JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

Abstract

מודל קרום התא הם כלי סינון שימושי עם יישומים החל גילוי סמים מוקדם מחקרים רעילות. קרום התא מהווה מחסום מגן חיוני לכל סוגי התאים, המפריד בין הרכיבים התאיים הפנימיים לסביבה החוץ-תאית. ממברנות אלה מורכבות בעיקר מביבאי שומנים, המכיל קבוצות ראש הידרופיליות החיצוניות וקבוצות זנב הידרופוביות פנימיות, יחד עם חלבונים וכולסטרול שונים. הרכב ומבנה השומנים עצמם ממלאים תפקיד מכריע בוויסות התפקוד הביולוגי, כולל אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה התאית, שעשויה להכיל תרופות, רעלים ביולוגיים וטפילים סביבתיים. במחקר זה, שיטות לגיבוש חד שומנים, מרובה שומנים תומכים ותא מושעה מחקה bilayers שומנים מתוארים. בעבר, פוספטידילכולין חד שומני (PC) bilayers שומנים, כמו גם רב שומנים שליה טרופיבלסט בהשראת bilayers שומנים פותחו לשימוש בהבנת אינטראקציות מולקולריות. כאן יוצגו שיטות להשגת שני סוגי דגמי הדו-שכבתיה. עבור תאים מחקים דו-שכבתיים מרובי שומנים, הרכב השומנים הרצוי נקבע תחילה באמצעות מיצוי שומנים מתאים ראשיים או מקווי תאים ואחריו ספקטרומטריה נוזלית של כרומטוגרפיה-מסה (LC-MS). באמצעות קומפוזיציה זו, שלפוחיות השומנים מפוברקות בשיטת הידרציה ושחול סרט דק ואת הקוטר ההידרודינמי שלהם ואת פוטנציאל זטה מאופיינים. לאחר מכן ניתן ליצור דו-שכבתי שומנים נתמכים ומושעים באמצעות מיקרו-איזון קריסטל קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) ועל קרום נקבובי לשימוש בבדיקת חדירות מקבילה של קרום מלאכותי (PAMPA), בהתאמה. התוצאות הייצוגיות מדגישות את הרבייה והרבגוניות של דגמי דו-שכבתי השומנים של קרום התא במבחנה. השיטות המוצגות יכולות לסייע בהערכה מהירה ומקלה של מנגנוני האינטראקציה, כגון חדירות, ספיחה והטמעה, של מולקולות שונות ומקרומולקולות עם קרום התא, המסייעות בהקרנת מועמדים לתרופות וחיזוי רעילות תאית פוטנציאלית.

Introduction

קרום התא, המורכב בעיקר פוספוליפידים, כולסטרול, וחלבונים, הוא מרכיב מכריע של כל התאים החיים1. עם ארגון מונע על ידי אמפיפיליות שומנים בדם, קרום התא מתפקד כמחסום מגן ומסדיר כיצד התא אינטראקציה עם הסביבה שמסביב2. מספר תהליכים תאיים תלויים בהרכב השומנים והחלבון של הממברנה1,2. לדוגמה, אינטראקציות קרום התא חשובות עבור משלוח סמים יעיל3. תרופות, ביולוגיות, ננו-חומרים, רעלנים ביולוגיים ורעילים סביבתיים יכולים להשפיע על שלמות קרום התא, ובכך להשפיע על תפקוד התא4. בניית תאי במבחנה מחקה מודלים ממברנה המבוססים על הרכב השומנים של קרום התא יש פוטנציאל לספק כלים facile כדי לשפר מאוד את המחקר של ההשפעה הפוטנציאלית של חומרים אלה על תאים.

דו-שכבתי השומנים לדוגמה כוללים שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ובולייה שומנים מושעים. bilayers שומנים נתמכים הם מודל של קרום התא פוספוליפיד נפוץ ביישומי ביוטכנולוגיה שבו שלפוחיות השומנים נקרעים על חומר מצע נתמך5,6,7,8,9. טכניקה נפוצה אחת המשמשת לניטור היווצרות bilayer היא מיקרו-איזון גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), הבוחן את ספיחת שלפוחיות בהשוואה למאפיינים הנוזליים בתפזורת במקום8,10,11,12,13,14 . בעבר, QCM-D שימש כדי להדגים כי בתנאי זרימה, פעם כיסוי ארסית קריטית של שלפוחיות שומנים (PC) מושגת על פני השטח, הם נקרעים באופן ספונטני לתוך bilayers שומנים נוקשים15. עבודה קודמת חקרה גם היווצרות דו-שכבתית שומנים נתמכת עם הרכבים שומנים שונים16, שילוב של חלבונים שומניםבדם 17,18,19, וניצול כריות פולימר20, מניב bilayers שומנים נתמכים מסוגל לחקות היבטים שונים של תפקוד קרום התא.

bilayers השומנים שימשו כדי לחקות מחסומים ביולוגיים שונים מן תת התא לרמות איברים כולל מיטוכונדריון, תא דם אדום, קרום תא הכבד על ידי שינוי רכיבי פוספוליפיד, כולסטרול, וגליקולפיד21. שלל רב שומנים מורכבים יותר אלה עשויים לדרוש שיטות נוספות כדי להשיג קרע ארסי, בהתאם להרכב השומנים. לדוגמה, מחקרים קודמים השתמשו בפפטיד α-סלילי (AH) הנגזר מהחלבון הלא מובנה של נגיף הפטיטיס C 5A כדי לגרום להיווצרות דו-שכבתית על ידי ערעור שלטי השומנים הפולאים22,23. באמצעות פפטיד AH זה, דו-שכבות שומנים נתמכות המחקות תאי שליה נוצרו בעבר24. הפוטנציאל הגדול של bilayers שומנים נתמך עבור יישומים ביו-רפואיים הוכח עם חקירות המשתרעות על פני מולקולרית וננו-חלקיקים25,26, אינטראקציות רעילות סביבתיות27, הרכבת חלבון ופונקציה17,18,19, סידור פפטיד והכנסת28,29, הקרנת סמים30,ופלטפורמות מיקרופלואידיות31.

bilayers שומנים מושעים שימשו למחקרי הקרנה פרמצבטית באמצעות בדיקת חדירות קרום מלאכותי מקביל (PAMPA) שבו bilayer שומנים מושעה על פני תוספת הידרופובית נקבובי32,33,34,35. מודלים שומנים PAMPA פותחו עבור ממשקים ביולוגיים שונים כולל הדם - מוח, buccal, מעיים, וממשקים transdermal36. על ידי שילוב הן של דו-שכבתי השומנים הנתמכות והן טכניקות PAMPA, ספיחה, חדורות והטמעה של תרכובות בתוך רכיבי השומנים של רקמה רצויה או סוג התא ניתן ללמוד ביסודיות.

פרוטוקול זה מתאר את הייצור והיישום של מודלים bilayer השומנים קרום התא במבחנה לחקור מספר אינטראקציות מולקולריות. הכנת דו-לשוניים חד-שומניים ורב-שומנים הנתמכים והשעייתם של שכבות השומנים מפורטת. כדי ליצור דו-שכבתית שומנים נתמכת, שלפוחיות שומנים מפותחות לראשונה באמצעות שיטות הידרציה ושחול סרט דק ואחריו אפיון פיזיקוכימי. היווצרות של דו-שכבתי שומנים נתמך באמצעות ניטור QCM-D ייצור של קרומי שומנים מושעים לשימוש PAMPA נדון. לבסוף, שלל רב שומנים להתפתחות של ממברנות מורכבות יותר חיקוי תאים נבדקים. באמצעות שני סוגי ממברנות שומנים מפוברקות, פרוטוקול זה מדגים כיצד כלי זה יכול לשמש לחקר אינטראקציות מולקולריות. בסך הכל, טכניקה זו בונה תאים מחקים שכבות שומנים עם רבייה גבוהה ורבגוניות.

Protocol

1. פיתוח שלשלפי שומנים חד-שומניים

  1. שיטת הידרציה סרט דק
    1. הכנה ואחסון של פתרונות מלאי שומנים בדם
      הערה: כל השלבים באמצעות כלורופורם צריכים להתבצע במכסה אדים כימי. כלורופורם תמיד צריך להיות pipetted באמצעות טיפים פיפטה סיבי פחמן בטוח ממס. פתרונות המכילים כלורופורם תמיד צריך להיות מאוחסן בבקבוקונים זכוכית.
      1. הכן פתרון מלאי שומנים 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת הנפח המתאים של כלורופורם לתוך הבקריאל המכיל את אבקת השומנים ומערבבים היטב. לדוגמה, להוסיף 20 מ"ל של כלורופורם ל 200 מ"ג של L-α-פוספטידילכולין (ביצה, עוף) (eggPC). פתרון המניות עשוי להיעשות בריכוז שונה במידת הצורך.
        הערה: אם השומנים אבקה אוחסנה אמפולה, לאחר הוספת העברת כלורופורם בקבוקון זכוכית עם כובע מרופד פוליטרפלואורואתילן (PTFE).
      2. אוטמים את מכסה המצקה עם Parafilm ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
    2. היווצרות סרט שומנים יבשים
      1. הוסף את הנפח המתאים של תמיסה מלאי שומנים לתוך בקבוקון זכוכית נקי הדרוש לריכוז ארסיות סופית של 2.5 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, כדי ליצור 1 מ"ל של שלל מחשב ביצה ב 2.5 מ"ג / מ"ל, pipette 250 μL של פתרון ציר מחשב ביצה לתוך המשחקון.
        הערה: אמצעי האחסון המוכן עשוי להיות תלוי בתהליך ההבלטה הנמצא בשימוש (ראה שלב 1.3). הנפח המרבי המומלץ של האקספלודר הוא 1 מ"ל ואילו טווח עוצמת הקול הגדול של המהלל הוא 5-50 מ"ל.
      2. הסר כלורופורם מפתרון מלאי השומנים באמצעות זרם של גז N2 (ultrapure 5.0 כיתה).
      3. כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורופורם, חבר את סרט השומנים היבש לוואקום ולהשאיר לפחות 4 שעות.
        הערה: ניתן לעצור את התהליך כאן. אם סרט השומנים לא ישמש מיד לאחר ייבוש ואקום, יש לאחסן במתייבש עד לשימוש. ראינו כי אלה סרטי שומנים מניבים שלל איכות דומה לאחר שבוע אחד של אחסון בתנאים אלה; יש לחקור עוד יותר את איכות ההסתה בעקבות משכי אחסון ארוכים יותר.
    3. ביצוע הקפאה-הפשרת מערבולת מחזורים
      1. הכן פתרון חיץ נתרן כלורי (NaCl) של טריס המכיל 10 מ"ר של בסיס טריס ו-100 מ"ר של NaCl. Rehydrate סרט השומנים היבש עם הנפח הנדרש של חוצץ Tris NaCl כדי להניב ריכוז נצנית סופית של 2.5 מ"ג / מ"ל ומערבולת עבור כ 15-30 s.
      2. מעבירים את ההשעיה ההדבקה למיכל עם קרח יבש עד להקפאה, כ-30 דקות. לאחר המדגם קפוא לחלוטין, להפשיר את ההשעיה באמבט מים 30-40 מעלות צלזיוס. מערבולת השעיית ארסיה מופשרת.
        הערה: נוזל N2 עשוי לשמש במקום קרח יבש. מעבירים את ההשעיה הססנית לחנן נוזלי למשך 30 מעלות, ומיד מפשירים באמבט מים של 80 מעלות צלזיוס.
      3. חזור על שלב 1.1.3.2 4 פעמים נוספות, עבור סך של 5 מחזורי הפשרת-ההקפאה-מערבולת.
  2. שחול
    הערה: לאחר השלמת מחזורי הפשרת-ההקפאה-מערבולת, שלשלות multilamellar נוצרים. שחול מסייע בהפחתת גודל ופיתוח שלל חד-צדדי גדול.
    1. תהליך ההבלטה הקטן (1 מ"ל)
      1. נקו ביסודיות את כל מרכיבי המסלק באמצעות חומר ניקוי עדין במים אולטרה-תפירה ושטפו לפחות שלוש פעמים במים אולטרה-סברים המבטיחים את הסרת כל חומרי הניקוי. יבש עם גז N2.
      2. להרכיב את שתי תומכי הממברנה הפנימית וטבעות O (קוטר פנימי של 12.7 מ"מ; קוטר חיצוני של 15.2 מ"מ). מקם כל תמיכה בממברנה כך שטבעת ה-O פונה כלפי מעלה.
      3. יש להרטיב מסנן עם מים אולטרה-טורפים. מניחים אותו על משטח התמיכה בממברנה בתוך טבעת ה-O. חזור על הפעולה לקבלת התמיכה הפנימית השנייה בממברנה.
      4. מקם תמיכה פנימית אחת בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה. מניחים קרום פוליקרבונט אחד של 100 ננומטר על התמיכה הפנימית בממברנה, ישירות מעל התמיכה במסנן.
        הערה: ממברנות פוליקרבונט מאוחסנות בנפרד בין חתיכות נייר בצבע כחול. הסר את נייר ההפרדה לפני החדרה על התמיכה בממברנה.
      5. מקם את התמיכה הפנימית השנייה בממברנה לתוך המארז החיצוני של המבליט עם טבעת O וצד התמיכה בסינון מול קרום הפוליקרבונט. חבר את נושאת ה- PTFE לאגוז שכר הטרחה וסגור עם המארז החיצוני של המכבש. חותכים את המהלל לבלוק החימום.
      6. לטעון את ההשעיה השומנים לתוך אחד המזרקים למקם את המזרק לתוך בלוק חום extruder, החדרת המחט באופן מלא לתוך קצה אחד של המכבש. הכנס את המזרק השני, הריק לצד הנגדי ונעל את שני המזרקים באמצעות מהדקי הזרוע על בלוק החום.
        הערה: במידת הצורך, מניחים את בלוק החום של המכבש על צלחת חמה ומגדירים את הטמפרטורה לערך מעל טמפרטורת המעבר של השומנים. הכנס מדחום לתוך המחזיק המובנה לתוך בלוק החום לקריאות טמפרטורה מדויקות ולחכות עד הטמפרטורה הנדרשת הגיע (~ 15 דקות). של שלל שומנים PC ביצה אינם דורשים חום במהלך שחול.
      7. לאט לאט לדחוף את ההשעיה הזרקית לתוך המזרק הריק, ולאחר מכן בחזרה למזרק המקורי. נטר לשינויי לחץ לאורך כל ההבלטה המצביעים על דליפה. חזור על 20 פעמים נוספות עבור סך של 21 עובר דרך קרום פוליקרבונט. מעבירים את שלל השומנים ל בקבוקון זכוכית נקי לאחסון.
        הערה: מספר שחול ניתן למטב בהתאם להרכב השומנים.
      8. אם נעשה שימוש בחום, אפשר השעיית ארסיה בולטת כדי להגיע לטמפרטורת החדר. יש לאחסן את שלל השומנים המובלטים ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
        הערה: משך אחסון הלסייה המומלץ תלוי מאוד בהרכב השומנים, ויש לעקוב אחר המאפיינים הפיזיקוכימיים הארסיים (למשל, קוטר הידרודינמי, פוטנציאל זטה) לאורך זמן. לדוגמה, שלל מחשב ביצה אוחסנו לפחות שבועיים ללא שינוי בגודל ארסיה או קיבולת היווצרות bilayer.
    2. תהליך מחול גדול (5-50 מ"ל)
      הערה: בצע את השלבים 1.2.2.1-1.2.2.5 אם יש צורך בחום עבור השומנים שנבחרו. דלג לשלב 1.2.2.5 אם אין צורך בחום. שלבים 1.2.2.1-1.2.2.4 אינם נדרשים עבור מחשב ביצה.
      1. מלא בקבוקון 1 L עם מים אוסמוזה הפוכה (RO).
        הערה: אין להשתמש במים אולטרה-סברים כדי להסתובב במערכת 50 מ"ל מכיוון שהם עלולים לגרום ליוני מתכת לחלץ מהגליל של האסטרונדר.
      2. מניחים את בקבוקון 1 L באמבט מים על צלחת חמה ומניחים את הצלחת החמה לטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר של השומנים.
      3. חבר את גליל הדגימה לבקבוקון עם צינורות גמישים דרך המפרצון על גליל המדגם. חבר צינורות על שקע הגליל לחלק העליון של בקבוקון 1 L. צינורות מאובטחים הן בפרצון והן בשקע, לפי הצורך. זה ייצור זרימה חד כיוונית של המים דרך גליל המדגם.
      4. הפעל את המשאבה כדי להתחיל זרימת מים. אם יש צורך בחום, אפשרו כ-30-45 דקות עד שגליל מדגם יגיע לטמפרטורה הרצויה.
      5. חבר את המכסה של גליל המדגם למיכל חנקן באמצעות המחבר הגמיש המחובר ליחידת שסתום הקלה בלחץ.
      6. נקה את כל חלקי המהלל 50 מ"ל עם 70% (v/v) אתנול.
      7. להרכיב את המהוצץ על ידי הצבת התמיכה במסך החור הגדול, דיסק sintered, דיסקי ניקוז, וקרום פוליקרבונט לתוך החלל בתמיכה התחתונה extruder. חבר את התמיכה העליונה והתחתון באמצעות ארבעת הברגים והידוק.
      8. חבר את יחידת המכבש לצילינדר המדגם על ידי הברגה לתחתית והידוק עם מפתח ברגים כדי לאבטח.
        הערה: אם משתמשים בחום, מניחים מדחום לתוך הגליל וממתינים עד שהמים יגיעו לטמפרטורה הרצויה לפני שתמשיכו. זה יבטיח כי טמפרטורת המדגם נשמרת לאורך כל תהליך שחול.
      9. מלאו את גליל הדגימה במים אולטרה-תותים. יש לתבל את המים דרך יחידת המהלוה לפני הוספת הדגימה לצילינדר המדגם. זה נעשה כדי להרטיב מראש את הממברנות, בדומה להוונדר המיני.
        הערה: ודאו שהמכסה מוברג במלואו ושסתום ההקלה בלחץ סגור לחלוטין לפני הפעלת החנקן. לחץ מינימלי נדרש עבור שלב זה (~ 5-10 פסאיי).
      10. מוסיפים את מתלה השומנים לצילינדר המדגם ומברגים את החלק העליון סגור. לאט להגביר את הלחץ עד המדגם מתחיל לטפטף מיחידת extruder בקצב של כ 2-3 טיפות / s לתוך בקבוקון זכוכית נקי.
        הערה: אל תגביר את הלחץ במהירות בשלב זה, שכן לחץ רב מדי עלול להשפיע לרעה על הממברנות ולהוביל להבלטה לא מוצלחת.
      11. לאחר כל המדגם כבר extruded, לכבות את אספקת N 2 ולשחרר אתהלחץ בצילינדר המדגם על ידי פתיחת שסתום הקלה בלחץ לאט. יוצקים את שלטי השומנים בחזרה לתוך גליל המדגם ולחזור על שלב 1.2.2.11, 9 פעמים נוספות עבור סך של 10 שחול.
        הערה: הלחץ הנדרש עבור שחול עשוי להקטין עם מספר גדל והולך של שחול, כמו המדגם הופך הומוגני יותר קרוב יותר בגודלו לגודל נקבובית קרום פוליקרבונט.
      12. יש לאחסן השעיית ארסיית שומנים מובלטת ב-4 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.

2. אפיון שלשלות שומנים

  1. מדידת קוטר הידרודינמי באמצעות פיזור אור דינמי (DLS)
    1. שלשולי שומנים מערבולת ופיפטה 50 μL של השעיית מצע השומנים לתוך cuvette בנפח נמוך חד פעמי. לכסות כדי למנוע זיהום עם אבק ופסולת.
    2. טען את ההשעיה ההזנה למכשיר DLS, הזן את פרטי המדגם ובצע את המדידה באמצעות התוכנה המשויכת.
  2. פוטנציאל זטה
    1. הכן תא זטה נימי מקופל על ידי כביסה עם מים אולטרה-סבר, 70% אתנול ומים אולטרה-סבר באמצעות מזרקים המתחברים לכניסות של התא. לדחוף בעדינות את הנוזל דרך התא 3-4 פעמים ולרוקן את התא לחלוטין לפני המעבר לפתרון הבא.
    2. מערבולת שלשלות השומנים ולהכין 1:10 (v/ v) דילול של שלבי שומנים במים אולטרה-תפומיים.
    3. טען את ההשעיה השומנים מדולל. הסר בועות אוויר על ידי דחיפת המתלה הלוך ושוב בין המזרקים. חבר את המעצורים לכל מפרצון.
      הערה: חשוב להסיר את כל הבועות, שכן זה ישפיע על המדידה.
    4. מקם את תא הזטה בתא הדגימה, ומבטיח שהאלקטרודות יהיו בקשר. סגור את החלק העליון של תא הדגימה. בתוכנה המשויכת, הזן את הפרטים לדוגמה ואסוף מדידה.

3. יצירת דו-שכבתית שומנים הנתמכת על ידי שומנים חד-שומנים באמצעות QCM-D

  1. הכנות לפתרון
    1. הכן פתרון נתרן דודסיל סולפט (SDS) 2% (w/v) במים אולטרה-פרופים. מערבבים על צלחת ערבוב עד להמסה מלאה. פתרונות עבודה Aliquot של לפחות 10 מ"ל של מים אולטרה-תות, 2% SDS, ו Tris NaCl.
    2. הכן דילול של שלל שומנים במאגר Tris NaCl. ריכוז שלשלות תלוי ביישום. עבור מחשב ביצה, ריכוזים בטווח של 0.01-0.5 מ"ג/מ"ל הוכחו כתוצאה של היווצרות דו-שכבתית נתמכת בהצלחה.
  2. ניקוי חיישני גביש קוורץ מצופים סיליקה
    הערה: ניקוי גבישי QCM-D תלוי בחומר פני השטח של החיישן הנמצא בשימוש. כדי ליצור דו-שכבתיות שומנים נתמכות, גבישי קוורץ מצופים סיליקה משמשים בפרוטוקול זה ומפורטים להלן כמותאמים מהליך ההפעלה הסטנדרטי של היצרן.
    1. הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למודול הזרימה ומבטיח שה-t על הגביש יתיישר עם ה-"t" במודול. בורג מודול הזרימה סגור.
      הערה: אם ה- QCM-D המנוצל מאפשר לחבר ולנהל מודולי זרימה מרובים בו-זמנית, חזור על ההליכים הבאים עבור המודולים הנוספים לפי הצורך.
    2. הכנס את מודול הזרימה לבסיס המכשיר עם האלקטרודות ממודול הזרימה המתחברות למערכת המנתח. נעל את המודול למקומו.
    3. חבר את הצינורות והשקע למודול הזרימה והמשאבה. מניחים את הצינורות לתוך שומרי ההחזקה וסוגרים את המכסה של מערכת המנתח. מניחים מיכל פסולת בשקע המשאבה כדי לאסוף פתרונות שהוצאו.
    4. כדי לבצע את הניקוי, הפעל תחילה את המשאבה. הגדר את מהירות הזרימה ל- 400 μL/min. הכנס את צינורות הכניסה לתוך מים אולטרה-תול וזרם 5-10 מ"ל דרך המודול.
    5. החלף את צינורות הכניסה לתוך 2% SDS ולזרום 5-10 מ"ל דרך המודול. החליפו את הצינורות המכניסים בחזרה למים אולטרה-זורמים וזרמו 10-20 מ"ל דרך המודול. הסר את צינורות המפרצון מהפתרון ולהזרים אוויר דרך הצינורות עד שכל הנוזל נפלט.
      הערה: פרוטוקול הניקוי לעיל משמש מדי יום לפני ואחרי כל מדידה. ניתן לבצע ניקוי יסודי לפי הצורך. בקצרה, כדי לבצע ניקוי יסודי, לפרק את מודולי הזרימה. כל הרכיבים למעט הצד האלקטרודה של מודול הזרימה צריך להיות שקוע 2% (w / v) SDS ו sonicated אמבטיה, ואחריו שטיפה יסודית עם מים אולטרה-ספיר וייבוש עם זרם של גז N2. הרכיב של מודול הזרימה המכיל את סיכות האלקטרודה לעולם לא צריך להיות במגע עם נוזל.
    6. הסר את החיישן ממודול הזרימה ושטוף את החיישן במים אולטרה-תפומיים. יבש את החיישן עם זרם גז N2. יבש את מודול הזרימה עם זרם גז N2. ודא האלקטרודה תמיד להישאר ללא כל נוזל.
    7. במכסה המנוע הכימי אדים, הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למכשיר ניקוי אולטרה סגול (UV)/אוזון. הפעל את המכשיר ולאפשר טיפול לפחות 2 דקות. הסר את החיישנים בזהירות ולחזור למודול הזרימה.
  3. יצירת תוכנית בסיסית של טריס NaCl
    1. הפעל את מכשיר המנתח כדי להתחבר לתוכנה המשויכת והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי עבור דו-שכבתי השומנים הנתמך. אפשר לטמפרטורה להתייצב לקלט הרצוי.
      הערה: אם הטמפרטורה שנקבעה היא מעל טמפרטורת החדר, כל הפתרונות צריכים להיות מחוממים לאותה טמפרטורה באמצעות בלוק חום.
    2. קבע את תצורת המדידה ומצא את כל תדרי התהודה וההתפוגגות של החיישן עבור צלילים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13 לפני תחילת המדידה.
      הערה: ניתן להתעלם מהטון שלרחוב 1 מכיוון שההרמוניה הזו רגישה מדי ומייצרת נתונים רועשים.
    3. הפעל את המשאבה והגדר את קצב הזרימה ל- 175 μL / min או את קצב הזרימה הניסיוני הרצוי.
    4. נגב את הצינורות עם אתנול לפני הכניסה לתוך טריס NaCl. התחל את המדידה ולהתחיל לזרום טריס NaCl.
      הערה: הנתונים נאספים ומנוטרים בזמן אמת. השינוי מאוויר לנוזל במודול הזרימה ייצפה בתוכנת איסוף הנתונים על ידי שינוי פיזור מהיר (ΔD) עלייה ושינוי תדירות (ΔF).
    5. אפשר ל- Tris NaCl לזרום דרך המודול למשך 5-10 דקות, מה שמבטיח שערכי ה- ΔF ו- ΔD הבסיסיים בנוזל יישארו יציבים.
  4. יצירת דו-שכבתית עם שומנים חד-שומנים
    1. עצרו את המשאבה והסירו את צינורות הכניסה מפתרון Tris NaCl והכניסו בזהירות לתמיסת השומנים. זרימה אחורית עבור 5 s כדי להסיר את כל בועות האוויר מן צינורות המפרצון, ולאחר מכן להמשיך זרימה קדימה. הפעל מחדש את המדידה בתוכנה כדי לאפס את קו הבסיס.
      הערה: היזהר כדי למנוע בועות אוויר בצינורות, אשר יכול לזרום דרך המודול ולשבש היווצרות bilayer ואת הקלטת הנתונים.
    2. זרימה של שלבי שומנים עד היווצרות bilayer הוא ציין בזמן אמת בתוכנה לרכישת נתונים (לפחות 8 דקות עבור שלל מחשב ביצה).
    3. חזור על שלב 3.4.1 כדי לשנות את צינורות הכניסה של שלטי השומנים בחזרה למאגר Tris NaCl.
      הערה: אם היישום הרצוי הוא ללמוד אינטראקציות מולקולריות, המשך ישירות לשלב 6.1 מבלי לעצור את זרימת הפתרון או רכישת נתונים. אם היווצרות bilayer היא נקודת הקצה, המשך לשלב 3.4.4.
    4. בתוכנה, הפסק את המדידה ושמור את הקובץ. תעצור את המשאבה.
    5. נקה את מודול הזרימה וחיישן גביש קוורץ מצופה סיליקה בעקבות שלבי הפרוטוקול 3.2.4 ו- 3.2.5.

4. יצירת דו-שכבתית מושעית

הערה: הפרוטוקול ליצירת דו-שכבתי שומנים מושעה מותאם מפרוטוקול חדירות הממברנה המלאכותית המקבילה (PAMPA) המסופק על ידי יצרן צלחת המסנן37.

  1. Solubilize השומנים הרצוי דודקן ב 20 מ"ג / מ"ל (למשל, 1,2-dioleoyl-sn-גליצרי-3-פוספוצולין (DOPC)).
  2. הוסף 5 μL של פתרון השומנים לתא התורם, שהוא דיפלואוריד פוליווינילידן נקבובי (PVDF) 96-היטב צלחת מסנן מרובת מסך (0.45 מיקרומטר נקבוביות גודל).
  3. מיד להטביע את צלחת המסנן לתוך תא הקבלה, שהוא צלחת מקלט תובלה המכיל 300 μL של 1× תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). הוסף 200 μL של 1× PBS לתא התורם.
    הערה: ניתן לכלול פקדים של מסננים עם שומנים בלבד ומסננים לא מטופלים החשופים ל- PBS 1×.
  4. המשך ישירות לסעיף 6.2 כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות עם דו-שכבתי השומנים המושעה. מומלץ להשלים את המחקר בתוך 16 שעות של יצירת bilayer מושעה.

5. פיתוח תאים מרובי שומנים המחקים שלפוחיות ושכבות דו-שכבתיות

  1. מיצוי שומנים מתאי יונקים
    הערה: מיצוי השומנים עוקב אחר גישת בליי-דייר38.
    1. תרבות קו התא הרצוי בהתאם לצורך. לאחר השגת 70-80% מפגש (T75 בקבוקון), לנתק תאים באמצעות חומצה טריפסין-אתילנדיאמיןטרטאצטטטית ב 37 °C (5 דקות).
    2. תאי צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 1 מ"ל של מים אולטרה-תול.
    3. הוסף 3.75 מ"ל של תערובת 1:2 (v/v) של כלורופורם:מתנול להשעיית התא ומערבולת במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1.25 מ"ל של כלורופורם ומערבולת במשך 1 דקות. לבסוף, להוסיף 1.25 מ"ל של מים ומערבולת במשך 1 דקות.
    4. תערובת תאי צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות. לאסוף את השכבה התחתונה של נוזל, אשר מכיל שומנים בשלב האורגני. יבש מתחת לזרם של גז N2.
    5. לכמת את תוכן השומנים באמצעות ספקטרומטריה נוזלית של כרומטוגרפיה-מסה (LC-MS) באמצעות שלב הפוך C18, 3.5 מיקרומטר × עמוד 50 מ"מ.
    6. עבור השלב הנייד, להכין שני פתרונות, הראשון עם 60:40 (v/ v) acetonitrile:מים והשני עם 90:10 (v/ v) isopropanol:acetonitrile. אמוניום formate צריך להתווסף לשני הפתרונות בריכוז סופי של 10 מ"מ. מעל 60 דקות, להגדיל את מעבר הצבע שלב נייד מ 35% (v/ v) של הפתרון השני ל 95% (v/ v).
    7. זהה את השפכים במצב יינון שלילי, עם טרשת נפוצה סריקה מלאה רצופה ו- MS/ MS. לזהות את המינים הפוספוליפידים בודדים מיחסי המסה לטעינה (m/ z). נתח את ספקטרום המסה מפיצול דיסוציאציה המושרה בהתנגשות, באמצעות כלי ניתוח ספקטרומטריית מסה של LIPID MAPS. להשיג כרומטוגרמה יונים שחולצו כדי לשלב את האזור מתחת לעקומה, קביעת השפע של כל מינים שומנים.
    8. בצע את השלבים 5.1.5-5.1.7 עבור תקן שומנים המכיל את מחלקות השומנים העיקריות כדי לקבוע את הרגישים היחסיים של זיהוי עבור כל סוג פוספוליפיד שונה.
  2. פיתוח שלדים מרובי שומנים
    1. בצע את השלבים ב- 1.1.1 כדי להכין פתרונות מלאי שומנים עבור שומנים המייצגים כל רכיב דו-שכבתי הרצוי, כפי שזוהה בשלב 5.1.
    2. בהתבסס על הרכבי השומנים המתקבלים בשלב 5.1, להוסיף את הנפח המתאים של מלאי שומנים / כלורופורם לתוך בקבוקון זכוכית נקי הדרוש לריכוז ארסיות סופית של 2.5 מ"ג / מ"ל. הסר פתרון ייבוש כלורופורם בתפזורת תחת זרם של גז N2.
    3. בצע את השלבים 1.1.2, 1.1.3 ו- 1.2 כדי ליצור שלד רב שומנים. בצע את שלב 2 לאפיון ארסיות.
  3. יצירת דו-שכבתי שומנים הנתמך על ידי שומנים באמצעות QCM-D
    הערה: כמה שלל מרובה שומנים יכול לגרום קרע ארסיות שומנים ספונטני היווצרות bilayer דומה שלל מחשב חד שומנים המוצגים בשלב 3. עם זאת, שלל מרובה שומנים מורכב יותר עשוי לדרוש קלט חיצוני כדי לסייע בקרע ארסית. כאן, פפטיד AH משמש כדי לערער את העלון החיצוני של ההון וכתוצאה מכך היווצרות bilayer. שיטות אחרות להשגת חוסר היציבות וקרע ארסי עשוי להיחשב אם תרצה.
    1. בצע את שלב 3 כדי ליצור את דו-שכבתי השומנים הנתמך מרובה שומנים תוך שימוש בשלל מרובה שומנים שנוצר בשלב 5.2.
    2. אם לא נצפתה קרע ספונטני של שלל לתוך דו-שכבתי, נסה לערער את היציבות באמצעות פפטיד AH. הכן את הפפטיד AH (רצף פפטיד: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Thr−Asp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp

תוצאות

פרוטוקול זה מפרט שיטות ליצירת דו-שכבתיות שומנים נתמכות ומושעות(איור 1). הצעד הראשון ליצירת דו-שכבתי שומני נתמך הוא לפתח שלל שומנים. מחשוף מיני מאפשר כמויות קטנות של שלשולי שומנים להיות מוכן (1 מ"ל או פחות), בעוד המחשוף הגדול מאפשר 5-50 מ"ל של שלשולי שומנים להיות מוכן באצווה אחת. ?...

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר היווצרות שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ו bilayers שומנים מושעה. כאן מוצגים צעדים קריטיים ליצירת כל אחד מהמבנים הללו. בעת יצירת שלל שומנים, חשוב להבלט מעל טמפרטורת המעבר של השומנים39. כאשר מתחת לטמפרטורת המעבר, השומנים נוכחים פיזית בשלב הג'ל המוזמן ש?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס ' 1942418 שהוענק ל- A.S., ומלגת מחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע שהוענקה ל- C.M.B.H., תחת גרנט מס '1644760. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדות הקרן הלאומית למדע. המחברים מודים לד"ר נואל ורה-גונזלס על רכישת נתוני אפיון השומנים. המחברים מודים לפרופסור רוברט הארט (אוניברסיטת בראון) על השימוש בזטסייזר שלו. המחברים מודים למתקן ספקטרומטריית המסה של אוניברסיטת בראון, בפרט, ד"ר טון-לי שן על הסיוע בכימות הרכב השומנים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)Avanti Polar Lipids850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)Avanti Polar Lipids840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)Avanti Polar Lipids850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)Avanti Polar Lipids840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)Avanti Polar Lipids850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))Avanti Polar Lipids890703
3 mL Luer-Loc syringesBD309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber linerDuran Wheaton KimbleW224605
AcetonitrileSigma-Aldrich271004
AlconoxFisher Scientific50-821-781
Ammonium formateMillipore SigmaLSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFireWaters 186002551
ChloroformMillipore SigmaLSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPKSarstedt67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)Millipore Sigma36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore SigmaLSAC472301
EthanolPharmco111000200
Filter supports, 10 mmAvanti Polar Lipids610014Size for mini extruder
Folded capillary zeta cellMalvern PanalyticalDTS1070
IsopropanolSigma-Aldrich190764-4L
KimwipesKimberly Clark34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)Avanti Polar Lipids840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids840051
LiposoFast ® LF-50Avestin, Inc.
MethanolSigma-Aldrich179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating blockAvanti Polar Lipids610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterileMillipore SigmaMAIPS4510for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapureTechAirNI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 umWhatman800309Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 umWhatman110605Size for large extruder
ParafilmBemisPM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10xGenesee Scienfitic25-507XDilute to 1x
Qsoft 401 softwareBiolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense AnalyzerBiolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mLDuran Wheaton Kimble986561
Silicon Dioxide, thin QSensorsBiolin ScientificQSX 303
Sodium chloride (NaCl)Millipore SigmaLSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Fisher ScientificBP166-100
Solvent Safe pipette tipsSigma-AldrichS8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids860061
Trizma baseMillipore SigmaLSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acidCaisson LabsTRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mmWhatman230600Size for large extruder
Zetasizer ZS90Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 softwareMalvern Panalytical

References

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -. P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -. J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a., Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -. P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a. Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved