Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Riepilogo

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Abstract

I megacariociti del midollo osseo sono grandi cellule poliploidi che assicurano la produzione di piastrine nel sangue. Derivano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la megacariopoiesi. Le fasi finali di questo processo sono complesse e coinvolgono classicamente i progenitori bipotenti megacariociti-eritrociti (MEP) e i progenitori unipotenti dei megacariociti (MKp). Queste popolazioni precedono la formazione di megacariociti in buona fede e, come tali, il loro isolamento e caratterizzazione potrebbero consentire l'analisi robusta e imparziale della formazione di megacariociti. Questo protocollo presenta in dettaglio la procedura per raccogliere cellule ematopoietiche dal midollo osseo di topo, l'arricchimento dei progenitori ematopoietici attraverso l'esaurimento magnetico e infine una strategia di selezione cellulare che produce popolazioni MEP e MKp altamente purificate. In primo luogo, le cellule del midollo osseo vengono raccolte dal femore, dalla tibia e anche dalla cresta iliaca, un osso che contiene un numero elevato di progenitori ematopoietici. L'uso di ossa della cresta iliaca aumenta drasticamente il numero totale di cellule ottenute per topo e contribuisce quindi a un uso più etico degli animali. Un esaurimento del lignaggio magnetico è stato ottimizzato utilizzando perle magnetiche a 450 nm che consentono una selezione cellulare molto efficiente mediante citometria a flusso. Infine, il protocollo presenta la strategia di etichettatura e gating per la cernita delle due popolazioni progenitrici di megacariociti altamente purificate: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim) e MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^bright ). Questa tecnica è facile da implementare e fornisce materiale cellulare sufficiente per eseguire i) caratterizzazione molecolare per una conoscenza più approfondita della loro identità e biologia, ii) saggi di differenziazione in vitro, che forniranno una migliore comprensione dei meccanismi di maturazione dei megacariociti, o iii) modelli in vitro di interazione con il loro microambiente.

Introduzione

Le piastrine del sangue sono prodotte dai megacariociti. Queste grandi cellule poliploidi si trovano nel midollo osseo e come per tutte le cellule del sangue sono derivate da cellule staminali ematopoietiche (HSC)¹. La via classica di produzione dei megacariociti nel midollo osseo ha origine da HSC e prevede la generazione di diversi progenitori che limitano progressivamente il loro potenziale di differenziazione². Il primo progenitore che firma l'impegno per la linea megacariocitica è il Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progenitore bipotente in grado di produrre sia cellule eritroidi che megacariociti

Protocollo

I protocolli che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Numero di permesso: E67-482-10).

1. Raccolta delle ossa del mouse

1. Sacrificare l'animale nel rispetto delle linee guida istituzionali.
   NOTA: I dati presentati in questo manoscritto sono stati ottenuti da topi C57Bl/6 di età da 8 a 12 settimane. Il numero di cellule ottenute e la frequenza delle popolazioni citate possono variare con l'età e il ceppo di topo.
2. Spruzzare il corpo ....

Risultati

L'analisi fenotipica delle cellule identificate come MEP e MKp è stata eseguita mediante citometria a flusso. Le cellule sono state etichettate con anticorpi coniugati a fluorescenza contro CD41a e CD42c, marcatori classici delle linee megacariocitiche e piastriniche. Entrambi i marcatori sono stati espressi dalle cellule della popolazione MKp mentre questi marcatori non sono ancora stati rilevati sulla superficie delle cellule della popolazione MEP (Figura 4Ai,4Aii). La po.......

Discussione

Il metodo descritto in questo articolo consente l'estrazione e la purificazione di MEP e MKp di topo. Un parametro importante nell'ottimizzazione del protocollo è stato quello di ottenere un numero sufficiente di cellule che sarebbe stato compatibile con la maggior parte dei saggi molecolari e cellulari. La pratica generale della raccolta delle ossa di topo per l'estrazione delle cellule ematopoietiche di solito consiste nella raccolta sia dei femori che delle tibie di ciascun topo. L'osso pelvico, un'altra fonte di mat.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
21-gauge needles	BD Microlance	301155
7AAD	Sigma-Aldrich	A9400
Antibody Gr-1-biotin	eBioscience	13-5931-85	Magnetic depletion
Antibody B220-biotin	eBioscience	13-0452-85	Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotin	eBioscience	13-0112-85	Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotin	eBioscience	13-0031-85	Magnetic depletion
Antibody CD4-biotin	eBioscience	13-9766-82	Magnetic depletion
Antibody CD5-biotin	eBioscience	13-0051-85	Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotin	eBioscience	13-0081-85	Magnetic depletion
Antibody TER119-biotin	eBioscience	13-5921-85	Magnetic depletion
Antibody CD127-biotin	eBioscience	13-1271-85	Magnetic depletion
Antibody CD45-FITC	eBioscience	11-0451-85	Cell sorting
Antibody CD45-PE	eBioscience	12-0451-83	Cell sorting
Antibody TER119-APC	eBioscience	17-5921-83	Cell sorting
Antibody CD45-PECy7	eBioscience	25-0451-82	Cell sorting
Antibody CD45-biotin	eBioscience	13-0451-85	Cell sorting
Antibody CD9-FITC	eBioscience	11-0091-82	Cell sorting
Antibody  c-kit-APC	eBioscience	17-1171-83	Cell sorting
Antibody Sca-1-PE	eBioscience	12-5981-83	Cell sorting
Antibody CD16/32-PE	eBioscience	12-0161-83	Cell sorting
Antibody CD150-PECy7	eBioscience	25-1502-82	Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Dissection pad	Fisher Scientific	10452395
DPBS	Life Technologies	14190-094
Ethanol	vWR Chemicals	83813.360
Forceps	Euronexia	P-120-AS
Glass pasteur pipette	Dutscher	42011
Magnet :  DynaMag-5	Thermo Fisher Scientific	12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG	Thermo Fisher Scientific	11035
Megacult	Stemcell technologies	#04970
MethoCult SF M3436	Stemcell technologies	#03436
Newborn Calf Serum	Dutscher	50750-500
Red Cell Lysis solution	BD Bioscience	555899
Scalpels	Fisher Scientific	12308009
Scissors	Euronexia	C-165-ASB
Sterile 1 mL syringes	BD Bioscience	303172
Sterile 15mL tubes	Sarstedt	62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubes	Falcon	352063
Sterile 5mL polystyrene tubes	Falcon	352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer cap	Falcon	352235
Sterile petri dish	Falcon	353003
Streptavidin-APC-Cy7	BD Biosciences	554063	Cell sorting
Tube roller	Benchmark Scientific	R3005