Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Resumo

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Resumo

Megacariócitos de medula óssea são grandes células poliploides que garantem a produção de plaquetas sanguíneas. Elas surgem de células-tronco hematopoiéticas através de megacaripoiesis. As etapas finais deste processo são complexas e classicamente envolvem os progenitores megacariócitos bipotentes -Eritrócitos (MEP) e os progenitores megacayócitos unipotentes (MKp). Essas populações precedem a formação de megacaiócitos de boa fé e, como tal, seu isolamento e caracterização poderiam permitir a análise robusta e imparcial da formação de megacaiócitos. Este protocolo apresenta em detalhes o procedimento para coletar células hematopoiéticas da medula óssea do rato, o enriquecimento de progenitores hematopoiéticos através do esgotamento magnético e, finalmente, uma estratégia de classificação celular que produz populações altamente purificadas de MEP e MKp. Primeiro, as células de medula óssea são coletadas do fêmur, da tíbia, e também da crista ilíaca, um osso que contém um alto número de progenitores hematopoiéticos. O uso de ossos de crista ilíaca aumenta drasticamente o número total de células obtidas por camundongo e, portanto, contribui para um uso mais ético dos animais. Um esgotamento da linhagem magnética foi otimizado usando contas magnéticas de 450 nm permitindo uma classificação celular muito eficiente por citometria de fluxo. Por fim, o protocolo apresenta a estratégia de rotulagem e gating para a classificação das duas populações progenitoras megacarióficas altamente purificadas: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim) e MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^bright ). Esta técnica é fácil de implementar e fornece material celular suficiente para realizar i) caracterização molecular para um conhecimento mais profundo de sua identidade e biologia, ii) ensaios de diferenciação in vitro, que proporcionarão uma melhor compreensão dos mecanismos de maturação de megacaiócitos, ou iii) modelos in vitro de interação com seu microambiente.

Introdução

Plaquetas de sangue são produzidas por megacariócitos. Estas grandes células poliploides estão localizadas na medula óssea e, como em todas as células sanguíneas, elas são derivadas de Células-Tronco Hematopoiéticas (HSC)¹. O caminho clássico de produção de megacaiócitos na medula óssea tem origem no HSC e envolve a geração de diferentes progenitores que restringem progressivamente seu potencial de diferenciação². O primeiro progenitor a assinar o compromisso com a linhagem megacariocítica é o Progenitor megacarito-eritrócito (MEP), um progenitor bipotente capaz de produzir células eritrógradas e megacariócitos^3,4,5. O MEP então produz um progenitor/precursor unipotente (MKp) que se diferenciará em um megacaiócito maduro capaz de produzir plaquetas. Os mecanismos envolvidos na geração desses progenitores, bem como sua diferenciação e maturação em megacaitos são complexos e apenas parcialmente compreendidos. Além disso, ainda não está clara a heterogeneidade da população do MEP em termos de potencial de diferenciação e de comprometimento intrínseco dessas células. Para decifrar esses processos, é essencial obter (ou ter acesso) a populações purificadas de MEP e MKp para análises moleculares e celulares únicas.

Vários estudos demonstraram combinações particulares de marcadores de superfície celular para a identificação de progenitores comprometidos com a linhagem megacariocítica no mouse^6,7,8. A partir destes, foi elaborado um método que permite a purificação de MEP e MKp de camundongos. Este método foi otimizado para a obtenção de células em número e qualidade adequados para um grande número de ensaios. Com considerações éticas em mente, e a fim de minimizar o número de animais envolvidos nos experimentos, nós provocamos para colher a medula óssea do fêmur e tíbia, e também da crista ilíaca. Este osso contém uma alta frequência e número de progenitores hematopoiéticos e é a maior parte do tempo danificado durante a longa colheita óssea. Apresentado aqui é um método detalhado para a coleta confiável deste osso.

O segundo critério de otimização é produzir populações celulares altamente purificadas. A Classificação celular ativada fluorescente (FACS) é um método de escolha para obter populações purificadas de células de interesse. No entanto, os baixos rendimentos são alcançados quando a população celular de interesse é muito rara. Assim, são necessários procedimentos de enriquecimento. Neste protocolo, optou-se por um procedimento de seleção negativa usando contas magnéticas.

Protocolo

Os protocolos envolvendo animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Número de licença: E67-482-10).

1. Coleção de ossos de rato

1. Sacrifique o animal em conformidade com as diretrizes institucionais.
   NOTA: Os dados apresentados neste manuscrito foram obtidos de camundongos C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de idade. O número de células obtidas, e a frequência das populações citadas podem variar de acordo com a idade e a cepa do rato.
2. Pulverize o corpo com 70% de etanol.
3. Com a tesoura, faça uma incisão de 0,5-1 cm da pele perpendicular à coluna vertebral e rasgue a pele ao redor de todo o corpo. Puxe a pele da parte inferior do corpo e remova a pele.
4. Coloque o animal na almofada de dissecção, de frente para baixo. Localize os ossos pélvicos deslizando os dedos ao longo da coluna exposta de cima para baixo. Para localizar a crista ilíaca, identifique a pequena colisão na região lombar próxima às barras traseiras (região anterosuperiora do osso pélvico). Figura 1A, B apresenta uma representação esquemática da anatomia do rato.

Figura 1: Anatomia do rato. (A) Raio-X do rato mostrando os ossos de cetameira. Observe o espaço entre o osso pélvico e a coluna vertebral (seta amarela), onde a tesoura deve ser inserida para separar adequadamente os espinhos traseiros do corpo do mouse (linha pontilhada amarela). (B) Representação esquemática dos ossos de interesse ricos em medula óssea. Os ossos pélvicos são retratados em vermelho, os fêmures em roxo, e as tíbias em verde. (C) Representação esquemática do osso pélvico do camundongo. O ísio corresponde à parte rica em medula do osso pélvico e é destacado em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Coloque a tesoura paralela à coluna vertebral contra as vértebras e perto da colisão da crista ilíaca. Vá cortar os músculos ao longo da lateral da coluna acima do osso pélvico deslizando a tesoura ao longo das vértebras até a cauda.
   NOTA: Esta primeira seção de músculos também pode ser realizada usando uma lâmina de bisturi.
6. Coloque a tesoura paralela à coluna vertebral e proceda ao corte entre as vértebras e a crista ilíaca, conforme indicado pela linha pontilhada amarela na Figura 1A. Certifique-se de permanecer o mais perto possível das vértebras. Corte os músculos restantes para separar o membro do corpo.
   NOTA: Deve haver pouca ou nenhuma resistência.
7. Repita do outro lado para desprender o segundo membro.
8. Transfira os membros em uma superfície limpa e descarte o resto do corpo em conformidade com as diretrizes institucionais.
9. Exponha os ossos pélvicos, femorais e tibiais removendo o máximo possível de tecido circundante com os fórceps e os bisturis.
10. Desloque cuidadosamente a cabeça femoral do osso pélvico segurando a extremidade distal do fêmur com os fórceps enquanto corta suavemente os músculos ao redor da articulação com os bisturis. Mexa os ossos para facilitar a luxação.
11. Raspe o músculo restante do osso pélvico e corte com um bisturi no meio da cavidade que segurou a cabeça do fêmur. O ípio é mantido como rico em progenitores hematopoiéticos, enquanto o lado triangular muito fino do osso é descartado, como mostrado na Figura 1C.
12. Remova os tecidos residuais ao redor do ípio com o bisturi e coloque o osso limpo em PBS estéril complementado com 2% de soro de bezerro recém-nascido (PBS-2%NBCS).
13. Usando uma tesoura, corte o pé da perna no tornozelo.
14. Segure a parte inferior da tíbia com os fórceps e raspe o músculo em direção ao joelho. Descarte a fíbula e corte pelo planalto tibial com o bisturi. Coloque a tíbia em PBS-2%NBCS estérei.
15. Remova os tecidos residuais ao redor do fêmur com bisturis.
16. Segure o lado superior do fêmur com fórceps; coloque a lâmina do bisturi na base da rótula. Aplique uma força em direção à rótula paralela ao fêmur até o descolamento da rótula. Coloque o fêmur em PBS-2%NBCS estéril. A remoção da rótula proporciona um acesso limpo para a inserção da agulha para a lavagem da medula.

2. Esgotamento magnético das células positivas da linhagem

1. Em um armário de fluxo laminar, transfira os ossos em uma placa de Petri estéril cheia de PBS-2% NBCS estéril.
2. Com um bisturi cortado na cabeça dos fêmures.
3. Encha uma seringa de 1 mL com PBS-2%NBCS e anexe uma agulha de 21 G à tomada.
4. Encha um tubo de polipropileno de 5 mL com 2 mL de PBS-2% NBCS estéreis.
5. Segure o fêmur com os fórceps; insira suavemente a agulha na ranhura esquerda após a remoção da rótula. Aplique rotação na agulha ao inserir para evitar a conexão da agulha. Certifique-se de que a agulha está completamente inserida no osso até o bisel.
6. Transfira o osso com a agulha para o tubo contendo 2 mL de PBS-2%NBCS. Dispense e aspire o PBS-2% NBCS da seringa até que o osso esteja limpo.
7. Retire a agulha do fêmur e insira-a no orifício do lado oposto onde estava a cabeça do fêmur. Dispense e aspire novamente o tampão e descarte o osso.
8. Para a crista ilíaca e tíbia, segure o osso com os fórceps; insira suavemente a agulha no lado aberto. Aplique rotação na agulha ao inserir para evitar a conexão da agulha. Certifique-se de que a agulha está completamente inserida no osso até o bisel. Transfira o osso com a agulha para o tubo contendo 2 mL de PBS-2%NBCS. Dispense e aspire o PBS-2% NBCS da seringa até que o osso esteja limpo. Descarte os ossos.
   NOTA: Ossos de até três ratos podem ser colocados no mesmo tubo. Acumule as suspensões de células.
9. Passe a suspensão celular agrupada através de uma tampa de filtro de célula de 40 μm colocada em um tubo de poliestireno estéril de 5 mL.
10. Vá para a contagem das células.
    NOTA: A contagem de células pode ser realizada com qualquer hemótmetro, usando o Trypan Blue para avaliação de viabilidade ou com qualquer contador automatizado de células. Um rato normalmente rende 105 ± 7 x 10⁶ células.
11. Tire 100 μL da suspensão celular como Medula Óssea Total, adicione 500 μL de PBS-2% NBCS e guarde-o no gelo para o procedimento de coloração.
12. Pelota a suspensão filtrada por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernatante.
    NOTA: Os glóbulos vermelhos podem ser reutilizados ressumando a pelota em solução de lise recém-preparada (1/10 em dH2O). Incubar por 5 minutos até que a suspensão fique clara e vermelha brilhante e adicione 10 volumes de PBS estéreis. Prossiga para lavar as células em PBS-2%NBCS por centrifugação a 400 x g para 5 minutos a 4 °C. Tenha cuidado ao remover o supernatante, pois a pelota celular está muito solta. Realize uma segunda lavagem com PBS-2%NBCS por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C e prossiga para a etapa 2.13.
13. Resuspend a pelota celular em coquetel de anticorpos primários recém-preparado com uma razão de 100 μL por 1 x 10⁷ células. Incubar no gelo por 30-45 min.

Anticorpo	Diluição
Gr-1-biotina	1:500
B220-biotina	1:500
Mac-1-biotina	1:500
CD3-biotina	1:500
CD4-biotina	1:500
CD5-biotina	1:500
CD8-biotina	1:500
TER119-biotina	1:1000
CD127-biotina	1:500

Mesa 1.

14. Despocalá-lo 10 μL da suspensão celular em um tubo de poliestireno estéril de 5 mL rotulado fração lin-pos. Adicione 90 μL de PBS-2% NBCS e guarde-o no gelo para o procedimento de coloração.
15. Prossiga para lavar as células duas vezes com PBS-2%NBCS estéreis por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Certifique-se de fazer a última lavagem em um tubo de polipropileno de 5 mL estéril.
16. Durante as etapas de lavagem, prepare as contas para o esgotamento magnético.
    1. Resuspenda as contas no frasco por um vórtice completamente para 30 s.
    2. Transfira um volume de contas correspondente a duas contas por célula alvo em um tubo de polipropileno de 5 mL.
    3. Lave as contas duas vezes com PBS-2%NBCS colocando o tubo no ímã e removendo o tampão de lavagem usando uma pipeta pasteur de vidro estéril.
    4. Resuspenda as contas em 500 μL de PBS-2NBCS estéreis.
17. Resuspenque a pelota de células rotuladas em 250 μL de contas e misture suavemente por 5 minutos no gelo. Adicione 2 mL de PBS-2%NBCS e misture suavemente. Não agite o tubo.
18. Coloque o tubo sobre o ímã por 2 minutos.
19. Prosssiga para coletar a fração não magnética com uma pipeta pasteur de vidro estéril e adicioná-la aos 250 μL restantes de contas magnéticas. Sele o tubo com parafilme.
20. Coloque o tubo em um rolo de tubo por 20 minutos a 4 °C.
21. Adicione 2 mL de PBS-2%NBCS e misture suavemente. Não agite o tubo.
22. Coloque o tubo no ímã por 2 minutos.
23. Prossiga para coletar a fração não magnética em um tubo de polipropileno de 5 mL estéril rotulado Fração Lin-Neg com uma pipeta pasteur de vidro estéril.
24. Pelotar as células por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C e remover o sobrenatante.
25. Resuspende as células não magnéticas em 500 μL de PBS-2% NBCS estéreis.
26. Vá para a contagem das células.
    NOTA: Um rato normalmente rende 3,9 ± 1,1 x 10⁶ células. A coloração típica de linhagem pré e pós-esgotamento são apresentadas na Figura 2B.

3. Classificação celular de progenitores de megacaiócitos por citometria de fluxo

1. Pegue os tubos rotulados de Medula Óssea Total, Fração de Lin-Pos e Fração Lin-Neg.
2. Prossiga para dividir o conteúdo do tubo Total Medula Óssea igualmente em seis tubos estéreis de 5 mL de poliestireno. Rotule os tubos com os números 1-6.
3. Proceda para rotular o tubo Fração Lin-Pos com o número 7.
4. Prossiga para dividir o conteúdo do tubo Fração Lin-Neg da seguinte forma.
   1. Transfira 50 μL para um tubo de poliestireno estéril de 5 mL contendo 250 μL de PBS-2%NBCS estéreis. Em seguida, divida seu conteúdo igualmente em tubos de poliestireno de 5 mL estéreis. Rotule esses tubos com os números 8-10.
   2. Os 450 μL restantes da suspensão celular da Fração Lin-Neg correspondem ao tubo com o número 11.
5. Adicione os anticorpos aos tubos conforme descrito na Tabela 2.

Tubo	Etiqueta	Coquetel de anticorpos
Medula Óssea Total
1	Controle não manchado
2	Controle único manchado	CD45-FITC (1/200)
3	Controle único manchado	CD45-PE (1/200)
4	Controle único manchado	TER119-APC (1/200)
5	Controle único manchado	CD45-PECy7 (1/200)
6	Controle único manchado	Biotina CD45-APC-Cy7 (1/200)
Fração de Lin-Pos
7	Controle único manchado	Controle único manchado. Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
Fração Lin-Neg
8	Controle FMO FITC	c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
9	Controle do FMO PE	CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
10	Controle FMO PECy7	CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
11	Tubo positivo para classificação	CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)

Mesa 2.

6. Incubar no gelo por 30-45 min no escuro.
7. Lave as células com PBS-2%NBCS estéreis por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.
8. Resuspende as pelotas de células da seguinte forma.
   1. Para os tubos de 1 a 10, resuspenque a pelota em 300 μL de PBS-2%NBCS estéril complementado com 7AAD (2,5 μg/mL final) (PBS-7AAD).
      ATENÇÃO: 7AAD é um intercalante de DNA e, portanto, deve ser manuseado com EPI (luvas) apropriados.
   2. Para tubo 11, resuspenque a pelota em PBS-7AAD estéril a uma concentração máxima de 5 x 10⁶ células por mL e um volume mínimo de 1 mL.
9. Prepare dois tubos de coleta de polipropileno rotulados MEP e MKp contendo 2 mL de PBS-2%NBCS.
   NOTA: Alternativamente, as células podem ser coletadas em cultura média ou tampão de lise celular, dependendo da aplicação subsequente para as células classificadas. O uso de tubos de poliestireno não é recomendado devido a possível interferência com as gotículas carregadas que contêm as células de interesse.
10. Mantenha todos os tubos no gelo no escuro.
11. Vá para a configuração do classificador de células.
    1. Use os tubos 1-7 para configurar tensão e compensação, tubos 7-10 para determinar os portões de classificação para as populações celulares de interesse e tubo 11 para triagem celular.
12. Os primeiros passos da estratégia de gating visam excluir doublets e células mortas da análise, conforme descrito na Figura 3. Identifique células viáveis únicas e exiba o gráfico de pontos SSC-vs Lin-APC-Cy7 para confirmar a eficiência do esgotamento da linhagem. A partir do Lin^- células um portão é definido para selecionar células positivas para c-kit e negativa ou fraca para Sca-1 e CD16/32. Um gráfico de ponto de expressão CD9 vs CD150 para as células selecionadas permite a identificação de quatro populações.
    NOTA: As células MEP e MKp são positivas para CD150. Três níveis de expressão para CD9 podem ser definidos (neg, dim e alto). MKp expressam alto nível de CD9 e MEP express CD9 em um nível intermediário de intensidade de fluorescência. A população de MEP corresponde a Lin^- c-Kit⁺ Sca-1-CD16/32^-/dim CD150⁺ POPULAÇÃO CD9^dim e MKp corresponde a Lin^- c-Kit⁺ Sca-1-CD16/32^-/dim CD150⁺ CD9^{dim e}CD9 brilhante . A discriminação entre as populações de cd9 alta e CD9 dim para as células positivas CD150 é definida com base no nível máximo de expressão CD9 na população negativa cd150. Um mouse normalmente rende 5,3 ± 0,6 x 10³ MKp e 27,2 ± 2,4 x 10³ MEP.

Resultados

A análise fenotípica das células identificadas como MEP e MKp foram realizadas por citometria de fluxo. As células foram rotuladas com anticorpos conjugados de fluorescência para CD41a e CD42c, marcadores clássicos das linhagens megacariocíticas e plaquetas. Ambos os marcadores foram expressos pelas células da população de MKp, enquanto esses marcadores ainda não foram detectados na superfície das células da população do MEP(Figura 4Ai,4Aii). Poliploidia é um...

Discussão

O método descrito neste artigo permite a extração e purificação do mouse MEP e MKp. Um parâmetro importante na otimização do protocolo foi a obtenção de número suficiente de células compatíveis com a maioria dos ensaios moleculares e celulares. A prática geral da coleta de ossos de camundongos para extração de células hematopoiéticas geralmente consiste na colheita dos fêmures e tíbias de cada rato. O osso pélvico, outra fonte de material hematopoiético, é, portanto, muitas vezes negligenciado. As ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
21-gauge needles	BD Microlance	301155
7AAD	Sigma-Aldrich	A9400
Antibody Gr-1-biotin	eBioscience	13-5931-85	Magnetic depletion
Antibody B220-biotin	eBioscience	13-0452-85	Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotin	eBioscience	13-0112-85	Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotin	eBioscience	13-0031-85	Magnetic depletion
Antibody CD4-biotin	eBioscience	13-9766-82	Magnetic depletion
Antibody CD5-biotin	eBioscience	13-0051-85	Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotin	eBioscience	13-0081-85	Magnetic depletion
Antibody TER119-biotin	eBioscience	13-5921-85	Magnetic depletion
Antibody CD127-biotin	eBioscience	13-1271-85	Magnetic depletion
Antibody CD45-FITC	eBioscience	11-0451-85	Cell sorting
Antibody CD45-PE	eBioscience	12-0451-83	Cell sorting
Antibody TER119-APC	eBioscience	17-5921-83	Cell sorting
Antibody CD45-PECy7	eBioscience	25-0451-82	Cell sorting
Antibody CD45-biotin	eBioscience	13-0451-85	Cell sorting
Antibody CD9-FITC	eBioscience	11-0091-82	Cell sorting
Antibody  c-kit-APC	eBioscience	17-1171-83	Cell sorting
Antibody Sca-1-PE	eBioscience	12-5981-83	Cell sorting
Antibody CD16/32-PE	eBioscience	12-0161-83	Cell sorting
Antibody CD150-PECy7	eBioscience	25-1502-82	Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Dissection pad	Fisher Scientific	10452395
DPBS	Life Technologies	14190-094
Ethanol	vWR Chemicals	83813.360
Forceps	Euronexia	P-120-AS
Glass pasteur pipette	Dutscher	42011
Magnet :  DynaMag-5	Thermo Fisher Scientific	12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG	Thermo Fisher Scientific	11035
Megacult	Stemcell technologies	#04970
MethoCult SF M3436	Stemcell technologies	#03436
Newborn Calf Serum	Dutscher	50750-500
Red Cell Lysis solution	BD Bioscience	555899
Scalpels	Fisher Scientific	12308009
Scissors	Euronexia	C-165-ASB
Sterile 1 mL syringes	BD Bioscience	303172
Sterile 15mL tubes	Sarstedt	62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubes	Falcon	352063
Sterile 5mL polystyrene tubes	Falcon	352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer cap	Falcon	352235
Sterile petri dish	Falcon	353003
Streptavidin-APC-Cy7	BD Biosciences	554063	Cell sorting
Tube roller	Benchmark Scientific	R3005