Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Riepilogo

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Abstract

Le membrane cellulari modello sono un utile strumento di screening con applicazioni che vanno dalla scoperta precoce di farmaci agli studi di tossicità. La membrana cellulare è una barriera protettiva cruciale per tutti i tipi di cellule, separando i componenti cellulari interni dall'ambiente extracellulare. Queste membrane sono composte in gran parte da un doppio strato lipidico, che contiene gruppi di testa idrofili esterni e gruppi di coda idrofobici interni, insieme a varie proteine e colesterolo. La composizione e la struttura dei lipidi stessi svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della funzione biologica, comprese le interazioni tra le cellule e il microambiente cellulare, che può contenere farmaci, tossine biologiche e sostanze tossiche ambientali. In questo studio, vengono descritti metodi per formulare cellule uni-lipidiche e multi-lipidiche supportate e sospese che imitano i doppi strati lipidici. In precedenza, sono stati sviluppati doppi strati lipidici uni-lipidici di fosfatidilcolina (PC) e doppi strati lipidici ispirati al trofoblasto placentare multilipidico per l'uso nella comprensione delle interazioni molecolari. Qui verranno presentati i metodi per ottenere entrambi i tipi di modelli a doppio strato. Per le cellule che imitano i doppi strati multilipidici, la composizione lipidica desiderata viene prima determinata tramite estrazione lipidica da cellule primarie o linee cellulari seguita da cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Utilizzando questa composizione, le vescicole lipidiche vengono fabbricate utilizzando un metodo di idratazione ed estrusione a film sottile e il loro diametro idrodinamico e il potenziale zeta sono caratterizzati. I doppi strati lipidici supportati e sospesi possono quindi essere formati utilizzando la microbilancia di cristallo di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D) e su una membrana porosa per l'uso in un saggio di permeabilità della membrana artificiale parallela (PAMPA), rispettivamente. I risultati rappresentativi evidenziano la riproducibilità e la versatilità dei modelli lipidici a doppio strato di membrana cellulare in vitro. I metodi presentati possono aiutare nella valutazione rapida e facile dei meccanismi di interazione, come la permeazione, l'adsorbimento e l'incorporamento, di varie molecole e macromolecole con una membrana cellulare, aiutando nello screening dei farmaci candidati e nella previsione della potenziale tossicità cellulare.

Introduzione

La membrana cellulare, composta principalmente da fosfolipidi, colesterolo e proteine, è un componente cruciale di tutte le cellule viventi¹. Con l'organizzazione guidata dall'anfifilicità lipidica, la membrana cellulare funziona come una barriera protettiva e regola il modo in cui la cellula interagisce con l'ambiente circostante². Diversi processi cellulari dipendono dalla composizione lipidica e proteica della membrana^1,2. Ad esempio, le interazioni della membrana cellulare sono importanti per un'efficace somministrazione di farmaci³. P....

Protocollo

1. Sviluppo di vescicole uni-lipidiche

1. Metodo di idratazione a film sottile
   1. Preparazione e conservazione di soluzioni lipidiche
      NOTA: Tutti i passaggi che utilizzano il cloroformio devono essere eseguiti in una cappa aspirante chimica. Il cloroformio deve sempre essere pipettato utilizzando punte per pipette in fibra di carbonio sicure per solventi. Le soluzioni contenenti cloroformio devono essere sempre conservate in flaconcini di vetro.
      1. Preparare una soluzione madre lipidica da 10 mg/mL aggiungendo il volume appropriato di cloroformio nel flaconcino contenente la polvere lipidica e mescolare bene. Ad esempio, aggiungere 20 ml di clorofo....

Risultati

Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi per la formazione di doppi strati lipidici supportati e sospesi (Figura 1). Il primo passo per formare un doppio strato lipidico supportato è quello di sviluppare vescicole lipidiche. Il mini estrusore consente di preparare piccoli volumi di vescicole lipidiche (1 mL o meno), mentre il grande estrusore consente di preparare 5-50 mL di vescicole lipidiche in un unico lotto. Le distribuzioni dimensionali delle vescicole unilipidiche formate dal.......

Discussione

Questo protocollo consente la formazione di vescicole lipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Qui vengono presentati i passaggi critici per formare ciascuna di queste strutture. Quando si formano vescicole lipidiche, è importante estrudere al di sopra della temperatura di transizione del lipide³⁹. Quando è al di sotto della temperatura di transizione, il lipide è fisicamente presente nella sua fase gel ordinata³⁹. In questa fase ordin.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)	Avanti Polar Lipids	850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)	Avanti Polar Lipids	850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))	Avanti Polar Lipids	890703
3 mL Luer-Loc syringes	BD	309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner	Duran Wheaton Kimble	W224605
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Alconox	Fisher Scientific	50-821-781
Ammonium formate	Millipore Sigma	LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire	Waters	186002551
Chloroform	Millipore Sigma	LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK	Sarstedt	67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)	Millipore Sigma	36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	LSAC472301
Ethanol	Pharmco	111000200
Filter supports, 10 mm	Avanti Polar Lipids	610014	Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell	Malvern Panalytical	DTS1070
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764-4L
Kimwipes	Kimberly Clark	34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)	Avanti Polar Lipids	840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051
LiposoFast ® LF-50	Avestin, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block	Avanti Polar Lipids	610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile	Millipore Sigma	MAIPS4510	for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure	TechAir	NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um	Whatman	800309	Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um	Whatman	110605	Size for large extruder
Parafilm	Bemis	PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x	Genesee Scienfitic	25-507X	Dilute to 1x
Qsoft 401 software	Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer	Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL	Duran Wheaton Kimble	986561
Silicon Dioxide, thin QSensors	Biolin Scientific	QSX 303
Sodium chloride (NaCl)	Millipore Sigma	LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-100
Solvent Safe pipette tips	Sigma-Aldrich	S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	860061
Trizma base	Millipore Sigma	LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid	Caisson Labs	TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm	Whatman	230600	Size for large extruder
Zetasizer ZS90	Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software	Malvern Panalytical