוא רופף מאוד. בצע שטיפה שנייה עם PBS-2%NBCS על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהמשיך לשלב 2.13.
  13. Resuspend גלולה התא בקוקטייל נוגדנים ראשוני מוכן טרי עם יחס של 100 μL לכל 1 x 107 תאים. דגירה על קרח במשך 30-45 דקות.
נוגדןדילול
Gr-1-ביוטין1:500
B220-ביוטין1:500
מק-1-ביוטין1:500
CD3-ביוטין1:500
CD4-ביוטין1:500
CD5-ביוטין1:500
CD8-ביוטין1:500
TER119-ביוטין1:1000
CD127-ביוטין1:500

טבלה 1.

  1. קח הצידה 10 μL של השעיית התא לתוך צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל שכותרתו שבר לין-Pos. הוסף 90 μL של PBS-2%NBCS ולשמור אותו על קרח עבור הליך הכתמה.
  2. המשך לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-2%NBCS סטרילי על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הקפד לעשות את הכביסה האחרונה בצינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל.
  3. במהלך שלבי הכביסה, הכינו את החרוזים לדלדול המגנטי.
    1. resuspend החרוזים בקסנה על ידי מערבולת ביסודיות במשך 30 s.
    2. העבר נפח של חרוזים המתאימים לשני חרוזים לכל תא יעד לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל.
    3. לשטוף את החרוזים פעמיים עם PBS-2%NBCS על ידי הצבת הצינור על המגנט והסרת חיץ הכביסה באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית.
    4. resuspend החרוזים ב 500 μL של PBS-2NBCS סטרילי%.
  4. Resuspend הכדור של תאים מסומנים ב 250 μL של חרוזים ומערבבים בעדינות במשך 5 דקות על קרח. הוסיפו 2 מ"ל של PBS-2% סטריליים של NBCS וערבבו בעדינות. אל תנער את הצינור.
  5. מניחים את הצינור על המגנט למשך 2 דקות.
  6. ממשיכים לאסוף את השבר הלא מגנטי עם פיפטה פסטר זכוכית סטרילית ולהוסיף אותו על 250 μL הנותרים של חרוזים מגנטיים. לאטום את הצינור עם parafilm.
  7. מניחים את הצינור על רולר צינור במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F).
  8. הוסיפו 2 מ"ל של PBS-2% סטריליים של NBCS וערבבו בעדינות. אל תנער את הצינור.
  9. מניחים את הצינור במגנט למשך 2 דקות.
  10. המשך לאסוף את השבר הלא מגנטי לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל שכותרתו לין-שלילי שבר עם פיפטת פסטר זכוכית סטרילית.
  11. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהסיר את supernatant.
  12. resuspend התאים הלא מגנטיים ב 500 μL של PBS-2% NBCS סטרילי.
  13. המשך לספור את התאים.
    הערה: עכבר אחד מניב בדרך כלל 3.9 ± 1.1 x 106 תאים. כתמי שושלת אופייניים מלפני ופוסט-דלדול מוצגים באיור 2B.

3. מיון תאים של אבות megakaryocyte על ידי cytometry זרימה

  1. קח את הצינורות שכותרתם מח עצם כולל, שבר לין-פו, ושבר לין שלילי.
  2. המשך לפצל את התוכן של הצינור מח עצם סה"כ באופן שווה לתוך שישה צינורות פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל. תייג את הצינורות עם המספרים 1-6.
  3. המשך לתייג את שבר לין-פו של הצינור עם המספר 7.
  4. המשך לפצל את התוכן של שבר לין-שלילי הצינור כדלקמן.
    1. העבר 50 μL לתוך צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל המכיל 250 μL של PBS-2%NBCS סטרילי. לאחר מכן, לפצל את התוכן שלה באופן שווה לתוך 3 צינורות פוליסטירן 5 מ"ל סטרילי. תייג את הצינורות האלה עם המספרים 8-10.
    2. 450 μL הנותרים של השעיית תא לין-שלילי שבר מתאים לצינור עם המספר 11.
  5. הוסף את הנוגדנים לצינורות כמתואר בטבלה 2.
צינורתוויתקוקטייל נוגדנים
סה"כ מח עצם
1פקד לא נגוע
2שליטה מוכתמת בודדתCD45-FITC (1/200)
3שליטה מוכתמת בודדתCD45-PE (1/200)
4שליטה מוכתמת בודדתTER119-נגמ"ש (1/200)
5שליטה מוכתמת בודדתCD45-PECy7 (1/200)
6שליטה מוכתמת בודדתCD45-APC-Cy7 ביוטין (1/200)
שבר לין-קופה
7שליטה מוכתמת בודדתשליטה מוכתמת אחת. סטרפטבידין-נגמ"ש-סיי7 (1/500)
שבר לין-שלילי
8בקרת FITC FMOc-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + סטרפטבידין-APC-Cy7 (1/500)
9בקרת FMO PECD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + סטרפטאבידין-APC-Cy7 (1/500)
10בקרת FMO PECy7CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + סטרפטבידין-APC-Cy7 (1/500)
11שפופרת חיובית למיוןCD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + סטרפטבידין-APC-Cy7 (1/500)

טבלה 2.

  1. דגירה על קרח במשך 30-45 דקות בחושך.
  2. לשטוף את התאים עם PBS-2%NBCS סטרילי על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  3. resuspend כדורי התא כדלקמן.
    1. עבור הצינורות 1 עד 10, resuspend הכדור ב 300 μL של PBS-2%NBCS סטרילי בתוספת 7AAD (2.5 מיקרוגרם / מ"ל סופי) (PBS-7AAD).
      אזהרה: 7AAD הוא intercalant DNA ולכן יש לטפל עם PPE מתאים (כפפות).
    2. עבור צינור 11, resuspend הכדור ב PBS-7AAD סטרילי בריכוז מרבי של 5 x 106 תאים למ"ל ונפח מינימלי של 1 מ"ל.
  4. הכן שני צינורות איסוף פוליפרופילן שכותרתם MEP ו- MKP המכילים 2 מ"ל של PBS-2%NBCS.
    הערה: לחלופין, ניתן לאסוף תאים למאגר תמזה בינוני או תאי של תרבית בהתאם ליישום הבא עבור התאים ממוינים. השימוש בצינורות פוליסטירן אינו מומלץ בגלל הפרעה אפשרית עם טיפות טעונות המכילות את התאים של עניין.
  5. שמור את כל הצינורות על קרח בחושך.
  6. המשך לגדר סדרן התאים.
    1. השתמש בצינורות 1-7 כדי להגדיר מתח ופיצוי, צינורות 7-10 כדי לקבוע את שערי המיון עבור אוכלוסיות התאים של עניין צינור 11 למיון תאים.
  7. הצעדים הראשונים של אסטרטגיית הג'טינג נועדו להוציא מהניתוח מכפילים ותאים מתים, כמתואר באיור 3. זהה תאים יחידים קיימא ולהציג SSC-לעומת Lin-APC-Cy7 נקודה plot כדי לאשר את היעילות של דלדול שושלת היוחז. מתוך תאי Lin- שער מוגדר לבחור תאים חיוביים עבור c-kit ושלילי או עמום עבור Sca-1 ו- CD16/32. התוויית נקודות של ביטוי CD9 לעומת CD150 עבור התאים שנבחרו מאפשרת זיהוי של ארבע אוכלוסיות.
    הערה: תאי MEP ו- MKp שניהם חיוביים עבור CD150. ניתן להגדיר שלוש רמות ביטוי עבור CD9 (שלילה, עמום וגבוה). MKp מבטא רמה גבוהה של CD9 ו- MEP express CD9 ברמת עוצמת פלואורסצנטיות ביניים. אוכלוסיית MEP מתאימה ללין- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/עמום CD150+ CD9עמום ואוכלוסיית MKP תואמת את לין- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/עמום CD150+ CD9בהיר. האפליה בין אוכלוסיות עמומות CD9 ו- CD9 עבור התאים החיוביים CD150 מוגדרת בהתבסס על הרמה המרבית של ביטוי CD9 באוכלוסייה השלילית CD150. עכבר אחד מניב בדרך כלל 5.3 ± 0.6 x 103 MKp ו- 27.2 ± 2.4 x 103 MEP.

תוצאות

ניתוח פנוטיפי של התאים שזוהו כ- MEP ו- MKp בוצעו על ידי ציטומטריית זרימה. תאים סומנו בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ל- CD41a ו- CD42c, סמנים קלאסיים של שושלות המגקריוציטיות והטסיות. שני הסמנים התבטאו בתאי אוכלוסיית הח"כים בעוד סמנים אלה עדיין לא זוהו על פני השטח של תאי אוכלוסיית MEP (איור 4A...

Discussion

השיטה המתוארת במאמר זה מאפשרת מיצוי וטיהור של עכבר MEP ו- MKp. פרמטר חשוב באופטימיזציה של הפרוטוקול היה להשיג מספר מספיק של תאים שיהיו תואמים לרוב ההסתה המולקולרית והתאית. הנוהג הכללי של איסוף עצמות עכבר להפקת תאים hematopoietic בדרך כלל מורכב קצירת הן עצם הירך והן השוקה של כל עכבר. עצם האגן, מקור נו?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות למוניק פרוינד, קתרין זיסל וקאטי על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 כדי Henri.de לה. סאל.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
21-gauge needlesBD Microlance301155
7AADSigma-AldrichA9400
Antibody Gr-1-biotineBioscience13-5931-85Magnetic depletion
Antibody B220-biotineBioscience13-0452-85Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotineBioscience13-0112-85Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotineBioscience13-0031-85Magnetic depletion
Antibody CD4-biotineBioscience13-9766-82Magnetic depletion
Antibody CD5-biotineBioscience13-0051-85Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotineBioscience13-0081-85Magnetic depletion
Antibody TER119-biotineBioscience13-5921-85Magnetic depletion
Antibody CD127-biotineBioscience13-1271-85Magnetic depletion
Antibody CD45-FITCeBioscience11-0451-85Cell sorting
Antibody CD45-PEeBioscience12-0451-83Cell sorting
Antibody TER119-APCeBioscience17-5921-83Cell sorting
Antibody CD45-PECy7eBioscience25-0451-82Cell sorting
Antibody CD45-biotineBioscience13-0451-85Cell sorting
Antibody CD9-FITCeBioscience11-0091-82Cell sorting
Antibody  c-kit-APCeBioscience17-1171-83Cell sorting
Antibody Sca-1-PEeBioscience12-5981-83Cell sorting
Antibody CD16/32-PEeBioscience12-0161-83Cell sorting
Antibody CD150-PECy7eBioscience25-1502-82Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEMStemcell technologies#09650
Dissection padFisher Scientific10452395
DPBSLife Technologies14190-094
EthanolvWR Chemicals83813.360
ForcepsEuronexiaP-120-AS
Glass pasteur pipetteDutscher42011
Magnet :  DynaMag-5Thermo Fisher Scientific12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgGThermo Fisher Scientific11035
MegacultStemcell technologies#04970
MethoCult SF M3436Stemcell technologies#03436
Newborn Calf SerumDutscher50750-500
Red Cell Lysis solutionBD Bioscience555899
ScalpelsFisher Scientific12308009
ScissorsEuronexiaC-165-ASB
Sterile 1 mL syringesBD Bioscience303172
Sterile 15mL tubesSarstedt62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubesFalcon352063
Sterile 5mL polystyrene tubesFalcon352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer capFalcon352235
Sterile petri dishFalcon353003
Streptavidin-APC-Cy7BD Biosciences554063Cell sorting
Tube rollerBenchmark ScientificR3005

References

  1. Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
  3. Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
  4. Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
  5. Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
  6. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  7. Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
  8. Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
  9. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  10. Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
  11. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
  12. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  13. Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
  14. Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved