Выделение прародителей мегакариоцитов мыши

Резюме

Этот метод описывает очистку с помощью проточной цитометрии MEP и MKp от бедренных костей, большеберцовой кости и костей таза мышей.

Аннотация

Мегакариоциты костного мозга представляют собой крупные полиплоидные клетки, обеспечивающие выработку тромбоцитов крови. Они возникают из гемопоэтических стволовых клеток через мегакариопоэз. Заключительные этапы этого процесса сложны и классически включают бипотентные мегакариоцитарно-эритроцитарные прародители (MEP) и унипотентные мегакариоцитарные прародители (MKp). Эти популяции предшествуют образованию настоящих мегакариоцитов, и, как таковые, их выделение и характеристика могут позволить провести надежный и непредвзятый анализ образования мегакариоцитов. В этом протоколе подробно представлена процедура сбора кроветворных клеток из костного мозга мыши, обогащение гемопоэтических прародителей путем магнитного истощения и, наконец, стратегия сортировки клеток, которая дает высокоочищенные популяции MEP и MKp. Во-первых, клетки костного мозга собираются из бедренной кости, большеберцовой кости, а также подвздошного гребня, кости, которая содержит большое количество кроветворных прародителей. Использование костей подвздошного гребня резко увеличивает общее количество клеток, получаемых на мышь, и, таким образом, способствует более этичному использованию животных. Истощение магнитной линии было оптимизировано с использованием магнитных шариков 450 нм, что позволило очень эффективно сортировать ячейки с помощью проточной цитометрии. Наконец, в протоколе представлена стратегия маркировки и сортировки двух высокоочищеных популяций-прародителя мегакариоцитов: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim)и MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^bright ). Этот метод прост в реализации и обеспечивает достаточно клеточного материала для выполнения i) молекулярной характеристики для более глубокого знания их идентичности и биологии, ii) анализов дифференцировки in vitro, которые обеспечат лучшее понимание механизмов созревания мегакариоцитов, или iii) in vitro моделей взаимодействия с их микросредой.

Введение

Тромбоциты крови вырабатываются мегакариоцитами. Эти крупные полиплоидные клетки расположены в костном мозге и, как и все клетки крови, получены из гемопоэтических стволовых клеток (HSC)^1. Классический путь производства мегакариоцитов в костном мозге берет свое начало от ГСК и предполагает генерацию различных прародителей, которые постепенно ограничивают их дифференцировальный потенциал^2. Первым прародителем, подписавшим обязательство по мегакариоцитарной линии, является мегакариоцит-эритроцитарный прародитель (MEP), бипотентный прародитель, способный продуцировать как эритроидные^{клетки,}так и мегакариоциты^3,4,5. Затем MEP производит унипотентный предшественник / предшественник (MKp), который будет дифференцироваться в зрелый мегакариоцит, способный продуцировать тромбоциты. Механизмы, участвующие в генерации этих прародителей, а также их дифференцировка и созревание в мегакариоциты сложны и понятны лишь частично. Кроме того, гетерогенность популяции MEP с точки зрения потенциала дифференцировки и внутреннего уровня приверженности этих клеток все еще неясна. Чтобы расшифровать эти процессы, важно получить (или иметь доступ) очищенные популяции MEP и MKp для тонкомолекулярного и одноклеточного анализа.

Несколько исследований продемонстрировали особые комбинации маркеров клеточной поверхности для идентификации прародителей, приверженных мегакариоцитарной линии у мышей^6,7,8. Из них был разработан метод, позволяющий очищать MEP и MKp от мышей. Этот метод был оптимизирован для получения клеток в достаточном количестве и качестве для большого количества анализов. С учетом этических соображений и для того, чтобы свести к минимуму количество животных, участвующих в экспериментах, мы собрали костный мозг из бедренной и большеберцовой костей, а также из подвздошного гребня. Эта кость содержит высокую частоту и количество кроветворных прародителей и большую часть времени повреждается во время длительного сбора костной ткани. Здесь представлен подробный метод надежного сбора этой кости.

Вторым критерием оптимизации является создание высокоочищеных клеточных популяций. Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) является методом выбора для получения очищенных популяций интересующих клеток. Тем не менее, низкие урожаи достигаются, когда интересуемая популяция клеток очень редка. Таким образом, необходимы процедуры обогащения. В этом протоколе была выбрана процедура отрицательного отбора с использованием магнитных шариков.

протокол

Протоколы с участием животных были выполнены в соответствии с Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Номер разрешения: E67-482-10).

1. Коллекция мышиных костей

1. Приносить животное в жертву в соответствии с институциональными рекомендациями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, представленные в этой рукописи, были получены от мышей C57Bl/6 в возрасте от 8 до 12 недель. Количество полученных клеток и частота цитируемых популяций могут варьироваться в зависимости от возраста и штамма мыши.
2. Опрыскиваем тело 70% этанолом.
3. С помощью ножниц сделайте 0,5-1 см разрез кожи перпендикулярно позвоночнику и разорвите кожу по всему телу. Стяните кожу с нижней части тела и удалите кожу.
4. Поместите животное на подушечку для рассечения лицевой стороной вниз. Найдите тазовые кости, скользя пальцами по открытому позвоночнику сверху вниз. Чтобы найти подвздошный гребень, определите небольшую шишку в поясничной области вблизи задних конечностей (переднесуберная область тазовой кости). На рисунке 1A,B представлено схематическое изображение анатомии мыши.

Рисунок 1:Анатомия мыши. (A) Рентген мыши, показывающий задние кости. Обратите внимание на пространство между тазовой костью и позвоночником (желтая стрелка), куда необходимо вставить ножницы, чтобы правильно отделить задние конечности от тела мыши (желтая пунктирная линия). (B)Схематическое изображение костей, богатых костным мозгом, представляющих интерес. Тазовые кости изображены красным цветом, бедренные кости фиолетовым, а большеберцовые кости — зеленым. (C) Схематическое изображение тазовой кости мыши. Подвздошная кость соответствует богатой костному мозгу части тазовой кости и выделена красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Поместите ножницы параллельно позвоночнику против позвонков и вплотную к бугоре подвздошного гребня. Приступайте к разрезанию мышц вдоль стороны позвоночника над тазовой костью, скользя ножницами вдоль позвонков вплоть до хвоста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот первый участок мышц также может быть выполнен с помощью лезвия скальпеля.
6. Поместите ножницы параллельно позвоночнику и приступайте к разрезанию между позвонками и подвздошным гребнем, как показано желтой пунктирной линией на рисунке 1А. Убедитесь, что вы остаетесь как можно ближе к позвонкам. Отрежьте оставшиеся мышцы, чтобы отсоедать конечность от тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивления должно быть практически нет.
7. Повторите с другой стороны, чтобы отсоедать вторую конечность.
8. Перенесите конечности на чистую поверхность и выбросьте остальную часть тела в соответствии с институциональными рекомендациями.
9. Обнажите тазовые, бедренные и большеберцовые кости, удалив как можно больше окружающих тканей с помощью щипцов и скальпелей.
10. Осторожно вывихнуть головку бедренной кости от тазовой кости, удерживая дистальный конец бедренной кости щипцами, осторожно нарезая мышцы вокруг сочленения скальпелями. Пошевелить костями, чтобы облегчить вывих.
11. Соскоблите оставшуюся мышцу с тазовой кости и разрежьте скальпелем в середине полости, которая держала головку бедренной кости. Подвздошная кость сохраняется, так как она богата кроветворными прародителями, в то время как треугольная очень тонкая сторона кости отбрасывается, как показано на рисунке 1C.
12. Удалите остаточные ткани вокруг подвздошной кости скальпелем и поместите очищенную кость в стерильный PBS, дополненный 2% сывороткой для новорожденных телят (PBS-2% NBCS).
13. С помощью ножниц отрежьте стопу от ноги на лодыжке.
14. Удерживайте нижнюю часть большеберцовой кости щипцами и соскоблите мышцу вверх к колену. Отбросьте малоберцовые кости и перережьте скальпелем большеберцовое плато. Поместите большеберцовую кость в стерильный PBS-2%NBCS.
15. Удалите остаточные ткани вокруг бедренной кости скальпелями.
16. Удерживать верхнюю сторону бедренной кости щипцами; поместите лезвие скальпеля у основания коленной чашечки. Приложить силу к коленной чашечке параллельно бедренной кости до отслоения коленной чашечки. Поместите бедренную комть в стерильный PBS-2%NBCS. Снятие коленной чашечки обеспечивает чистый доступ для введения иглы для промывки костного мозга.

2. Магнитное истощение положительных клеток линии

1. В ламинарной проточная тумба переложите кости в стерильную чашку Петри, наполненную стерильным PBS-2%NBCS.
2. Скальпелем отрезают головку бедренной кости.
3. Заполните шприц 1 мл стерильным PBS-2%NBCS и прикрепите иглу 21 Г к выходу.
4. Наполните 5 мл полипропилеленовой трубки 2 мл стерильного PBS-2%NBCS.
5. Удерживать бедренную комку щипцами; аккуратно вставьте иглу в канавку, оставшуюся после снятия коленной чашечки. Приложите вращение к игле во время введения, чтобы избежать затыкания иглы. Убедитесь, что игла полностью вставлена в кость до скоса.
6. Перенесите кость иглой в трубку, содержащую 2 мл PBS-2%NBCS. Дозируют и аспирируют PBS-2%NBCS из шприца до тех пор, пока кость не очистится.
7. Извлеките иглу из бедренной кости и вставьте ее в отверстие на противоположной стороне, где была головка бедренной кости. Снова дозируют и аспирируют буфер и выбрасывают кость.
8. За подвздошный гребень и большеберцовую кость держат кость щипцами; аккуратно вставьте иглу в открытую сторону. Приложите вращение к игле во время введения, чтобы избежать затыкания иглы. Убедитесь, что игла полностью вставлена в кость до скоса. Перенесите кость иглой в трубку, содержащую 2 мл PBS-2%NBCS. Дозируют и аспирируют PBS-2%NBCS из шприца до тех пор, пока кость не очистится. Выбросьте кости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кости до трех мышей могут быть смыты в одну и ту же трубку. Объедините суспензии клеток.
9. Пропустите объединенную клеточную суспензию через крышку клеточного сетчатого фильтра размером 40 мкм, помещенную на стерильную полистирольную трубку 5 мл.
10. Приступайте к подсчету ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток может быть выполнен с помощью любого гемоцитометра, с использованием Trypan Blue для оценки жизнеспособности или с помощью любого автоматизированного счетчика клеток. Одна мышь обычно дает 105 ± 7 x 10⁶ ячеек.
11. Отберите в сторону 100 мкл клеточной суспензии в качестве общего костного мозга, добавьте 500 мкл PBS-2% NBCS и сохраните его на льду для процедуры окрашивания.
12. Гранулируют фильтрованную суспензию центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбрасывают супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эритроциты могут быть лизированы путем повторного использования гранулы в свежеприготовленном растворе лизиса^(1/10-я часть в dH2O). Инкубировать в течение 5 мин до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной и ярко-красной и добавить 10 объемов стерильного ПБС. Приступают к промывке клеток в PBS-2%NBCS центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Будьте осторожны при удалении супернатанта, так как ячейка гранулы очень рыхлые. Выполните вторую промывку PBS-2%NBCS центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C и перейдите к шагу 2.13.
13. Повторно суспендируют клеточную гранулу в свежеприготовленном коктейле первичных антител с соотношением 100 мкл на 1 х 10⁷ клеток. Инкубировать на льду в течение 30-45 мин.

Антитело	Разбавление
Гр-1-биотин	1:500
B220-биотин	1:500
Мак-1-биотин	1:500
CD3-биотин	1:500
CD4-биотин	1:500
CD5-биотин	1:500
CD8-биотин	1:500
TER119-биотин	1:1000
CD127-биотин	1:500

Таблица 1.

14. Отложите 10 мкл клеточной суспензии в стерильную полистирольную трубку 5 мл с маркировкой Lin-Pos Fraction. Добавьте 90 мкл PBS-2%NBCS и сохраните его на льду для процедуры окрашивания.
15. Продолжают промывать клетки дважды стерильным PBS-2%NBCS центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Обязательно сделайте последнюю стирку в стерильной полипропиленовой трубке 5 мл.
16. Во время этапов стирки подготовьте бусины к магнитному истощению.
    1. Повторно суспендирование бусин во флаконе путем тщательного вихря в течение 30 с.
    2. Перенесите объем шариков, соответствующий двум шарикам на ячейку-мишень, в полипропиленовую трубку объемом 5 мл.
    3. Дважды вымойте бусины PBS-2%NBCS, поместив трубку на магнит и сняв буфер для стирки с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера.
    4. Повторное суспендирование шариков в 500 мкл стерильного PBS-2NBCS%.
17. Повторно суспендировать гранулы меченых клеток в 250 мкл шариков и аккуратно перемешать в течение 5 мин на льду. Добавьте 2 мл стерильного PBS-2%NBCS и аккуратно перемешайте. Не встряхивайте трубку.
18. Поместите трубку на магнит на 2 мин.
19. Приступайте к сбору немагнитной фракции стерильной стеклянной пипеткой Пастера и добавляйте ее на оставшиеся 250 мкл магнитных шариков. Запечатайте трубку парапленкой.
20. Поместите трубку на трубчатый валик на 20 мин при 4 °C.
21. Добавьте 2 мл стерильного PBS-2%NBCS и аккуратно перемешайте. Не встряхивайте трубку.
22. Поместите трубку в магнит на 2 мин.
23. Приступайте к сбору немагнитной фракции в стерильную полипропиленовую трубку 5 мл с маркировкой Lin-Neg Fraction со стерильной стеклянной пипеткой Пастера.
24. Гранулируют ячейки центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант.
25. Повторное суспендирование немуагнитных клеток в 500 мкл стерильного PBS-2%NBCS.
26. Приступайте к подсчету ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна мышь обычно дает 3,9 ± 1,1 x 10⁶ ячеек. Типичные окрашивания линий до и после истощения представлены на рисунке 2B.

3. Клеточная сортировка прародителей мегакариоцитов с помощью проточной цитометрии

1. Возьмите трубки с маркировкой Total Bone Bone Marrow, Lin-Pos Fraction и Lin-Neg Fraction.
2. Приступайте к разделению содержимого трубки Total Bone BoneRow поровну на шесть стерильных полистирольных трубок объемом 5 мл. Маркировка тубок цифрами 1-6.
3. Приступайте к маркировке трубки Lin-Pos Fraction цифрой 7.
4. Приступайте к расщеплению содержимого трубки Lin-Neg Fraction следующим образом.
   1. Переложить 50 мкл в стерильную 5 мл полистирольную трубку, содержащую 250 мкл стерильного PBS-2%NBCS. Затем разделите его содержание поровну на 3 стерильные полистирольные трубки по 5 мл. Маркируют эти трубки цифрами 8-10.
   2. Оставшимся 450 мкл клеточной суспензии Lin-Neg Fraction соответствует трубке с номером 11.
5. Добавьте антитела к пробиркам, как описано в таблице 2.

Тюбик	Ярлык	Коктейль антител
Общий костный мозг
1	Незапятнанный контроль
2	Управление с одним окрашиванием	CD45-FITC (1/200)
3	Управление с одним окрашиванием	CD45-PE (1/200)
4	Управление с одним окрашиванием	ТЕР119-БТР (1/200)
5	Управление с одним окрашиванием	CD45-PECy7 (1/200)
6	Управление с одним окрашиванием	CD45-APC-Cy7 биотин (1/200)
Фракция Лин-Пос
7	Управление с одним окрашиванием	Управление с одним окрашиванием. Стрептавидин-БТР-Cy7 (1/500)
Фракция Лин-Нег
8	Управление FMO FITC	c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Стрептавидин-APC-Cy7 (1/500)
9	Управление FMO PE	CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Стрептавидин-APC-Cy7 (1/500)
10	Управление FMO PECy7	CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Стрептавидин-APC-Cy7 (1/500)
11	Положительная труба для сортировки	CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Стрептавидин-APC-Cy7 (1/500)

Таблица 2.

6. Насиживают на льду в течение 30-45 мин в темное время суток.
7. Промыть клетки стерильным PBS-2%NBCS центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
8. Повторно суспендируют гранулы клеток следующим образом.
   1. Для пробирок от 1 до 10 повторно суспендируют гранулу в 300 мкл стерильного PBS-2%NBCS, дополненного 7AAD (2,5 мкг/мл финала) (PBS-7AAD).
      ВНИМАНИЕ: 7AAD является интеркалантом ДНК и поэтому должен обрабатываться с помощью соответствующих СИЗ (перчаток).
   2. Для трубки 11 повторно суспендируют гранулу в стерильном PBS-7AAD в максимальной концентрации 5 х^{10 6} клеток на мл и минимальном объеме 1 мл.
9. Подготовьте две полипропиленовые коллекторные трубки с маркировкой MEP и MKp, содержащие 2 мл PBS-2%NBCS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, клетки могут быть собраны в культуральная среда или буфер лизиса клеток в зависимости от последующего применения для отсортированных клеток. Использование полистирольных трубок не рекомендуется из-за возможного вмешательства в заряженные капли, содержащие интересующих клетки.
10. Держите все трубки на льду в темноте.
11. Перейдите к настройке сортировщика ячеек.
    1. Используйте трубки 1-7 для установки напряжения и компенсации, трубки 7-10 для определения сортировочных затворов для интересующих популяций клеток и трубку 11 для сортировки ячеек.
12. Первые шаги стратегии гастина направлены на исключение дублетов и мертвых клеток из анализа, как описано на рисунке 3. Определите одиночные жизнеспособные ячейки и отобразите точечный график SSC-vs Lin-APC-Cy7, чтобы подтвердить эффективность истощения линии. Из Lin^- ячеек устанавливается затвор для отбора ячеек положительных для c-kit и отрицательных или тусклых для Sca-1 и CD16/32. Точечный график экспрессии CD9 против CD150 для выбранных клеток позволяет идентифицировать четыре популяции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки MEP и MKp положительны для CD150. Можно определить три уровня экспрессии для CD9 (neg, dim и high). MKp экспрессирует высокий уровень CD9 и MEP экспресс CD9 при промежуточном уровне интенсивности флуоресценции. Популяция MEP соответствует Lin^- c-Kit⁺ Sca-1-CD16/32^-/dim CD150⁺ CD9^dim, а популяция MKp соответствует Lin^- c-Kit⁺ Sca-1-CD16/32^-/dim CD150⁺ CD9^яркий. Различение между CD9 высокими и CD9 тусклыми популяциями для CD150-положительных клеток установлено на основе максимального уровня экспрессии CD9 в отрицательной популяции CD150. Одна мышь обычно дает 5,3 ± 0,6 x 10³ МКп и 27,2 ± 2,4 x 10³ MEP.

Результаты

Фенотипический анализ клеток, идентифицированных как MEP и MKp, проводили методом проточной цитометрии. Клетки были помечены флуоресцентными конъюгированными антителами к CD41a и CD42c, классическим маркерам мегакариоцитарных и тромбоцитарных линий. Оба маркера были экспрессированы клетка?...

Обсуждение

Способ, описанный в данной работе, позволяет экстракцию и очистку мышиных MEP и MKp. Важным параметром в оптимизации протокола было получение достаточного количества клеток, которые были бы совместимы с большинством молекулярных и клеточных анализов. Общая практика сбора костной ткани м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
21-gauge needles	BD Microlance	301155
7AAD	Sigma-Aldrich	A9400
Antibody Gr-1-biotin	eBioscience	13-5931-85	Magnetic depletion
Antibody B220-biotin	eBioscience	13-0452-85	Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotin	eBioscience	13-0112-85	Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotin	eBioscience	13-0031-85	Magnetic depletion
Antibody CD4-biotin	eBioscience	13-9766-82	Magnetic depletion
Antibody CD5-biotin	eBioscience	13-0051-85	Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotin	eBioscience	13-0081-85	Magnetic depletion
Antibody TER119-biotin	eBioscience	13-5921-85	Magnetic depletion
Antibody CD127-biotin	eBioscience	13-1271-85	Magnetic depletion
Antibody CD45-FITC	eBioscience	11-0451-85	Cell sorting
Antibody CD45-PE	eBioscience	12-0451-83	Cell sorting
Antibody TER119-APC	eBioscience	17-5921-83	Cell sorting
Antibody CD45-PECy7	eBioscience	25-0451-82	Cell sorting
Antibody CD45-biotin	eBioscience	13-0451-85	Cell sorting
Antibody CD9-FITC	eBioscience	11-0091-82	Cell sorting
Antibody  c-kit-APC	eBioscience	17-1171-83	Cell sorting
Antibody Sca-1-PE	eBioscience	12-5981-83	Cell sorting
Antibody CD16/32-PE	eBioscience	12-0161-83	Cell sorting
Antibody CD150-PECy7	eBioscience	25-1502-82	Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Dissection pad	Fisher Scientific	10452395
DPBS	Life Technologies	14190-094
Ethanol	vWR Chemicals	83813.360
Forceps	Euronexia	P-120-AS
Glass pasteur pipette	Dutscher	42011
Magnet :  DynaMag-5	Thermo Fisher Scientific	12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG	Thermo Fisher Scientific	11035
Megacult	Stemcell technologies	#04970
MethoCult SF M3436	Stemcell technologies	#03436
Newborn Calf Serum	Dutscher	50750-500
Red Cell Lysis solution	BD Bioscience	555899
Scalpels	Fisher Scientific	12308009
Scissors	Euronexia	C-165-ASB
Sterile 1 mL syringes	BD Bioscience	303172
Sterile 15mL tubes	Sarstedt	62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubes	Falcon	352063
Sterile 5mL polystyrene tubes	Falcon	352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer cap	Falcon	352235
Sterile petri dish	Falcon	353003
Streptavidin-APC-Cy7	BD Biosciences	554063	Cell sorting
Tube roller	Benchmark Scientific	R3005